范煒 李燁

[摘要]目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，確定復(fù)方黃柏液治療的Ⅲ度燒傷肉芽組織愈合的有效活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和潛在的藥理學(xué)機(jī)制，并進(jìn)行肉芽組織成纖維細(xì)胞的初步驗(yàn)證。方法：從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）檢索復(fù)方黃柏液組成成分連翹、黃柏、金銀花的有效成分和靶點(diǎn)；GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Ⅲ度燒傷”疾病相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)生物信息學(xué)分析，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interaction，PPI）以及基因本體（Gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，獲得了關(guān)鍵的有效成分、核心靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路；Discovery Studio分子對(duì)接分析有效成分化合物與靶蛋白的結(jié)合。0.5%的DMSO溶液處理的成纖維細(xì)胞記為對(duì)照組；槲皮素（40μmol/ml）處理的成纖維細(xì)胞記為槲皮素組。采用CCK8法、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移侵襲；WB試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞p-PI3K、p-Akt蛋白。結(jié)果：共篩選出74個(gè)有效成分，331個(gè)作用靶點(diǎn)，AKT1為潛在的治療靶點(diǎn)，木犀草素、山柰酚、槲皮素、漢黃芩素、丹皮酚為潛在的候選藥物。PI3K-AKT信號(hào)通路可能在復(fù)方黃柏液治療Ⅲ度燒傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用；分子對(duì)接表明槲皮素與AKT1結(jié)合最好。與對(duì)照組相比，槲皮素組成纖維細(xì)胞增殖、遷移侵襲均顯著降低，p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)也顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：復(fù)方黃柏液促進(jìn)Ⅲ度燒傷患者肉芽組織形成的生物活性成分為槲皮素，潛在通路為PI3K-AKT信號(hào)通路，為復(fù)方黃柏液治療Ⅲ度燒傷的研究提供了思路。

[關(guān)鍵詞]復(fù)方黃柏液涂劑；Ⅲ度燒傷；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接；槲皮素；AKT1；PI3K-Akt信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)]R269? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2024）02-0045-06

Study on the Mechanism of Compound Huangbai Liquid Coating to Promote the Formation of Granulation Tissue on Third Degree Burn Wound

FAN Wei1，LI Ye2

（1.Office of the Fifth Hospital of Baoding，Baoding 071000，Hebei，China; 2.Department of Burns and Plastic Surgery，Baoding Fifth Hospital，Baoding 071000，Hebei，China）

Abstract： Objective? Based on network pharmacology and molecular docking method， the effective active ingredients， key targets and potential pharmacological mechanism of granulation tissue healing of third degree burn treated with compound phellodendron solution were determined， and the preliminary verification of granulation tissue fibroblasts was carried out. Methods? the effective components and targets of honeysuckle， Forsythia suspensa， Coptis chinensis and Phellodendron amurense， which was compound cortex phellodendri solution， retrieved from the public database tcmsp. Genecards and OMIM databases were used to search relevant targets of "third degree burn" diseases. Through bioinformatics analysis， including protein-protein interaction （PPI）， gene ontology （GO） and kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG）， the key effective components， core targets and related signal pathways were obtained. Discovery studio molecular docking analysis of the binding of active ingredient compounds to target proteins. The fibroblasts treated with 0.5% DMSO solution were recorded as control group. Quercetin （40 μ mol/ml） were recorded as quercetin group. CCK8 method and Transwell test were used to detect cell proliferation， migration and invasion. The cell p-PI3K and p-Akt proteins were detected by WB test. Results? A total of 74 active ingredients and 331 action targets were screened. AKT1 was the potential therapeutic target， and luteolin， kaempferol， quercetin， wogonin and paeonol were the potential candidate drugs. PI3K-Akt signaling pathway may play a key role in the treatment of third degree burn with antipyretic and detoxifying compound cortex phellodendri solution. Molecular docking showed that quercetin combined well with AKT1. Compared with the control group， the proliferation， migration and invasion of quercetin fibroblasts were significantly reduced， and the expression of p-PI3K and p-Akt protein were also significantly reduced （P＜0.05）. Conclusion? The bioactive component of compound cortex phellodendri solution in promoting granulation tissue formation in patients with third degree burns is quercetin， and the potential pathway is PI3K-Akt signal pathway， which provides a new method for the treatment of burn with compound phellodendron solution

