范 露，李嬋娟，邱朝坤

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205）

采用鹽腌手段和發(fā)酵技術(shù)保存食物是人類重要的發(fā)明，干腌火腿集2 種技術(shù)于一身，既可以長(zhǎng)期保存肉，也得到了美味的肉制品，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎[1-2]?；鹜鹊娘L(fēng)味主要來源于其漫長(zhǎng)的加工周期內(nèi)，脂肪和蛋白質(zhì)在酶的作用下發(fā)生的水解和氧化等一系列反應(yīng)[3-4]，其中脂質(zhì)的氧化是最重要的形成途徑[5]。

動(dòng)物體內(nèi)的脂肪主要以甘油酯（中性脂）和磷脂兩種形式存在，其水解和氧化是脂類物質(zhì)形成風(fēng)味成分的基礎(chǔ)[6]?；鹜仍诩庸み^程中，脂肪在內(nèi)源酶的作用下產(chǎn)生游離脂肪酸[7]，并進(jìn)一步氧化形成風(fēng)味物質(zhì)，游離脂肪酸的氧化比甘油酯和磷脂更加容易發(fā)生[8]。因此，脂肪的水解對(duì)火腿風(fēng)味的形成發(fā)揮著重要作用。研究表明，組織中影響脂類物質(zhì)水解的酶類主要是脂肪酶和磷脂酶[9]，由于宣恩火腿加工過程中pH 值變化范圍為5.91～6.75[10]，因此主要研究宣恩火腿加工過程中酸性脂肪酶、中性脂肪酶和磷脂酶活力的變化。以期掌握宣恩火腿加工過程中脂肪的變化規(guī)律，可為火腿風(fēng)味形成機(jī)理研究提供支撐，進(jìn)而為宣恩火腿的工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究5 個(gè)階段的樣品分別為原料腿（新鮮腿）、腌制期（腌制1 個(gè)月）、發(fā)酵初期（發(fā)酵1 個(gè)月）、發(fā)酵中期（發(fā)酵4 個(gè)月）和成品腿。肌內(nèi)脂肪指從股二頭肌中提取的脂肪，皮下脂肪指從皮下1 cm 提取的脂肪。

4 -甲基傘形酮油酸酯（≥95%，HPCE）、4 -甲基傘形酮（＞98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；Amberlyst A-26 型陰離子交換樹脂，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司提供；其余試劑為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000C 型氣質(zhì)聯(lián)用儀，Agilent 公司產(chǎn)品；RF-6000 型熒光分光光度計(jì)，Shimadzu 公司產(chǎn)品；T18 型分散機(jī)，IKA 公司產(chǎn)品；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；DF-101S 型磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；Neofuge 18R 型高速冷凍離心機(jī)，Heal Force 公司產(chǎn)品；AL-104 型分析天平、FE20 pH 計(jì)，Metteler toledo 公司產(chǎn)品；UV2000 型紫外分光光度計(jì)，Unico公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪提取

采用氯仿-甲醇溶液提取脂肪，具體試驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[11]。

1.3.2 脂肪的分離

稱取40 g 經(jīng)活化的硅膠（G-100），加入氯仿制成懸浮液，裝入層析柱中。稱取1 g 脂肪用少量氯仿溶解后上柱，依次用氯仿、甲醇洗脫，收集氯仿洗脫液即為甘油酯（含游離脂肪酸），收集甲醇洗脫液即為磷脂，將洗脫液于40 ℃條件下真空濃縮至干，分別得到甘油酯（含游離脂肪酸）和磷脂，用A-26型陰離子交換樹脂將甘油酯（含游離脂肪酸）分離為甘油酯和游離脂肪酸[12]。

1.3.3 脂肪酸組成分析

脂肪酸組成采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，具體試驗(yàn)步驟參照GB 5009.168—2016[13]。

1.3.4 酶液提取與酶活測(cè)定

取5 g 股二頭肌樣品，加入25 mL pH 值7.5 含5 mmol/L EGTA 的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L）。在冰水浴中用均質(zhì)機(jī)以轉(zhuǎn)速25 000 r/min 處理30 s，然后在冰水浴中用磁力攪拌器以轉(zhuǎn)速200 r/min 攪拌30 min，再在4 ℃條件下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心20 min，上清液即為粗酶液。粗酶液蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定。

