程小容, 趙 琳, 王 迪, 王雅婷, 楊雅勻, 古少鵬, 何金鑫*

(1)山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院預防獸醫(yī)系公共衛(wèi)生學實驗室,山西 太谷 030801;2)南江縣農業(yè)農村局,四川 南江 635600)

磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine,SDM)是一種抗菌譜廣的磺胺類藥物,因其在水產和畜牧業(yè)中的過度使用,對食品安全和人類健康構成潛在威脅[1],因此,對其殘留量進行檢測是十分有必要的。目前,我國磺胺類藥物的檢測方法仍是高效液相色譜法,雖然其檢測靈敏度高,但是樣品前處理復雜,利用抗體和磁小體制備免疫磁珠,快速富集樣品中的SDM,對提高SDM的檢測效率具有重要意義。

近年來研究發(fā)現(xiàn),趨磁細菌(magnetotactic bacterium,MTB)體內能夠合成一種稱為磁小體(bacterial magnetic particles,BMPs)的磁性納米顆粒,其粒徑分布范圍窄、磁靶向性低和晶型穩(wěn)定且成分單一[2,3],程等人[4]研究發(fā)現(xiàn),BMPs的性能比常規(guī)磁顆粒優(yōu)良,可作為免疫磁珠的優(yōu)良載體。BMPs表面被一層生物膜包被[5],為其表面功能基團偶聯(lián)提供了大量修飾位點。基于BMPs這一特性,許多研究利用酶、抗體、核酸和多肽等對其進行修飾[6]。例如,He等人[7]將納米抗體(nanobody,Nb)定向固定在BMPs上制備免疫磁珠,用于檢測環(huán)境中的TBBPA。與傳統(tǒng)抗體相比,Nb具有溶解性好、親和力高、穩(wěn)定性強和易表達等優(yōu)點[8,9],Wu等人[10]將噬菌體庫淘選出的抗流感弧菌脂多糖Nb用于合成免疫磁珠,結果發(fā)現(xiàn),免疫磁珠對流感弧菌的富集高達90.7%±3.2%。連接肽(linker)是連接2個或多個蛋白質之間的氨基酸序列,最常用的柔性連接肽是由甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)構成的一類易彎折的氨基酸序列,常見為(G4S)n重復序列[11,12]。連接肽最重要的指標是氨基酸鏈的長度,過長或過短的連接肽均會影響融合物的穩(wěn)定性與活性[13]?；贜b和BMPs研制的免疫磁珠,具有良好的應用前景,然而兩者間的連接肽對免疫磁珠性能的影響尚不清晰。為了探究連接肽長度對免疫磁珠性能的影響,本研究利用基因工程技術,在anti-SDM Nb的C端融合不同長度的連接肽,將其與BMPs進行偶聯(lián),檢測免疫磁珠的性能差異,為今后選擇具有合適長度的連接肽提供理論依據(jù),為SDM的殘留檢測提供物質支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒 大腸桿菌BL21(DE3)和質粒pET28a;質粒pH-17和趨磁細菌(MTB)發(fā)酵產物,分別惠贈于中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院王戰(zhàn)輝老師和生物學院田杰生老師。

1.1.2 試劑 eECL Western Blot Kit高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司;3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP)購自默克化工技術(上海)有限公司;限制性內切酶EcoR I、XhoI、T4 DNA 連接酶(TaKaRa,北京);蛋白質標記物(marker)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;D2000 plus DNA Ladder購自中科瑞泰生物科技有限公司;小鼠抗6His單克隆抗體(mIgG-HRP)購自武漢三鷹生物技術有限公司;卡那霉素(Kana)、蛋白質上樣緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司;PCR Mix、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、BCA蛋白質定量試劑盒購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余常用試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 構建與鑒定pET28a-Nb-(G4S)1-Cys、pET28a-Nb-(G4S)4-Cys 2種表達載體 依據(jù)anti-SDM Nb的基因序列,通過Primer 5.0軟件分別設計PCR引物(F-SDM-(G4S)1-EcoR I:5′-CGAATTCCAGGTGCAGCTCGTGGAG-3′,R-SDM-(G4S)1-XhoI:5′-CCTCGAGTCAGCACGATCCGCCACCGCCAAGC TTCGAGGAGACGGTGACCTGG-3′;F-SDM-(G4S)4-EcoR I:5′-CGAATTCCAGGTGCAGCTCGTGGAG-3′,R-SDM-(G4S)4-XhoI:5′-CCTCGAGTCAGCACGAT CCGCCACCGCCCGATCCGCCACCGCCCGA TCCGCCACCGCCCGATCCGCCACCGCCAAGCTTCG AGGAG ACGGTGACCTG-3′)。以pH-17質粒為模板,利用上述引物進行PCR擴增,獲取Nb-(G4S)1-Cys、Nb-(G4S)4-Cys 2種基因片段,將基因片段進行膠回收。使用高純度質粒小提試劑盒提取BL21(DE3)-pET28a菌液中的pET28a質粒,將目的基因和質粒使用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,在37 ℃水浴鍋中放置3 h,待酶切完全,將酶切產物置于75 ℃水浴鍋中放置10 min滅活并進行膠回收,將膠回收后的pET28a質粒分別與Nb-(G4S)1-Cys、Nb-(G4S)4-Cys 2種基因片段連接,構建pET28a-Nb-(G4S)1-Cys、pET28a-Nb-(G4S)4-Cys 2種表達載體。將構建的表達載體轉入BL21(DE3)感受態(tài)中,置于含卡那霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),將長出的單克隆菌擴大培養(yǎng),提取質粒,使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶對提取的重組質粒進行雙酶切驗證,將驗證成功的質粒進行測序,若結果與預期相符,則表明載體構建成功。