Key words： Compound cortex phellodendri solution; third degree burn; network pharmacology; molecular docking; quercetin; AKT1; PI3K-Akt signal pathway

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接可以相互補(bǔ)充地用于研究中醫(yī)藥，為活性化合物的篩選和機(jī)制探索提供新見(jiàn)解[1-3]，還能加快中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國(guó)際化進(jìn)程[4-6]。Ⅲ度燒傷患者皮膚全層燒傷，甚至傷及皮下組織及肌肉、骨骼，燒傷面積較大，病理機(jī)制復(fù)雜，其病情復(fù)雜治療難度高、病程長(zhǎng)、并發(fā)癥多，傷殘率和死亡率居高不下[7-11]。由于燒傷的預(yù)后常伴有瘢痕，臨床上療效好的新型護(hù)創(chuàng)、祛瘢產(chǎn)品昂貴、制作材料稀缺，普通患者難以負(fù)擔(dān)[12-13]。清熱解毒中藥材在治療燒傷中的臨床歷史有上千年，復(fù)方黃柏液可用于瘡癰陽(yáng)證[14]，其在燙傷中的臨床效果得到患者的廣泛認(rèn)可，但是其作用機(jī)制研究甚少。本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法探究復(fù)方黃柏液促進(jìn)燒傷肉芽組織愈合的潛在機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 有效成分分析：復(fù)方黃柏液由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英和蜈蚣組成。連翹與黃柏共為君藥，可清熱解毒、散結(jié)排膿，為瘡家之圣藥；臣藥為金銀花，佐藥為蒲公英，可助君藥解毒、排膿，使藥蜈蚣則具有攻毒散結(jié)、退炎治瘡之功?；谥兴幭到y(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索連翹、黃柏、金銀花三味中藥的化學(xué)成分。有效成分的篩選條件為：OB≥30%，DL≥0.18。

1.2 藥物-疾病靶點(diǎn)的篩選：TCMSP平臺(tái)搜索連翹、黃柏、金銀花的作用靶點(diǎn)，提取靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)源代碼，JSON工具轉(zhuǎn)化為表格，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的已驗(yàn)證基因?qū)悬c(diǎn)蛋白全稱轉(zhuǎn)換為基因名的簡(jiǎn)稱。四種中藥的作用靶點(diǎn)經(jīng)過(guò)重復(fù)項(xiàng)的刪除即為藥物靶點(diǎn)。GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索"deep second-degree burn"，收集有關(guān)Ⅲ度燒傷的疾病靶點(diǎn)，刪除重復(fù)項(xiàng)后為疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物-疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系：通過(guò)Venny 2.1繪制連翹、黃柏、金銀花三味中藥的化學(xué)成分韋恩圖，展示四種藥物有效活性成分之間的相互關(guān)系。使用線數(shù)據(jù)庫(kù)STRING分析藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)之間的蛋白相互作用（PPI）關(guān)系。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，CytoNCA插件分析節(jié)點(diǎn)的Degree值，將60以上靶基因作為核心靶點(diǎn)，用于GO/KEGG功能富集分析。Degree值越高，節(jié)點(diǎn)的重要性越大。藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)之間共有的靶點(diǎn)設(shè)為共有靶點(diǎn)，并對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行PPI繪制。篩選核心靶點(diǎn)、共有靶點(diǎn)的Degree值排名均首位的靶點(diǎn)作為分子對(duì)接的蛋白受體。Cytoscape 3.7.1繪制藥物-疾病靶點(diǎn)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.4 GO/KEGG功能分析：使用R語(yǔ)言及相關(guān)安裝包對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO/KEGG分析。具體包括排名前10的生物過(guò)程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組分（Cell Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）展示和排名前20的KEGG通路展示。