酸性脂肪酶活性測(cè)定：取0.2 mL 粗酶液，加入2.7 mL pH 值5.0 含0.05%（W/V）Triton X-100 和0.8 mg/mL 牛血清白蛋白的磷酸二氫鈉（0.1 mol/L）-檸檬酸（0.05 mol/L）緩沖液，再加入0.1 mL 4 -甲基傘形酮油酸酯（1 mmol/L）作為底物，將試管置于37 ℃水浴鍋中保溫反應(yīng)45 min，然后加入0.5 mL HCl 溶液（1 mol/L）終止反應(yīng)，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)328 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm。中性脂肪酶活性測(cè)定步驟同酸性脂肪酶，但需將緩沖液pH 值調(diào)整至7.5，且不用添加牛血清蛋白，發(fā)射波長(zhǎng)調(diào)整為443 nm。磷脂酶活性測(cè)定步驟同酸性脂肪酶，但需在緩沖液中加入0.15 mol/L 氟化鈉。分別用各自緩沖液配制系列濃度的4 -甲基傘形酮溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，1 g 酶蛋白在1 h 內(nèi)產(chǎn)生1 nmol 的4 -甲基傘形酮為一個(gè)酶活力單位（U/h·g）[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣恩火腿脂肪組成變化

火腿脂肪主要由甘油酯、磷脂和游離脂肪酸組成，三者含量的變化在火腿加工過程中是動(dòng)態(tài)的，掌握其在不同階段的變化趨勢(shì)，有助于了解脂肪氧化和水解反應(yīng)的劇烈程度。

不同階段肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪組成見表1。

表1 不同階段肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪組成 / %

由表1 可知，隨著加工過程的進(jìn)行，對(duì)于肌內(nèi)脂肪而言，脂肪組成發(fā)生了較為明顯變化，甘油酯比重增加了11.7%，磷脂比重降低了51.6%，游離脂肪酸比重增加了2.6 倍。皮下脂肪甘油酯比重相對(duì)穩(wěn)定，而磷脂比重降低了53.1%，游離脂肪酸比重增加了2.5 倍。肌內(nèi)脂肪游離脂肪酸含量明顯高于皮下脂肪，表明肌內(nèi)脂肪的水解反應(yīng)更活躍，同時(shí)也表明肌肉為火腿的風(fēng)味貢獻(xiàn)比皮下脂肪多。

在宣恩火腿整個(gè)加工階段，磷脂和游離脂肪酸的變化比較明顯，表明甘油酯的降解速度比磷脂的降解速度慢。游離脂肪酸主要來源于甘油酯和磷脂的水解，其含量的迅速上升，為火腿風(fēng)味的形成提供了重要反應(yīng)前體物質(zhì)。

2.2 宣恩火腿游離脂肪酸組成變化

火腿在漫長(zhǎng)的加工周期內(nèi)，脂類發(fā)生著水解、氧化及氧化產(chǎn)物與其他組分進(jìn)一步反應(yīng)等，游離脂肪酸是這些反應(yīng)的產(chǎn)物或中間物質(zhì)[15]。因此，對(duì)火腿游離脂肪酸的脂肪酸組成進(jìn)行分析，有助于研究火腿風(fēng)味形成過程和機(jī)理。

不同階段肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪游離脂肪酸的變化見表2。

表2 不同階段肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪游離脂肪酸的變化 / mg·g-1

由表2 可知，飽和脂肪酸（SFA）和單不飽和脂肪酸（MUFA）隨著加工進(jìn)行，含量均呈上升趨勢(shì)，多不飽和脂肪酸（PUFA）則呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，表明宣恩火腿加工過程中，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的生成速度大于降解速度，而多不飽和脂肪酸在發(fā)酵中期開始其生成速度小于降解速度，產(chǎn)生這種結(jié)果的主要原因是多不飽和脂肪酸比單不飽和脂肪酸更加容易氧化分解。脂肪的氧化是火腿風(fēng)味形成的主要渠道之一，表明從發(fā)酵中期開始，風(fēng)味物質(zhì)開始大量生成。

