劉 建 陳 旭 李新新 鄒文玉 唐國(guó)來 張東鶴 蘇培森 徐瑞斌 葉海龍

（1 上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103；2 上海航育種子有限公司，上海 201100；3 聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東聊城 252000；4 北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究所，北京 100097）

玉米是我國(guó)最重要的農(nóng)作物之一，用途非常廣泛，不僅是深受人民喜愛的口糧作物，而且由于其富含淀粉和脂肪，也是重要的飼料作物[1-2]。同時(shí)，由于玉米的高產(chǎn)和適應(yīng)性強(qiáng)，還是人類在生產(chǎn)中利用最多的谷類作物，加工制成的淀粉以及發(fā)酵成的酒精是醫(yī)藥、化工、能源和紡織等產(chǎn)業(yè)的重要原料[3-4]。目前我國(guó)玉米種植面積和總產(chǎn)已經(jīng)超過了水稻和小麥，成為種植面積和總產(chǎn)最高的農(nóng)作物[3]，因此玉米種植安全是我國(guó)農(nóng)業(yè)和工業(yè)發(fā)展的重要保障。

禾谷鐮刀菌是一種田間危害非常廣泛的真菌病原菌，主要危害玉米、水稻和小麥等多種禾谷類作物，在玉米中會(huì)引起青枯病、莖基腐病和穗粒腐病等多種病害，是玉米中發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重和防治最困難的真菌性病害[5-8]。關(guān)于禾谷鐮刀菌接種方法的研究相對(duì)較少，目前主要是通過菌絲埋根法和牙簽法插入等方法接種，但是往往不能取得較好的接種效果，所以研究玉米禾谷鐮刀菌的接種時(shí)期和接種方法，了解玉米禾谷鐮刀菌的接種規(guī)律，對(duì)于抗禾谷鐮刀菌玉米新品種的培育以及抗禾谷鐮刀菌農(nóng)藥的研制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料禾谷鐮刀菌菌絲和孢子液由上海市農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測(cè)中心繁殖。玉米材料為目前玉米研究應(yīng)用最廣泛的源自美國(guó)的純合自交系B73，該自交系是玉米最早全基因組測(cè)序的品系，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所提供。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)室內(nèi)試驗(yàn)于2023 年5 月在上海市農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測(cè)中心進(jìn)行，大田試驗(yàn)于2023 年5-9 月在上海航育種子基地進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 禾谷鐮刀菌孢子液培養(yǎng)方法取40g 完整綠豆于1L 純凈水中，加熱煮沸10min，無菌棉紡布過濾，取上清液于試劑瓶中得綠豆湯培養(yǎng)液，靜置放涼。取少許新鮮培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌菌絲于綠豆湯培養(yǎng)液中，置于搖床在28℃和220r/min 條件下培養(yǎng)3d。取培養(yǎng)后的禾谷鐮刀菌孢子液進(jìn)行4000r/min離心富集，并在顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)無菌水稀釋后，調(diào)整禾谷鐮刀菌孢子達(dá)到104個(gè)/mL，得到禾谷鐮刀菌孢子接種液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 玉米種植方法全部采用育苗移栽的方式進(jìn)行種植，將B73 玉米種子置于苗床中培養(yǎng)，直至2葉1 心時(shí)，于傍晚進(jìn)行大田移栽。田間小區(qū)種植應(yīng)注意株距和行間距，便于大田接種試驗(yàn)。本試驗(yàn)采用田間小區(qū)行距0.7m，株距0.3m，行長(zhǎng)10m，種植小區(qū)間隔2m，便于接種。每個(gè)處理種植3 個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)移栽25 株，做好玉米防蟲和施肥工作。在傍晚進(jìn)行病菌接種，并在接種后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天進(jìn)行大水漫灌1 次（下雨天除外），接種24d 后，觀察大田玉米發(fā)病情況。

