王文濤, 周武軍, 張福平*

(1. 清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,貴州 清鎮(zhèn) 551400;2. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

生肌調(diào)節(jié)因子又稱為生肌決定因子家族,包括4個(gè)成員,分別為:生肌決定因子(MyoD)、肌細(xì)胞生成素(MyoG)、生肌因子5(Myf5)、生肌因子6(Myf6)[1]。其中Myf5基因是在胚胎發(fā)育時(shí)肌細(xì)胞中最早被誘導(dǎo)表達(dá)的因子,決定著肌衛(wèi)星細(xì)胞能否啟動(dòng)具有成肌特性的肌肉干細(xì)胞,Myf5基因的表達(dá)可促進(jìn)動(dòng)物胚胎期肌肉的形成,表現(xiàn)為肌纖維長(zhǎng)度、周徑增加[2,3]。Myf5基因通過(guò)調(diào)控成肌細(xì)胞肌纖維的數(shù)量和大小實(shí)現(xiàn)對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的控制,引起肉量變化[4]。目前,豬、牛、羊的Myf5基因研究較多[5～12],家禽研究較少。研究威寧雞Myf5基因SNPs以及與體重的相關(guān)性,可縮短育種周期,降低育種生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟(jì)效益,對(duì)威寧雞的育種工作有重要意義,同時(shí)也為威寧雞種質(zhì)資源的保護(hù)與開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

同批次初生威寧雛雞100只(雌、雄各50只)由貴州大學(xué)科研雞場(chǎng)提供,在相同環(huán)境條件下標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)至18周齡。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑:血清DNA提取試劑盒(型號(hào):FG0309-A004,北京凡知公司)、DL 2 000 DNA Marker(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。主要儀器信息見表1。

1.3 方法

1.3.1 體重測(cè)定

每2周(初生、2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、10周齡、12周齡、14周齡、16周齡、18周齡)稱量每只雞早飼前空腹體重。

1.3.2 血樣采集

飼喂至18周齡,翅下靜脈采集每只雞的抗凝血2 mL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 DNA 提取

按血清DNA提取試劑盒說(shuō)明書方法提取血液DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 引物設(shè)計(jì)

以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中雞Myf5基因?yàn)閰⒖夹蛄?登錄號(hào)NC052532.1),使用National Center for Biotechnology Information系統(tǒng)設(shè)計(jì)2對(duì)引物(見表2),用于擴(kuò)增Myf5基因多態(tài)位點(diǎn)區(qū)域,引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.5 PCR擴(kuò)增

分別擴(kuò)增2段DNA序列,反應(yīng)體系25 μL:Super PCR Mix 21 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板DNA 2 μL。擴(kuò)增條件:98 ℃預(yù)變性2 min,98 ℃變性10 s,57 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并送擎科生物有限公司測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SHEsis軟件logistics回歸法計(jì)算威寧雞群體Myf5基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率、純合度Ho、雜合度He、有效等位基因數(shù)Ne、多態(tài)性信息含量PIC,用SPSS 21.0軟件卡方檢驗(yàn)法進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、多態(tài)位點(diǎn)配對(duì)連鎖不平衡分析、基因型與周齡體重關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

由圖1可見:Myf5基因片段PCR擴(kuò)增條帶與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1、2:片段1;3:片段2

2.2 Myf5基因SNPs多態(tài)性分析

由表3可見:威寧雞Myf5基因存在3個(gè)SNPs位點(diǎn),均位于第一外顯子。3個(gè)SNPs位點(diǎn)均為錯(cuò)義突變,G.40098586 T>C、G.40098595 T>C 位點(diǎn)的堿基T突變?yōu)镃,導(dǎo)致氨基酸序列中的終止子突變?yōu)榫彼?G.40098901 A>G位點(diǎn)突變導(dǎo)致賴氨酸(AAG)突變?yōu)楣劝彼?GAG)。

2.3 Myf5基因SNPs等位基因分析

由表4可見:Myf5基因SNPs位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率中,G.40098586 T>C位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型TT頻率為0.5,優(yōu)勢(shì)等位基因T頻率為0.692;G.40098595 T>C位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型TT頻率為0.533,優(yōu)勢(shì)等位基因T頻率為0.733;G.40098901 A>G位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型AG頻率為0.467,優(yōu)勢(shì)等位基因G頻率為0.583。3個(gè)突變位點(diǎn)的基因型分布服從Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),均屬于中度多態(tài)。

2.4 SNPs位點(diǎn)基因型與周齡體重關(guān)聯(lián)性分析

由表5、表6、表7可見:G.40098586 T>C位點(diǎn)的3種基因型對(duì)威寧雞周齡體重?zé)o顯著影響(P>0.05)。G.40098595 T>C位點(diǎn)各基因型對(duì)威寧雞2、4、6、8、10、12周齡的體重均有影響。其中CC基因型2、8周齡體重極顯著高于TT型(P<0.01),CC型6、12周齡體重顯著高于TT型(P<0.05),CT型4、10周齡體重顯著高于TT型(P<0.05)。G.40098901 A>G 位點(diǎn)的AG基因型4周齡體重顯著高于GG型(P<0.01)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)威寧雞Myf5基因的3個(gè)突變位點(diǎn),均位于第一外顯子,堿基的突變導(dǎo)致氨基酸序列中的終止子突變?yōu)榫彼?賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?。這與吳淑疆等[11]的研究結(jié)果“Myf5基因的突變會(huì)導(dǎo)致相關(guān)氨基酸的改變”一致?；蛐头治鲲@示,Myf5基因的突變位點(diǎn)對(duì)威寧雞周齡體重有一定的影響,但不同的突變位點(diǎn)對(duì)不同周齡體重的影響不同,這與馬新紅[3]的研究結(jié)果較一致,即Myf5基因?qū)﹄u的早期生長(zhǎng)體重有顯著影響。相關(guān)研究表明,Myf5基因的突變可用作育種標(biāo)記選擇。

4 結(jié)論

威寧雞Myf5基因的3個(gè)突變位點(diǎn)均可引起氨基酸序列改變,突變位點(diǎn)與威寧雞體重顯著相關(guān)(P<0.05),突變位點(diǎn)G.40098595 T>C、G.40098901 A>G可作為威寧雞周齡體重選育的分子標(biāo)記。