整體而言，肌內(nèi)脂肪游離脂肪酸總量高于皮下脂肪，表明肌內(nèi)脂肪磷脂和甘油酯的水解程度更劇烈，也表明火腿風(fēng)味成分主要來源于肌肉。對(duì)于肌內(nèi)脂肪而言，其不飽和脂肪酸在發(fā)酵初期含量上升幅度較大，單不飽和脂肪酸是腌制期的2.47 倍，多不飽和脂肪酸是腌制期的2.76 倍。不飽和脂肪酸的氧化既可以產(chǎn)生風(fēng)味成分，也可以為其他呈味反應(yīng)提供前體物質(zhì)，因而進(jìn)一步表明從發(fā)酵初期開始，風(fēng)味成分開始大量生成。

2.3 宣恩火腿脂肪酶和磷脂酶活力變化

火腿加工過程中，脂肪的水解與氧化主要受酶的控制，化學(xué)作用較小[16]。這些酶的活性高低直接影響著脂肪的水解程度，從而進(jìn)一步影響其風(fēng)味成分的產(chǎn)生。

不同階段脂肪酶和磷脂酶活力變化見表3。

表3 不同階段脂肪酶和磷脂酶活力變化 / U（/h·g）-1

由表3 可知，從原料腿到成品，酸性脂肪酶、中性脂肪酶和磷脂酶活力均呈現(xiàn)較大下降趨勢(shì)，酸性脂肪酶活性從4.30 U/h·g 下降到0.32 U/h·g，中性脂肪酶活性從9.81 U/h·g 下降到0.67 U/h·g，磷脂酶活性從6.31 U/h·g 下降到0.35 U/h·g。在火腿的不同加工階段，酶活下降程度也不同，中性脂肪酶和磷脂酶在從腌制期到發(fā)酵初期活性降幅最大，酸性脂肪酶在從原料腿到腌制期活性降幅較大，隨后酶活降幅趨于平緩。成品火腿中脂肪酶和磷脂酶活性處于較低水平，比崔瑩瑩[17]測(cè)定的宣恩火腿酶活低，但比陸瑞琪等人[16]測(cè)定的金華火腿酶活高。

酶活下降受多重因素影響，在腌制期間火腿鹽含量迅速上升，細(xì)胞質(zhì)滲透壓增加，可能導(dǎo)致部分酶變性，活性受損。腌制結(jié)束后火腿會(huì)經(jīng)歷烘腿（溫度50 ℃左右，時(shí)間7～8 d）工藝，在此條件下也可能導(dǎo)致部分酶活受損。發(fā)酵期內(nèi)，火腿pH 值逐步降低，也可能導(dǎo)致磷脂酶和中性脂肪酶活性下降。

3 結(jié)論

通過對(duì)宣恩火腿不同加工階段肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪構(gòu)成測(cè)定，并對(duì)肌內(nèi)和皮下脂肪游離脂肪酸組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，宣恩火腿加工過程中，肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪發(fā)生了較大的變化，甘油酯和磷脂水解生成了游離脂肪酸，游離脂肪酸中飽和脂肪酸和單不飽和脂肪含量上升迅速，多不飽和含量增加程度相對(duì)較低，肌內(nèi)脂肪對(duì)火腿風(fēng)味前體物質(zhì)的貢獻(xiàn)大于皮下脂肪。

對(duì)不同加工階段宣恩火腿脂肪酶和磷脂酶活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明隨著加工的進(jìn)行，脂肪酶和磷脂酶活性不斷減弱，尤其是從腌制期到發(fā)酵初期降幅較為明顯。脂肪酶和磷脂酶活性的高低對(duì)火腿風(fēng)味有重要影響，活性過高，脂肪過度水解，導(dǎo)致產(chǎn)生大量游離脂肪酸，從而進(jìn)一步氧化導(dǎo)致火腿品質(zhì)降低。酶活過低，脂肪水解偏低，能夠反應(yīng)形成風(fēng)味物質(zhì)的底物又不足，火腿風(fēng)味無法形成。通過研究，掌握了宣恩火腿加工過程中，不同階段脂肪酶和磷脂酶活性變化規(guī)律，可為宣恩火腿的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論參考。