1.3.3 玉米移栽時(shí)間為保證在苗期、拔節(jié)期和抽穗期的玉米接種時(shí)間一致，消除不同時(shí)期天氣對(duì)禾谷鐮刀菌接種效果的影響，本試驗(yàn)首先確定共同接種時(shí)間，通過查閱上海市往年氣象資料，確定7-8 月份平均溫度約為29℃，平均降水量在40mm 以上，適合禾谷鐮刀菌的自然生長(zhǎng)繁殖；其次確定了3 次育苗移栽的時(shí)間，分別是5 月初、6 月初和7 月初，5 月初移栽玉米用于7 月上旬抽穗期玉米接種，6 月初移栽玉米用于7 月上旬拔節(jié)期玉米接種，7 月初移栽玉米用于本月上旬苗期玉米接種。

1.3.4 大田玉米苗期接種方法待玉米生長(zhǎng)至第3片葉完全展開時(shí)進(jìn)行接種。灌根法：用注射器吸取5mL 孢子液，打入根部土壤附近。注射法：用普通醫(yī)用注射器吸取1mL 孢子液，斜向下45°插入玉米中胚軸的中心，然后縮回打出針管內(nèi)玉米組織后，再次沿插入軌跡插入注射。噴霧法：每株用針頭輕微劃傷最幼嫩的葉片，將孢子液噴于受傷葉片表面。

1.3.5 室內(nèi)玉米苗期接種試驗(yàn)每組根據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》在30℃沙培條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至第1 片葉完全長(zhǎng)出時(shí)（播種3d 后）進(jìn)行接種，每組均勻播種25 粒。采用灌根法、注射法和噴霧法3 組接種處理，每組3 個(gè)重復(fù)，接種方法參照大田玉米苗期接種方法。播種10d 后根據(jù)水分情況澆灌稀釋1000 倍的花無缺植物營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)箱設(shè)置濕度100%，接種2 周后，觀察玉米發(fā)病情況。

1.3.6 大田玉米拔節(jié)期接種方法待玉米生長(zhǎng)至第6 片葉完全展開時(shí)進(jìn)行接種。灌根法：用注射器吸取5mL 孢子液，打入根部土壤附近。注射法：用獸用注射器吸取1mL 孢子液，斜向下45°插入玉米莖基部中心，然后縮回打出針管內(nèi)玉米莖稈組織后，再次沿插入軌跡插入注射。噴霧法：每株用針頭輕微劃傷最幼嫩的葉片，將孢子液噴于受傷葉片表面。

1.3.7 大田玉米抽穗期接種方法待玉米生長(zhǎng)至雄穗完全抽出時(shí)進(jìn)行接種。灌根法、注射法及噴霧法操作同拔節(jié)期的接種方法。

1.3.8 玉米禾谷鐮刀菌田間鑒定標(biāo)準(zhǔn)接種24d 后進(jìn)行田間性狀的鑒定，觀察是否有莖部褐色病斑、莖基部是否變軟、是否發(fā)生青枯、是否發(fā)生倒伏來作為田間判定玉米禾谷鐮刀菌發(fā)病情況的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析主要采用SPSS 22.0 和Microsoft Excel 2003 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷鐮刀菌的鑒定為了確定所接種的真菌類型為禾谷鐮刀菌，本研究進(jìn)行了禾谷鐮刀菌的形態(tài)學(xué)鑒定。首先通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）接種禾谷鐮刀菌，3d 后正面可以看到氣生菌絲呈白色至淺黃色的絮狀物鋪滿整個(gè)PDA培養(yǎng)基（圖1A），反面呈現(xiàn)淺錦葵紅色（圖1B），符合禾谷鐮刀菌PDA 培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性；其次取禾谷鐮刀菌孢子液進(jìn)行顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大型分生孢子呈典型鐮刀型，孢子有2～7 個(gè)分格，頂細(xì)胞漸細(xì)，腹細(xì)胞平直（圖1C），符合禾谷鐮刀菌孢子典型性狀。綜上，本試驗(yàn)所采用的真菌材料均為禾谷鐮刀菌。

