張旭山, 脫浩亮, 芮 弦, 石正發(fā), 崔慧雅

(中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠,甘肅 蘭州 730040)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病,完整的病毒粒子(146S)是口蹄疫疫苗有效成分的重要組成部分,其含量直接決定疫苗的質(zhì)量[1]。目前中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所出具的獸用生物制品生產(chǎn)與檢驗報告已將146S列為必檢項目,作為評價疫苗質(zhì)量最重要的參數(shù)之一,并逐步替代PD50值檢測,這對實際生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。完整的病毒顆粒是疫苗的主要成分,其完整性對于疫苗效力至關(guān)重要,能夠更好地模擬天然病毒,從而激發(fā)更強的免疫反應(yīng)。實驗研究表明,完整的病毒顆粒能夠更有效地刺激機體產(chǎn)生中和抗體和細胞免疫,從而提高疫苗的保護效果。如果病毒顆粒的完整性受損,其免疫原性將會降低,導(dǎo)致疫苗效力下降。相關(guān)實驗表明,離心濁度和次數(shù)對病毒顆?；厥站哂酗@著影響:在一定范圍內(nèi),隨著離心濁度增加和排渣次數(shù)減少,病毒顆粒的回收率提高。然而過高的離心濁度則會直接影響后續(xù)的滅活和濃縮純化。此外,過度頻繁排渣會造成合格料液及完整病毒顆粒大量浪費,導(dǎo)致回收率下降。在口蹄疫免疫中,能夠刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞的主要是完整病毒顆?？乖?該抗原基本含有口蹄疫病毒所有的中和位點,是口蹄疫病毒主要的有效抗原成分[2]。本試驗通過對離心機設(shè)置不同的離心參數(shù)對口蹄疫病毒有效抗原成分回收率進行檢測,為疫苗生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

口蹄疫(Re-A/WH/09株)病毒液(中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、146S檢測試劑盒(賽諾利康生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器

高速連續(xù)流離心機[型號:BTPX710,阿法拉伐(上海)有限公司]、在線濁度儀[型號:CONTROL 4000,奧普士樂利(中國)有限公司]、便攜式濁度儀(型號:HACH 2100Q,美國哈希公司)、紫外分光光度計(型號:X-6,上海元析儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 離心機完整性測試

在試驗前1天用純化水對離心機水濾器進行30 min沖洗浸潤,然后加壓至0.2 MPa進行氣泡點試驗,檢測合格后連通離心滅活系統(tǒng)進行121 ℃、40 min 高壓滅菌。

1.3.2 排渣時間設(shè)定

將培養(yǎng)的懸浮口蹄疫Re-A/WH/09病毒液用設(shè)定值按固定時間排渣,時間分別設(shè)定為10、15、20、25、30 min進行自動排渣,通過離心相同體積(3 000 L)病毒液,收集離心樣的體積和渣液的體積,計算料液的回收率。

1.3.3 排渣濁度設(shè)定

使用在線濁度儀根據(jù)下游工藝要求的料液濁度進行排渣,濁度分別設(shè)定為30、40、50、60、80 NTU進行排渣,通過離心相同體積(3 000 L)病毒液,收集離心樣的體積和渣液的體積,計算料液的回收率,分析不同濁度對料液的損失情況。

1.3.4 離心回收病毒液

用離心機將病毒液離心結(jié)束后,用滅菌磷酸鹽緩沖液對離心機內(nèi)殘留的病毒液進行循環(huán)回收,將殘留在離心機腔體里的料液置換出來,進一步提高料液有效成分的回收率。

1.3.5 損失料液146S含量測定

實際生產(chǎn)中最常用的146S定量方法主要是蔗糖密度梯度離心法:將病毒樣品置于蔗糖密度梯度儀中離心,在離心力的作用下,樣品中的病毒顆粒沉降到相應(yīng)密度梯度層內(nèi),用紫外分光光度計(259 nm)檢測最高吸收峰(其他級份層上沒有吸收峰),收集146S吸收峰級份,對146S含量進行定量[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 排渣時間

隨著離心時間的增加,料液損失量相應(yīng)降低。離心時間設(shè)定在20 min時料液損失相對較少(見表1)。

2.2 排渣濁度

隨著濁度的增加,料液損失量相應(yīng)降低。濁度設(shè)定在50 NTU時料液損失相對較少(見表2)。

2.3 損失料液的146S含量

用蔗糖密度梯度離心法檢測生產(chǎn)過程中病毒146S的收獲量及離心過程中損失料液的146S含量。D230610號樣品(離心時間20 min、濁度50 NTU)的料液損失量及146S含量相對較少(見表3)。

3 討論

3.1通過對固定時間排渣的統(tǒng)計分析,排渣時間過短、次數(shù)過頻會造成合格料液及其有效成分大量浪費;而排渣時間過長、次數(shù)過少則料液濁度較高,影響料液品質(zhì)。收集離心樣的體積排渣時間為10 min時料液損失量最大,收集到的離心樣體積最小;排渣時間為20 min時收集到的離心樣體積及離心濁度最佳。排渣時間為30 min時料液損失量最小,收集到的離心樣體積最大。排渣時間設(shè)定較長,離心機腔體渣液過多,渣液反流到離心樣里,收集到的離心樣體積增多,但是離心樣的濁度增高,給下游抗原濃縮純化工藝生產(chǎn)增加了處理難度,造成料液有效成分損失和生產(chǎn)成本上升,因此排渣時間設(shè)定為 30 min 不符合生產(chǎn)工藝要求。

3.2通過使用在線濁度儀根據(jù)下游工藝要求的料液濁度進行排渣分析,排渣濁度過小會造成合格料液及其有效成分的大量浪費,排渣濁度過高則直接影響料液品質(zhì)。收集離心樣體積排渣濁度在30 NTU時排渣較頻繁,料液損失最大;排渣濁度在80 NTU時排渣次數(shù)較少,料液損失最小;排渣濁度在50 NTU時排渣次數(shù)及料液品質(zhì)較穩(wěn)定。排渣濁度在30 NTU時收集到的離心樣濁度較低,但由于排渣次數(shù)過于頻繁,病毒液中大量146S在離心排渣過程中隨渣液一同被排出,造成生產(chǎn)成本大幅上升;同時由于離心樣濁度過低,在下游抗原的濃縮純化工藝過程中會降低攔截效率,增加抗原濃縮純化難度,因此排渣濁度設(shè)定為30 NTU 不符合生產(chǎn)工藝要求。

4 結(jié)論

綜合分析比較,在Re-A/WH/09病毒液離心過程中排渣時間設(shè)定為20 min,排渣濁度在50 NTU時得到的離心樣體積及濁度最佳,批間差最小,完整病毒顆粒(146S)的回收率最高,可降低生產(chǎn)成本,為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效的口蹄疫疫苗奠定基礎(chǔ)。