1.5 分子對(duì)接：先在PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）搜索受體的蛋白結(jié)構(gòu)式，篩選物種為人的近期得分排名靠前的蛋白，下載PDB格式，作為待用受體。TCMSP下載受體蛋白相關(guān)的活性成分分子結(jié)構(gòu)式的Mol2格式。Discovery Studio 軟件進(jìn)行分子對(duì)接、優(yōu)化。

1.6 難愈性肉芽組織中成纖維細(xì)胞的分離、鑒定及分組：創(chuàng)面的肉芽組織為筆者醫(yī)院外科手術(shù)過(guò)程所取的術(shù)后廢棄組織，然后快速在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移并進(jìn)行成纖維細(xì)胞的分離、鑒定工作。患者知情同意并簽有知情同意書(shū)。將組織用含有雙抗的PBS充分清洗，眼科剪充分剪碎，胰酶消化30 min，過(guò)200目篩。濾液1 000 rpm/min離心5 min，用PBS重懸后分裝置細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)過(guò)夜。48 h更換培養(yǎng)液，傳代常規(guī)培養(yǎng)，使用3～5代的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)的研究。

1.6.1 鑒定：將第三代的肉芽組織成纖維細(xì)胞拍照，觀察形態(tài)。取部分細(xì)胞進(jìn)行波形蛋白的免疫組織化學(xué)染色。具體操作步驟：嚴(yán)格按照上海艾博抗的免疫組化試劑盒和試劑的說(shuō)明書(shū)要求操作。成纖維細(xì)胞爬片后，PBS沖洗，洗去多余的培養(yǎng)液，3%過(guò)氧化氫固定，高溫進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉后進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育，DAB染色，蘇木素復(fù)染，封片。

1.6.2 分組：0.5%的DMSO溶液處理的成纖維細(xì)胞記為對(duì)照組；0.5%DMSO溶解的槲皮素（40μmol/ml）處理的成纖維細(xì)胞設(shè)為槲皮素組。

1.7 肉芽組織成纖維細(xì)胞增殖的檢測(cè)：采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，收集第三代的細(xì)胞接種96孔板，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入CCK8溶液，避光孵育15 min，490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光值。

1.8 肉芽組織成纖維細(xì)胞遷移的檢測(cè)：將第三代成纖維細(xì)胞接種至底部劃線的6孔板，每孔1 ml，垂直底部的線劃線，顯微鏡下觀察，拍照，測(cè)量劃痕寬度（cm）。再用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，觀察拍照，測(cè)量劃痕寬度（cm）。劃痕愈合率（%）=（0 h寬度-24 h寬度）/0 h寬度×100%。

1.9 肉芽組織成纖維細(xì)胞PI3K-AKT信號(hào)通路活性的影響：收集第三代的成纖維細(xì)胞，RIPA冰上裂解，提取總蛋白。對(duì)上清蛋白進(jìn)行定量和變性，取變性后的蛋白上清液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，封閉液對(duì)膜封閉處理。用稀釋過(guò)一抗溶液（1 000倍稀釋的兔抗p-PI3K、p-Akt多抗）孵育4℃過(guò)夜，再用二抗溶液（500倍稀釋的山羊抗兔二抗）37℃孵育2 h，用電化學(xué)發(fā)光法顯色曝光，Image J軟件分析條帶的灰度值。兔抗p-PI3K、p-Akt多抗及山羊抗兔二抗均由上海艾博抗提供。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)學(xué)專用軟件SPSS 26.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 復(fù)方黃柏液組分有效成分的分析：TCMSP得到連翹、黃柏、金銀花的有效成分及OB，DL值，見(jiàn)表1。連翹有效成分22個(gè)，黃柏有效成分37個(gè)，金銀花有效成分23個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后為74個(gè)有效成分。

