張 霞, 王 慧, 張人俊, 劉顯明, 張中義, 劉妍罕, 楊 穎, 溫貴蘭, 文 明

(1. 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州 貴陽(yáng) 550008;2. 威寧自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州 威寧 553100;3. 羅甸縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心,貴州 羅甸 550100;4. 貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所,貴州 貴陽(yáng) 550025)

貴州省是我國(guó)生態(tài)環(huán)境較好的省份之一,林下生態(tài)家禽養(yǎng)殖是全省畜牧產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向。林下生態(tài)養(yǎng)殖家禽容易接觸到野生動(dòng)物,而這些野生動(dòng)物是自然界中病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等病原的天然宿主,容易傳染林下養(yǎng)殖的家禽,使家禽感染發(fā)病而造成經(jīng)濟(jì)損失。本研究于2019年9月1日至2022年8月30日在貴州省具有區(qū)域代表性的畢節(jié)市威寧自治縣和黔南自治州羅甸縣開(kāi)展林下生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng)環(huán)境野生動(dòng)物及其腸道微生物群落調(diào)查,以期為林下生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng)的疫病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品

野生動(dòng)物采自威寧自治縣和羅甸縣2個(gè)具有區(qū)域代表性的生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng)周?chē)h(huán)境,采用頸椎錯(cuò)位法處死后采集腸道樣品,于8 ℃左右保溫箱中保存并及時(shí)送至貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所,置于 -83 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、SanPrep-DNA凝膠提取試劑盒、QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit、QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase Kit、Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(96 Samples),均購(gòu)自Sangon Biotech公司。

1.3 主要儀器

臺(tái)式高速離心機(jī)(型號(hào):Centrifuge 5418R,德國(guó)Eppendorf公司)、PCR儀(型號(hào):MyCycler,美國(guó)Bio-Rad公司)、QIAxtractor(型號(hào):SN002358,德國(guó)QIAGEN公司)、NanoDrop(型號(hào):L200,美國(guó)Thermo Fisher公司)、Bioanalyzer(型號(hào):L2100,美國(guó)Aglient公司)、酶標(biāo)檢測(cè)儀(型號(hào):Epoch,美國(guó)BioTeK公司)、Illumina PE 150測(cè)序平臺(tái)(型號(hào):Miniseq,美國(guó)Illumina公司)。

1.4 野生動(dòng)物種類(lèi)調(diào)查

1.4.1 鳥(niǎo)類(lèi)調(diào)查

根據(jù)養(yǎng)雞場(chǎng)周?chē)h(huán)境情況和鳥(niǎo)類(lèi)生活習(xí)性,采用樣線法和網(wǎng)捕法相結(jié)合,每個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)選擇2條樣線,每條樣線長(zhǎng)約3 km,每條樣線每季度觀察1次和設(shè)立網(wǎng)捕1次,調(diào)查期1年。觀察時(shí)選擇晴朗天氣,時(shí)間分別為7:00～10:00、15:00～17:00,使用Bushnell 8×42倍望遠(yuǎn)鏡和Cannon數(shù)碼照相機(jī)以約1.0 km/h 速度沿樣線活動(dòng),觀察和拍照樣線兩側(cè)50 m 內(nèi)的鳥(niǎo)類(lèi)。網(wǎng)捕時(shí)選擇大小10 m×2.6 m、網(wǎng)孔2 cm的霧網(wǎng),每個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)設(shè)置22張霧網(wǎng),各季節(jié)位置相對(duì)固定,張網(wǎng)時(shí)網(wǎng)長(zhǎng)軸方向隨地勢(shì)而定,網(wǎng)面與地面垂直,網(wǎng)下緣與地面距離不超過(guò)10 cm,每個(gè)季節(jié)張網(wǎng)5 d,每天早、晚各觀察1次,收集捕獲鳥(niǎo)。健康鳥(niǎo)采集泄殖腔樣品并記錄相關(guān)信息后放飛,瀕死或死亡鳥(niǎo)鑒定其種類(lèi)并收集其腸道內(nèi)容物于 -83 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹1]。

1.4.2 鼠類(lèi)調(diào)查

在養(yǎng)雞場(chǎng)周?chē)h(huán)境1 km范圍內(nèi),采用夾板法(7 cm×17 cm木夾板),每30 m2左右設(shè)置1個(gè)木板夾?；ㄉ鬃稣T餌,晚放早收。每季度調(diào)查1次,每次調(diào)查5 d,調(diào)查期1年。對(duì)捕獲的鼠類(lèi)標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)和屬種鑒定,并收集其腸道內(nèi)容物于 -83 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 兔類(lèi)調(diào)查