圖1 禾谷鐮刀菌形態(tài)學(xué)鑒定

2.2 大田玉米苗期不同接種方法比較玉米苗期是指從播種發(fā)芽到拔節(jié)期前的生長(zhǎng)期，本研究選擇第3 片葉完全展開時(shí)進(jìn)行接種，一方面是由于移栽后長(zhǎng)出的新葉可以保證玉米幼苗移栽成功，另一方面玉米種子生長(zhǎng)到3 葉期的時(shí)間相對(duì)較短，如果篩選到有效的接種方法，將大大縮短試驗(yàn)時(shí)間。通過灌根法、注射法和噴霧法對(duì)大田內(nèi)玉米幼苗進(jìn)行禾谷鐮刀菌的接種，24d 后對(duì)玉米植株進(jìn)行莖部褐色病斑、莖基部是否變軟、青枯和倒伏情況的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)3 種接種方法玉米發(fā)病率均較低，平均發(fā)病率低于6%，且沒有明顯差異（圖2），表明玉米苗期可能不適合禾谷鐮刀菌的接種。

圖2 大田玉米苗期不同接種方法發(fā)病率比較

2.3 室內(nèi)玉米苗期不同接種方法比較以上研究表明大田條件下苗期玉米接種發(fā)病效果較差，但是大田苗期玉米的接種可能容易受到紫外線、溫度或濕度等自然條件的影響，為了更準(zhǔn)確地排除外在條件的影響，采取了培養(yǎng)箱種植接種的方法進(jìn)行鑒定，但是由于受到培養(yǎng)箱玉米生長(zhǎng)條件的限制，只采取了苗期玉米培養(yǎng)箱接種鑒定的方法，并且在第1 片葉完全展開時(shí)進(jìn)行了禾谷鐮刀菌的接種。研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)玉米苗期接種禾谷鐮刀菌的發(fā)病率仍然較低，發(fā)病率均低于6%，并且3 種禾谷鐮刀菌接種方法均沒有差異（圖3），這說明在本試驗(yàn)確定的研究方法中，玉米苗期可能不適合禾谷鐮刀菌的接種鑒定。

圖3 室內(nèi)玉米苗期不同接種方法發(fā)病率比較

2.4 大田玉米拔節(jié)期不同接種方法比較玉米拔節(jié)期是指玉米從第6 片葉完全展開到第11 片葉完全展開的階段，是玉米幼穗生長(zhǎng)最旺盛的時(shí)期。本研究以玉米第6 片葉完全展開時(shí)通過注射法、噴霧法和灌根法對(duì)玉米幼苗進(jìn)行禾谷鐮刀菌的接種，24d 后對(duì)玉米植株進(jìn)行莖部褐色病斑、莖基部發(fā)病情況、青枯和倒伏情況的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)3 種方法接種效果差異顯著，注射法顯著高于灌根法，灌根法顯著高于噴霧法。值得注意的是噴霧法和灌根法接種后的發(fā)病率較低，玉米發(fā)病率低于15%，注射法接種后玉米的發(fā)病率在25%左右，相對(duì)于灌根法和噴霧法的接種效果有一定程度的提高（圖4），表明如果要縮短試驗(yàn)時(shí)間可以考慮在拔節(jié)初期采用注射法對(duì)玉米進(jìn)行禾谷鐮刀菌接種。

圖4 玉米拔節(jié)期不同接種方法發(fā)病率比較

2.5 玉米抽穗期不同接種方法比較玉米抽穗期是指雄穗完全抽出的時(shí)期，是決定玉米產(chǎn)量的關(guān)鍵時(shí)期。本研究以玉米雄穗剛好完全抽出時(shí)進(jìn)行接種，24d 后通過對(duì)玉米發(fā)病情況的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)注射法的接種效果顯著高于噴霧法和灌根法，玉米的田間發(fā)病率接近50%，接種效果較好。噴霧法和灌根法接種后發(fā)病率較低，玉米的田間發(fā)病率低于15%（圖5），表明在抽穗期采用注射法對(duì)玉米進(jìn)行禾谷鐮刀菌的接種效果較好。