2.2 復(fù)方黃柏液作用靶點(diǎn)與Ⅲ度燒傷疾病靶點(diǎn)之間的相互作用：連翹1 013個(gè)靶點(diǎn)，去重后258個(gè)，黃柏1 162個(gè)，去重后222個(gè)，金銀花1 347個(gè)靶點(diǎn)，去重后276個(gè)。中藥的靶點(diǎn)756個(gè)，去重后得到331個(gè)藥物靶點(diǎn)，Ⅲ度燒傷疾病靶點(diǎn)1 276個(gè)，刪除重復(fù)后1 120個(gè)。藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的相互作用圖見(jiàn)圖1A，Degree值60以上的90個(gè)核心靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1B，藥物與疾病之間共有靶點(diǎn)155個(gè)及其相互作用圖見(jiàn)圖1C。藥物-疾病相互作用靶點(diǎn)Degree值排名第一的為AKT1，該基因的蛋白作用圖見(jiàn)圖1D。Cytoscape 3.7.1繪制藥物-有效成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)-Ⅲ度燒傷之間的網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)各藥物、有效成分、靶點(diǎn)與Ⅲ度燒傷之間具有相互作用，并且關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。

2.3 復(fù)方黃柏液-Ⅲ度燒傷核心靶點(diǎn)的GO/KEGG富集分析：將復(fù)方黃柏液-Ⅲ度燒傷靶點(diǎn)Degree值超過(guò)60的核心靶點(diǎn)繪制GO功能富集氣泡圖，見(jiàn)圖2。按照生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）三部分各取排名前10的部分展示，其中BP中的功能富集的量及差異相對(duì)最豐富，涉及脂多糖、細(xì)菌及氧化應(yīng)激等生物反應(yīng)。將核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，取排名前20的通路繪制氣泡圖，見(jiàn)圖3，其中PI3K-Akt信號(hào)通路在中藥與疾病之間的富集最豐富。

2.4 AKT1與復(fù)方黃柏液之間的分子對(duì)接結(jié)果：根據(jù)中藥-疾病核心靶點(diǎn)、共有靶點(diǎn)Degree值篩選出AKT1關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT1蛋白3os5作為蛋白受體，木犀草素（MOL000006）、山柰酚（MOL000422）、槲皮素（MOL000098）、漢黃芩素（MOL000173）、丹皮酚（MOL000874）作為小分子配體。其中木犀草素、山柰酚為金銀花、連翹共有的有效成分，槲皮素為連翹、黃柏共有的有效成分。AKT1與配體分子結(jié)合位點(diǎn)的3D圖見(jiàn)圖4，2D分子結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖5，可見(jiàn)結(jié)合分子以精氨酸（Arginine，ARG）、天冬氨酸（Aspartic acid， ASP）為主。分子對(duì)接結(jié)合能結(jié)果顯示，這些成分均可很好地結(jié)合到靶蛋白的活性位點(diǎn)。其中，AKT1與槲皮素的對(duì)接結(jié)合能最低（-5.22 kcal/mol），與漢黃芩素的對(duì)接結(jié)合能最高（-2.31 kcal/mol），平均結(jié)合能為-3.70 kcal/mol。可見(jiàn)，候選化合物與候選靶蛋白之間分子對(duì)接具有特定的結(jié)合活性。見(jiàn)表2。

2.5 肉芽組織成纖維細(xì)胞鑒定：肉芽組織成纖維細(xì)胞顯微鏡下呈梭形規(guī)則排列（見(jiàn)圖6A）；免疫組織化學(xué)檢測(cè)Vimentin蛋白呈棕黃色（見(jiàn)圖6B）。

2.6 槲皮素對(duì)肉芽成纖維細(xì)胞增殖、遷移的影響：與對(duì)照組相比，槲皮素組細(xì)胞24、48、72 h的增殖能力均顯著升高，細(xì)胞劃痕愈合率也顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖7。

2.7 槲皮素對(duì)肉芽成纖維細(xì)胞PI3K-Akt信號(hào)通路活性的影響：與對(duì)照組相比，槲皮素組細(xì)胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖8。

