王 娟，游金坤，鄧雅元，孫達(dá)鋒，楊璐敏， 華 蓉

（1.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南昆明 650221）

烤煙經(jīng)過(guò)采收、初烤和打葉復(fù)烤后，煙葉的品質(zhì)仍然有不足，還需要經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的醇化過(guò)程使煙氣變得醇和、圓潤(rùn)，滿足卷煙加工的要求[1-2]。在后續(xù)的卷煙生產(chǎn)過(guò)程中為了使卷煙配方配伍性更好，品牌辨識(shí)度更強(qiáng)，加香加料更是一個(gè)不可或缺的環(huán)節(jié)[3-4]。羊肚菌（Morchella esculenta）屬偏低溫喜濕型真菌，具有代謝木質(zhì)素、纖維素的能力[5-6]，而纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是煙草細(xì)胞壁的主要成分，不僅影響煙葉的加工性能和內(nèi)在品質(zhì)；同時(shí)，這些成分受熱裂解時(shí)，還會(huì)釋放低級(jí)醛類、酚類、苯并芘等有害成分[7-9]。李仙等人[10]利用羊肚菌菌絲體為出發(fā)菌株，采用固體渥堆發(fā)酵技術(shù)獲得了羊肚菌發(fā)酵粗多糖并應(yīng)用于卷煙中，結(jié)果表明添加至卷煙及初烤煙后具有醇和煙香、提高舒適性、去除雜氣的效果。這為羊肚菌類型的大型真菌在卷煙中的應(yīng)用探明了前景，未見羊肚菌菌絲體在卷煙中應(yīng)用的其他報(bào)道。因此，通過(guò)加料的方式將羊肚菌菌株液體發(fā)酵提取物應(yīng)用于烤煙的品質(zhì)提升中，可極大豐富大型真菌的工業(yè)應(yīng)用，同時(shí)形成具有卷煙應(yīng)用前途的天然菌類香料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

羊肚菌（Morchella esculenta（L.）Pers.）菌株編號(hào)：Y34#，供試菌株試管菌種收集于野外采集羊肚菌，保存于中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所。

1.1.2 材料、試劑和儀器

供試煙葉：2021 年云南普洱初烤煙葉，（等級(jí)B3F、C3F、X2F），云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司提供；培養(yǎng)基：玉米粉2.5%，酵母膏2%，MgSO40.05%，KH2PO40.1%，（NH4）2SO40.5%，pH 值自然。

試劑：乙醇，鹽酸，無(wú)水硫酸鈉，二氯甲烷，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

儀器：100L 型液體發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生工有限責(zé)任公司產(chǎn)品；SHZ-1 型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪豫華儀器廠產(chǎn)品；BUCHIR-3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI 公司產(chǎn)品；HP6890/5972 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；701-4 型電熱干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)搖床，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，湖北黃石市醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司產(chǎn)品；FL820 型超凈工作臺(tái)，昆明金京田科貿(mào)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羊肚菌菌絲體的收集

采用液體發(fā)酵罐（25 L）發(fā)酵，條件如下：通氣量1∶1（V/V·min），攪拌轉(zhuǎn)速120 r/min，pH 值4，溫度22 ℃，接種量15%，罐壓0.16 MPa。發(fā)酵72 h 后過(guò)濾收集菌絲球，無(wú)菌水洗滌3 次，于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，稱量菌絲體干質(zhì)量。

1.2.2 提取方法

取適量羊肚菌菌絲體于圓底燒瓶中，以原料質(zhì)量5 倍的80%乙醇熱回流提取2 h，過(guò)濾，收集濾液為提取液A；殘?jiān)^續(xù)以原料質(zhì)量8 倍的水熱回流提取3 h，同樣過(guò)濾收集提取液B，殘?jiān)鼦壷?。將提取液B 濃縮成相對(duì)密度為1.275±0.007 的濃縮膏，并以提取液A 回溶，充分?jǐn)嚢韬笥?15 ℃條件下冷凍24 h，冷凍液抽濾處理，濾液繼續(xù)濃縮成相對(duì)密度1.373±0.007 濃縮膏，即得羊肚菌液體發(fā)酵提取物。

1.2.3 羊肚菌液體發(fā)酵提取物在煙葉中的加料試驗(yàn)