以養(yǎng)雞場(chǎng)為中心,向東西南北4個(gè)方向設(shè)置調(diào)查樣帶,沿樣帶兩側(cè)仔細(xì)搜索和觀察兔類(lèi)的足跡、糞便、啃食痕跡、洞穴等情況,采用籠網(wǎng)法捕獲野兔。每季度調(diào)查1次,每次5 d,調(diào)查期1年。對(duì)捕捉的野兔進(jìn)行種類(lèi)鑒定后處死并收集腸道內(nèi)容物于-83 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 野生動(dòng)物腸道細(xì)菌群落調(diào)查

采用16S rRNA基因測(cè)序方法[2]:取保存的野鳥(niǎo)、野鼠、野兔腸道內(nèi)容物樣品,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA,以通用引物(343F-5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’;798R-5’-AGGGTATCTAATCCT-3’)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA,SanPrep-DNA凝膠提取試劑盒分離純化并測(cè)定含量后,以TruSeq DNA試劑盒制備測(cè)序文庫(kù),送至Illumina公司使用Illumina Miseq測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序,使用Uparse(7.0.1090)軟件分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

1.6 野生動(dòng)物腸道病毒群落調(diào)查

采用病毒宏基因組學(xué)方法[3]:取保存的野鳥(niǎo)、野鼠、野兔腸道內(nèi)容物樣品,分別加入de DPBS 500 mL,反復(fù)劇烈振蕩3次后低溫超速離心(3 000 r/min,10 min),收集上清液,核酸酶充分消化后,用QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit提取病毒核酸,再用SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(96 Samples)構(gòu)建cDNA文庫(kù),再進(jìn)行cDNA文庫(kù)擴(kuò)增、純化和文庫(kù)片段篩選,取符合條件的樣品送至 Illumina 公司進(jìn)行高通量測(cè)序,使用Ventoy軟件(v1.0.94)進(jìn)行解讀和數(shù)據(jù)處理,分析腸道病毒群落結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生動(dòng)物種類(lèi)

2個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)環(huán)境觀察或捕捉的野生動(dòng)物包括鳥(niǎo)類(lèi)、鼠類(lèi)、兔類(lèi)共計(jì)1 778只(見(jiàn)表1)。其中:鳥(niǎo)類(lèi)1 388 只,隸屬1目6科,包括雀形目雀科1個(gè)種63只、梅花雀科1個(gè)種237只、畫(huà)眉科3個(gè)種824只、鵯科2個(gè)種152只、鴉雀科1個(gè)種39只、鶇科1個(gè)種73只;鼠類(lèi)365只,隸屬?lài)X目鼠科;兔類(lèi)25只,隸屬兔形目兔科。優(yōu)勢(shì)野生鳥(niǎo)類(lèi)主要是灰眶雀鹛、白腰文鳥(niǎo)、栗耳鳳鹛、紅頭穗鹛,野生鼠類(lèi)主要是黑線姬鼠,野生兔類(lèi)僅發(fā)現(xiàn)華南兔。

2.2 野生動(dòng)物腸道細(xì)菌群落

由表2可見(jiàn):2個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)環(huán)境中的野生動(dòng)物腸道細(xì)菌群落有一定相似性,在門(mén)水平主要是擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形桿菌門(mén),在綱水平主要是擬桿菌綱、梭狀芽孢桿菌綱、γ變形桿菌綱,在目水平主要是擬桿菌目、腸桿菌目、梭菌目,在科水平主要是擬桿菌科、腸桿菌科、毛螺菌科,在屬水平主要是擬桿菌屬、大腸桿菌屬、梭菌屬。這些環(huán)境野生動(dòng)物腸道攜帶的細(xì)菌有可能污染林下生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng),導(dǎo)致雞群感染發(fā)病。

2.3 野生動(dòng)物腸道病毒群落

由表3可見(jiàn):野鳥(niǎo)、野鼠、野兔腸道病毒種類(lèi)均呈多樣性,其中:野鳥(niǎo)腸道病毒群落主要是二順?lè)醋硬《究?、傳染性軟腐病病毒科、?xì)小病毒科等,且存在與其食物習(xí)性有關(guān)的病毒,如魚(yú)皰疹病毒科;野鼠腸道病毒群落主要是細(xì)小病毒科、乳頭瘤病毒科、二順?lè)醋硬《究频?野兔腸道病毒群落主要是二順?lè)醋硬《究?、?xì)小病毒科、乳頭瘤病毒科等。在這些野生動(dòng)物腸道存在能夠感染家禽的多種病毒,如細(xì)小病毒、冠狀病毒、圓環(huán)病毒、皰疹病毒、痘病毒、腺病毒等?？勺鳛榱窒律鷳B(tài)養(yǎng)殖家禽病毒性疾病的重點(diǎn)診斷、預(yù)防和控制對(duì)象。