3? 討論

燒傷創(chuàng)面的愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，可能會(huì)導(dǎo)致一些器官系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的缺陷[15]。復(fù)方黃柏液涂劑治療2～3周后，創(chuàng)面愈合明顯優(yōu)于未給藥患者，組織中的生長(zhǎng)因子表達(dá)升高，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡均降低[16]。此外其在臨床上對(duì)四肢Ⅱ度燒傷具有顯著效果，表現(xiàn)為緩解創(chuàng)面周邊的炎癥反應(yīng)、預(yù)防創(chuàng)面的細(xì)菌感染，降低患者的疼痛感，加快創(chuàng)面的愈合[17]。這說(shuō)明金銀花、連翹、黃柏在治療燒傷中確實(shí)具有較好的臨床效果，但是，這些中藥發(fā)揮作用的有效化合物及其與燒傷之間的相關(guān)性尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)滿足OB≥30%，DL≥0.18的金銀花有效化合物23個(gè)，連翹22個(gè)，黃柏37個(gè)，去重后剩余74個(gè)。這說(shuō)明了復(fù)方黃柏液是通過(guò)多個(gè)化合物發(fā)揮燒傷愈合作用的。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這74個(gè)有效成分的作用靶點(diǎn)有331個(gè)，而Ⅲ度燒傷的疾病靶點(diǎn)1 120個(gè)，他們的核心靶點(diǎn)有90個(gè)，共有靶點(diǎn)155個(gè)，其中AKT1是藥物與疾病之間相互作用最緊密的基因。AKT1很可能是復(fù)方黃柏液治療Ⅲ度燒傷的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

為了探究復(fù)方黃柏液治療Ⅲ度燒傷的潛在機(jī)制，進(jìn)行了GO/KEGG富集分析。結(jié)果顯示復(fù)方黃柏液與Ⅲ度燒傷的核心靶點(diǎn)中生物過(guò)程富集最豐富，主要集中在脂多糖、細(xì)菌及氧化應(yīng)激等反應(yīng)，相關(guān)的通路有PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE等多條信號(hào)通路，說(shuō)明了復(fù)方黃柏液是通過(guò)多個(gè)生物過(guò)程、多條通路治療燒傷的，其中PI3K-Akt信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用可能最為重要。

AKT1作為復(fù)方黃柏液治療Ⅲ度燒傷的最具潛力靶基因及作用通路因子，其發(fā)揮作用的潛在分子機(jī)制仍需探究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AKT1與金銀花、連翹的有效成分木犀草素、山柰酚，連翹、黃柏的有效成分槲皮素、漢黃芩素、丹皮酚均存在對(duì)接的氨基酸，主要為精氨酸、天冬氨酸。除此之外，AKT1與清熱解毒中藥有效成分之間的平均結(jié)合能為-2.31 kcal/mol，低于-4.25 kcal/mol，呈現(xiàn)出特定的結(jié)合活性。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了清熱解毒中藥治愈燒傷的分子機(jī)制與AKT1特定結(jié)合精氨酸、天冬氨酸等多種氨基酸有關(guān)。

進(jìn)一步通過(guò)分離、培養(yǎng)肉芽組織成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃柏液主要有效化合物槲皮素對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力的增強(qiáng)具有明顯的促進(jìn)作用，這說(shuō)明槲皮素對(duì)肉芽組織的愈合有刺激作用。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路的活性有抑制作用，說(shuō)明了該通路確實(shí)參與復(fù)方黃柏液治療Ⅲ度燒傷的創(chuàng)面恢復(fù)過(guò)程。

綜上，復(fù)方黃柏液通過(guò)多種有效成分、多種生物、細(xì)胞、分子相關(guān)通路、結(jié)合多種氨基酸發(fā)揮治療Ⅲ度燒傷作用，其中槲皮素功效最大。槲皮素可抑制肉芽組織成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制與失活PI3K-Akt信號(hào)通路有關(guān)，為復(fù)方黃柏液用于臨床治療Ⅲ度燒傷奠定了理論基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2022-10-27

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