按不同用量分別添加到所選擇的普洱系列煙葉煙絲上，將煙絲置于封袋中室溫下放置2 h 后卷制成煙支，同時(shí)將未添加醇化劑的煙絲制成對(duì)照煙支，放入溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度（60±2）%的恒溫恒濕箱內(nèi)平衡48 h，按《卷煙第4 部分：感官技術(shù)要求》（GB 5606.4—2005）[11]規(guī)定的方法進(jìn)行評(píng)吸。

（1）煙葉常規(guī)化學(xué)成分：總氮依據(jù)YC/T 161—2002 檢測(cè)，煙堿依據(jù)YC/T 246—2008 測(cè)定，總糖和還原糖依據(jù)YC/T 159—2002 檢測(cè)，水分依據(jù)GB/T 23357—2009 測(cè)定，pH 值依據(jù)YC/T 222—2007 測(cè)定，氯依據(jù)YC/T 162—2011 檢測(cè)，石油醚提取物依據(jù)YC/T 176—2003 檢測(cè)，總揮發(fā)堿依據(jù)YC/T 35—1996 檢測(cè)。

（2）卷煙主流煙氣成分中粒相物測(cè)定樣品前處理及分析：卷煙樣品于溫度（22±2）℃和相對(duì)濕度（60±5）%的條件下平衡48 h 后，采用標(biāo)準(zhǔn)抽吸條件（根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19609—2004[12]的要求對(duì)卷煙主流煙氣中粒相物進(jìn)行補(bǔ)集）用劍橋?yàn)V片捕集主流煙氣中的粒相物，抽吸完成后，將劍橋?yàn)V片置于50 mL 錐形瓶中，加入10 mL 丙酮，超聲萃取30 min，并加入40 μL 內(nèi)標(biāo)定容至1 mL 進(jìn)行GC/MS 分析。分析條件：進(jìn)樣口溫度240 ℃，載氣為He，流速1 mL/min，GC-MS接口溫度250 ℃，升溫梯度為50 ℃（2 min）→3 ℃/min →160 ℃（1 min）→4 ℃/min →280 ℃（20 min），離子源為EI 源，電子能量70 eV，掃描范圍35～455 amu。

（3）羊肚菌液體發(fā)酵提取物的GC-MS 成分分析：稱取樣品25 g，蒸餾水稀釋至250 g，放入同時(shí)蒸餾萃取裝置一端的500 mL 圓底燒瓶中，用電熱套加熱；裝置的另一端為盛有25 mL 二氯甲烷的100 mL圓底燒瓶，于60 ℃條件下水浴加熱，同時(shí)蒸餾萃取3 h。二氯甲烷萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥，于4 ℃過(guò)夜，過(guò)濾，濾液倒入濃縮瓶中用Vigreux 柱濃縮至約1 mL，濃縮液用于GC-MS 分析。分析條件：色譜柱：HP-5MS 型（60 m×0.132 mm×0.125 μm)；載氣為氦氣，純度為99.999%，流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度240 ℃；分流比10∶1；MSD 傳輸線溫度280 ℃；MS 四極桿溫度150 ℃；離子源溫度250℃；掃描范圍35～450 amu；離子源為EI，電子轟擊能量70 eV；升溫程序：50 ℃為起始溫度（保留1 min），以3 ℃/min 升到180 ℃，再以15 ℃/min 升到250 ℃（保留3 min）。

所得圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（NIST98）檢索，并用內(nèi)標(biāo)校正歸一化法計(jì)算各峰的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌液體發(fā)酵提取物的揮發(fā)性成分分析

利用GC/MS 對(duì)羊肚菌液體發(fā)酵提取物進(jìn)行揮發(fā)性成分分析。

羊肚菌液體發(fā)酵提取物總離子流圖見圖1，羊肚菌液體發(fā)酵提取物的揮發(fā)性成分分析結(jié)果見表1。

表1 羊肚菌液體發(fā)酵提取物的揮發(fā)性成分分析結(jié)果

圖1 羊肚菌液體發(fā)酵提取物總離子流圖

羊肚菌液體發(fā)酵提取物的揮發(fā)性成分中酸類成分占比33.86%，為其主要成分，有機(jī)酸能夠增加煙氣的酸性，提高煙氣濃度并使煙氣醇和、甜潤(rùn)舒適[13-14]。揮發(fā)性成分中苯乙醇（7.61%）、2-5 氫呋喃酮（5.34%）、呋喃-3 -甲醇（3.99%）、亞油酸乙酯（3.74%）、鄰苯二甲酸二丁酯（3.53%）、糠醛（2.78%）、3 -羥基-2 -丁酮（2.21%）、鄰苯二甲酸二異丁酯（2.11%）均是重要的煙草香氣前體物和香氣成分，直接影響烤煙的香氣風(fēng)格、香氣品質(zhì)和香氣量[15-16]，為該提取物應(yīng)用于烤煙加料環(huán)節(jié)、提升煙葉品質(zhì)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 羊肚菌液體發(fā)酵提取物加料效果的評(píng)定