3 討論

3.1森林植被特征影響野生動(dòng)物種類(lèi)組成與結(jié)構(gòu)特征。良好的森林生態(tài)系統(tǒng)為生活的野生動(dòng)物,如野鳥(niǎo)、野鼠、野兔等提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。本次在林下生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng)周?chē)h(huán)境觀察和捕獲的野生動(dòng)物中以野鳥(niǎo)最多,其中食蟲(chóng)鳥(niǎo)種類(lèi)占捕獲總數(shù)的70%以上。在威寧和羅甸2個(gè)林下生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng)周?chē)l(fā)現(xiàn)花果植物有一定量的分布,但食花果鳥(niǎo)類(lèi)的捕獲率并不高,原因可能與霧網(wǎng)的高度限制了對(duì)林冠層鳥(niǎo)類(lèi)的捕獲有關(guān)。在林下生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng)環(huán)境捕獲的野生鼠類(lèi)中,僅有1目(嚙齒目)1科(鼠科)4種(黑線姬鼠、黃胸鼠、褐家鼠、小家鼠),其中以黑線姬鼠為優(yōu)勢(shì)種,占捕獲總數(shù)的45.88%,其次是黃胸鼠、褐家鼠、小家鼠,分別占24.45%、21.15%、8.79%,可能是由于貴州省氣候條件、地形地貌、植被種類(lèi)、生態(tài)景觀的復(fù)雜多樣性決定。本次捕獲的野生兔類(lèi)只有兔形目兔科華南兔1個(gè)種,捕獲數(shù)量較少,未能體現(xiàn)生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng)周?chē)吧妙?lèi)群落分布特征。

3.2本次調(diào)查發(fā)現(xiàn),野生鳥(niǎo)類(lèi)腸道微生物種類(lèi)繁多,主要包括變形菌、厚壁菌、擬桿菌、放線菌等,對(duì)于寄主鳥(niǎo)類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫、毒素降解和體溫調(diào)節(jié)方面具有重要功能。如:植食性鳥(niǎo)類(lèi)腸道微生物以擬桿菌和厚壁菌為主,同時(shí)常存在一些與免疫和解毒有關(guān)的共生菌。野生鼠類(lèi)和野生兔類(lèi)均屬哺乳動(dòng)物,雖在同一環(huán)境內(nèi),但腸道菌群的組成在門(mén)、屬和OTU(操作分類(lèi)單元)水平均有差異,這可能是由于二者屬于不同物種,且食物結(jié)構(gòu)和生活環(huán)境不同所致:野生鼠類(lèi)主要棲息于地下,以植物根、皮、莖、葉、果實(shí)、種子為食,而野生兔類(lèi)主要棲息在地上,以植物葉莖、花、根、芽為食,較少攝入種子?？梢?jiàn)野生動(dòng)物種類(lèi)、飲食及生活環(huán)境差異可能導(dǎo)致其腸道菌群組成也有差異。

3.3林下生態(tài)養(yǎng)雞場(chǎng)環(huán)境野生動(dòng)物腸道病毒群落也存在不同程度的差異。野生鳥(niǎo)類(lèi)腸道病毒群落主要涉及16科,包括二順?lè)醋硬《究啤魅拘攒浉〔《究?、?xì)小病毒科、未分類(lèi)RNA病毒等;野生鼠類(lèi)腸道病毒群落主要涉及27科,包括細(xì)小病毒科、乳頭瘤病毒科、二順?lè)醋硬《究?、未分?lèi)病毒等;野生兔類(lèi)腸道病毒群落主要涉及19科,包括二順?lè)醋硬《究?、?xì)小病毒科、乳頭瘤病毒科、未分類(lèi)病毒等。野生鳥(niǎo)類(lèi)以無(wú)脊柱動(dòng)物病毒來(lái)源為主,而野生鼠類(lèi)和野生兔類(lèi)以脊柱動(dòng)物病毒來(lái)源為主,推測(cè)這些不同種類(lèi)野生動(dòng)物腸道病毒群落分布與其生活環(huán)境和進(jìn)食習(xí)慣也有密切關(guān)聯(lián),即野生鳥(niǎo)類(lèi)喜群居,在池塘、湖邊以進(jìn)食魚(yú)、蝦、蟹為食,導(dǎo)致腸道病毒群落以水生動(dòng)物病毒為主,而野生鼠類(lèi)和兔類(lèi)在棲息地與其他陸生動(dòng)物存在密切接觸,導(dǎo)致腸道病毒群落以陸生動(dòng)物病毒為主。

4 結(jié)論

本次調(diào)查研究表明,貴州林下生態(tài)養(yǎng)雞環(huán)境的野生動(dòng)物主要是野鳥(niǎo)(灰眶雀鹛、白腰文鳥(niǎo)、栗耳鳳鹛、紅頭穗鹛)、野鼠(黑線姬鼠)、野兔(華南兔);其腸道細(xì)菌群落主要是擬桿菌屬、大腸桿菌屬、梭菌屬,主要病毒群落是細(xì)小病毒科、乳頭瘤病毒科、二順?lè)醋硬《究啤Ｕ{(diào)查結(jié)果可作為貴州林下生態(tài)養(yǎng)雞疫病防控參考依據(jù)。