1.2.2 制備anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys、Nb-(G4S)4-Cys重組蛋白質 將測序正確的2種重組菌劃線培養(yǎng),挑取單菌落過夜培養(yǎng),吸取1 mL的菌液置于100 mL LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3 h,待菌液OD600為0.4～0.6時,加入0.8 mL 100 mmol/mL的IPTG于BL21(DE3)-pET28a-Nb-(G4S)1-Cys菌液中,加入0.5 mL 100 mmol/mL的IPTG于BL21(DE3)-pET28a-Nb-(G4S)4-Cys菌液中,誘導培養(yǎng)11 h,離心棄上清,加入PBS重懸,離心棄上清,重復此操作1次,將洗滌后的沉淀溶于10 mL PBS中,在低溫下超聲破碎40 min,9 000 r/min離心20 min,將離心后的沉淀依次用包涵體洗滌液I、II、III、包涵體溶解液進行處理,再置于尿素濃度依次為6 ,4 ,2 ,0 mol/L的PBS溶液中進行復性。將得到的2種純化蛋白質進行SDS-PAGE鑒定。

1.2.3 提取BMPs 將MTB置于含PBS的小燒杯中,充分混勻,低溫條件下進行細胞破碎,超聲3 s,間隔5 s,運行30 min,將破碎后的MTB置于磁鐵上吸附過夜,使BMPs沉降,待BMPs全部沉降于燒杯底部,棄去上清,每天反復3次,直至上清中蛋白質濃度小于0.1 ng/mL,將提取的BMPs置于4 ℃保存。

1.2.4 構建和優(yōu)化anti-SDM Nb免疫磁珠 稱取2份1 mg的BMPs,置于含PBS的2 mL EP管中,靜置于磁力架上,待固液分離后棄去液體,加入1 mL pH為8.0的PBS,80 W超聲10 min,靜置分層后,棄去上清,重復上述步驟,反復3次。將溶解在20 μL DMF中的SPDP加入到EP管中,超聲混勻后,置于220 r/min搖床上孵育2 h,靜置分層,棄去上清,加入1 mL pH為7的PBST,80 W超聲10 min,靜置棄去上清,反復3次,將1 mg anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys和Nb-(G4S)4-Cys分別加入到BMP-SPDP中,超聲并置于搖床上孵育2 h,置于磁力架上靜置分層,棄去上清,加入1 mL pH為8.0的PBST,80 W超聲10 min,靜置后棄去上清,反復3次,加入1 mL PBS,4 ℃保存?zhèn)溆?。利用公式計算偶?lián)效率:偶聯(lián)效率=(C1-C2)×V/M(C1表示Nb與BMPs反應之前的濃度;C2表示Nb與BMPs反應后的濃度;V表示與BMPs反應時的溶液體積;M表示參與偶聯(lián)反應的BMPs重量)。

將構建的2種免疫磁珠各取10 μL,加入5 μL上樣緩沖液處理后,離心取上清,進行SDS-PAGE凝膠電泳,使用轉膜儀將凝膠上的樣品轉移至PVDF膜上,使用小鼠抗6His單克隆抗體(mIgG-HRP)對膜上的目的蛋白質進行驗證,初步判定免疫磁珠是否構建成功。將WB驗證成功的免疫磁珠用ddH2O清洗,用透射電鏡和Zeta電位分析儀分析BMPs偶聯(lián)前后水合粒徑、Zeta電位和分散性差異。