羊肚菌液體發(fā)酵提取物在煙葉加料中的用量試驗(yàn)方案見表2。

表2 羊肚菌液體發(fā)酵提取物在煙葉加料中的用量試驗(yàn)方案

評(píng)吸結(jié)果顯示，添加羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理后的煙葉整體品質(zhì)有明顯提高，整體刺激小，香氣質(zhì)好，雜氣降低，香氣柔綿性較好。其中，上部煙在煙香醇和性、掩蓋雜氣方面效果較明顯；下部煙在掩蓋雜氣方面效果較好；中部煙在增加煙香醇和性方面有效果。

2.3 羊肚菌液體發(fā)酵提取物最大用量的確定

羊肚菌液體發(fā)酵提取物最大用量對(duì)比試驗(yàn)方案見表3。

表3 羊肚菌液體發(fā)酵提取物最大用量對(duì)比試驗(yàn)方案

評(píng)吸結(jié)果顯示，添加0.1%羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理的樣品在掩蓋雜氣、改善煙氣品質(zhì)、協(xié)調(diào)煙氣方面效果較好，而添加量為0.2%的煙葉處理樣品在醇和煙香、降低刺激方面效果較好，綜合評(píng)吸結(jié)果為0.1%＞0.2%＞0.05%＞對(duì)照。

2.4 羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣常規(guī)化學(xué)成分分析

羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣與對(duì)照常規(guī)化學(xué)成分分析見表4。

表4 羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣與對(duì)照常規(guī)化學(xué)成分分析

由表4 可知，經(jīng)過(guò)羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理后的煙葉樣品與對(duì)照相比，在總氮、煙堿、總揮發(fā)堿含量上均較對(duì)照降低，總糖和還原糖則有所提高，也是抽吸品質(zhì)表現(xiàn)為醇和的內(nèi)在化學(xué)成分的體現(xiàn)[17]。

2.5 羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣煙氣成分分析

羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣與對(duì)照煙氣成分分析見表5，羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣與對(duì)照煙氣成分分類見表6。/ μg·支-1

表5 羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣與對(duì)照煙氣成分分析 /μg·支-1

表6 羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣與對(duì)照煙氣成分分類 /μg·支-1

卷煙的獨(dú)特消費(fèi)模式是以煙氣吸食形式體現(xiàn)的，其煙氣成分直接反映了煙葉香吃味質(zhì)量，是煙葉品質(zhì)的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)。從煙氣分析結(jié)果來(lái)看，羊肚菌液體發(fā)酵提取物處理樣與對(duì)照相比在吡啶型生物堿（主要為煙堿）、酸類、醇類、酮類、酯類、酚類的總量上均有降低（平均降低率約30%），使得該處理樣在評(píng)吸上較對(duì)照表現(xiàn)為協(xié)調(diào)煙氣，降低刺激性、降低勁頭的作用。

3 結(jié)論

加料、酶解等生物醇化技術(shù)在煙葉中的應(yīng)用主要是促進(jìn)煙葉大分子化合物的降解、轉(zhuǎn)化及小分子香氣物質(zhì)的合成、積累，進(jìn)而引起卷煙煙氣成分及感官品質(zhì)的變化[18-20]。結(jié)合揮發(fā)性成分分析、用量試驗(yàn)、常規(guī)化學(xué)成分分析、煙氣成分分析及感官評(píng)吸表明，煙葉中加入不同濃度羊肚菌液體發(fā)酵提取物，對(duì)煙葉品質(zhì)有明顯提高，在提升香氣品質(zhì)、協(xié)調(diào)煙氣、降低雜氣和刺激性、降低勁頭、加速煙葉醇化方面效果明顯，且用量較低，可適用于卷煙加料、初烤煙的醇化及煙草薄片涂布料的使用中，符合卷煙的“降焦減害”生產(chǎn)要求。不同用量處理出的煙葉效果上有差異，需要針對(duì)上、中、下部位的煙葉做用量試驗(yàn)優(yōu)化研究，最終挑選出效果較優(yōu)的用量。