圖5 玉米抽穗期不同接種方法發(fā)病率比較

2.6 玉米拔節(jié)期和抽穗期采用注射法接種禾谷鐮刀菌的田間性狀比較上述研究表明，在拔節(jié)期和抽穗期對(duì)玉米采用注射法接種禾谷鐮刀菌田間發(fā)病效果相對(duì)較好，所以本試驗(yàn)對(duì)其田間發(fā)病的性狀進(jìn)行了具體的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)玉米抽穗期的田間接種效果明顯好于拔節(jié)期（圖6）。在拔節(jié)期進(jìn)行注射接種玉米禾谷鐮刀菌后，超過20%的玉米植株莖部出現(xiàn)褐色病斑且莖基部變軟，約10%的玉米植株出現(xiàn)青枯和倒伏；在抽穗期進(jìn)行注射接種玉米禾谷鐮刀菌后，超過40%的玉米植株發(fā)生莖部病斑且莖基部變軟，超過20%的玉米植株發(fā)生了青枯和倒伏（圖6）。結(jié)果表明，玉米抽穗期通過莖基部注射禾谷鐮刀菌孢子的方法各個(gè)指標(biāo)均優(yōu)于拔節(jié)期接種，是更適合玉米田間接種禾谷鐮刀菌的方法。

圖6 拔節(jié)期和抽穗期玉米注射法接種禾谷鐮刀菌的田間性狀比較

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)表明抽穗期玉米禾谷鐮刀菌接種的效果優(yōu)于拔節(jié)期、拔節(jié)期的接種效果優(yōu)于苗期，和前人的研究結(jié)果類似[9]。這可能與禾谷鐮刀菌的繁殖條件有關(guān)，禾谷鐮刀菌作為一種真菌更適合生長(zhǎng)在富含糖類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的條件下，玉米苗期和拔節(jié)期糖類等有機(jī)物合成相對(duì)較少，抽穗期及后期玉米屬于生殖生長(zhǎng)，其莖稈含有大量可溶性糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于籽粒的生長(zhǎng)，所以玉米在抽穗期后可能更容易被禾谷鐮刀菌侵染，本研究關(guān)于室內(nèi)苗期接種的數(shù)據(jù)也支持這一結(jié)果。但是目前關(guān)于禾谷鐮刀菌侵染玉米的生理機(jī)制研究還較少，并且玉米生長(zhǎng)前期接種禾谷鐮刀菌不容易發(fā)病的詳細(xì)機(jī)制也有待進(jìn)一步的研究。在玉米拔節(jié)期和抽穗期通過注射禾谷鐮刀菌孢子液的染病效果要顯著優(yōu)于其他方法，這可能與禾谷鐮刀孢子入侵植物時(shí)需要傷口以及需要長(zhǎng)時(shí)間保持較高濃度和活性有關(guān)。在大田進(jìn)行禾谷鐮刀菌孢子的接種容易受到干旱、紫外線和溫度的影響，但是通過將禾谷鐮刀菌注射到玉米莖內(nèi)，能較長(zhǎng)時(shí)間地保持濕潤(rùn)的入侵環(huán)境，且能較少受到其他不利因素的影響，有利于玉米植株感染禾谷鐮刀菌。所以，通過在玉米抽穗期進(jìn)行莖基部注射禾谷鐮刀菌孢子的接種方法可能更有利于玉米發(fā)病。

近年來，我國(guó)玉米主要采用秸稈還田、密植栽培和綠色農(nóng)藥防治等方式進(jìn)行種植，秸稈還田大大增加了土壤病原菌的基數(shù)，特別是在小麥、水稻和玉米等禾谷類作物上都可繁殖的病菌，其還田秸稈成為了自然培養(yǎng)基，玉米再種植后極易染病。密植栽培又增加了病原菌在不同玉米植株之間傳播的速度。目前登記的在玉米上可以防治禾谷鐮刀菌的綠色農(nóng)藥非常少，且防治效果較差，造成玉米莖基腐病和穗腐病等土傳病害逐年加重。玉米禾谷鐮刀菌接種試驗(yàn)周期一般較長(zhǎng)，發(fā)病率容易受溫度、濕度和光照等自然條件影響，目前關(guān)于玉米抗禾谷鐮刀菌生理及分子機(jī)理的研究相對(duì)較少。如果能從本研究確定的接種方法結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析或數(shù)量基因定位等生物信息學(xué)方法挖掘出玉米相關(guān)抗病基因，對(duì)于篩選抗病種質(zhì)資源以及玉米抗禾谷鐮刀菌基因的快速鑒定將具有重要的意義。