為了提高Nb和BMPs的偶聯(lián)效率,設置了不同的孵育時間(30、60、90、120、150 min),通過計算偶聯(lián)效率選取最佳孵育時間,在最佳孵育時間下將BMPs與1 mL不同濃度的SDM Nb(0.1、0.5、1.0、1.5 mg/mL)進行孵育,根據(jù)偶聯(lián)效率,選取最佳孵育濃度。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 使用透射電鏡分析BMPs、BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb粒徑,每種磁顆粒置于三種不同視野下,使用GraphPad Prism 8.0對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行多組間兩兩比較,采用one-way ANOVA進行分析,其中P<0.05有統(tǒng)計學意義。*P<0.05表明差異顯著,**P<0.01和***P<0.001代表差異極顯著。

2 結果

2.1 pET28a-Nb-(G4S)1-Cys、pET28a-Nb-(G4S)4-Cys表達載體的構建與鑒定

以pH-17質粒為模板,進行PCR擴增,結果正如Fig.1A所示,anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys基因在405 bp處呈現(xiàn),而anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys在450 bp處有單一明亮條帶,使用高純度質粒小提試劑盒提取過夜培養(yǎng)的BL21(DE3)-pET28a中的pET28a質粒。將驗證成功的基因和pET28a質粒進行雙酶切,質粒呈現(xiàn)出單一條帶(Fig.1B),證明質粒酶切成單一的鏈狀結構,基因經(jīng)酶切后條帶依然明亮,證明酶切后的基因濃度依然很高,有利于后續(xù)載體的構建。將基因和質粒過夜連接,構建出pET28a-Nb-(G4S)1-Cys、pET28a-Nb-(G4S)4-Cys 2種表達載體,對兩者進行雙酶切驗證,結果正如圖Fig.1C所示,pET28a-Nb-(G4S)1-Cys表達載體呈現(xiàn)出5 300 bp和405 bp 2條帶,pET28a-Nb-(G4S)4-Cys表達載體呈現(xiàn)出5 300 bp和450 bp 2條帶,二者均未見明顯雜帶,證明選取的表達載體初步構建成功。

Fig.1 Identification of pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys and pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys plasmids The pH-17 plasmid containing Nb gene against SDM was used as the template for PCR amplification. The pET28a and anti-SDM gene were double-digested with EcoR I and Xho I. Then, the gene and plasmid were recovered and linked with T4 DNA ligase. (A) Amplification of anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys and Nb-(G4S)4-Cys by PCR. Line M: DNA Marker; Line 1: anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys fragment; Line 2: anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys fragment; (B) Digestion of anti-SDM Nb and pET28a by EcoR I and Xho I. Line M: DNA Marker; Line 1: pET28a; Line 2: anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys fragment; Line 3: anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys fragment; (C) Digestion of pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys and pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys by EcoR I and Xho I. Line M: DNA Marker; Line 1: Digestion of pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys by EcoR I and Xho I; Line 2: Digestion of pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys by EcoR I and Xho I

2.2 Anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys、SDM Nb-(G4S)4-Cys重組蛋白質的制備

重組菌BL21(DE3)-pET28a-Nb-(G4S)1-Cys在0.8 mmol/mL IPTG濃度下進行誘導表達,重組菌BL21(DE3)-pET28a-Nb-(G4S)4-Cys在0.5 mmol/mL IPTG濃度下進行誘導表達,結果發(fā)現(xiàn),二者都以包涵體的形式進行表達,對超聲破碎的沉淀進行包涵體蛋白質的純化和復性,取10 μL純化后的蛋白質,使用上樣緩沖液處理,進行SDS-PAGE驗證,結果如Fig.2 所示,anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys在12.5 kD處有明顯條帶,anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys在14.1 kD處有明顯條帶。純化出的樣品SDS-PAGE圖上都無明顯雜帶,證明樣品中雜蛋白質較少,可以滿足后續(xù)實驗需要。

Fig.2 SDS-PAGE identifies anti-SDM Nb purification results Expression of Nb-(G4S)1-Cys and Nb-(G4S)4-Cys was performed using a final concentration of IPTG at 0.8 and 0.5 mmol/mL, respectively. Line M: protein marker; Line 1: anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys; Line 2: anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys

2.3 Anti-SDM Nb免疫磁珠的構建

用BMPs作為空白對照,將構建的2種免疫磁珠經(jīng)高溫處理,進行Western 印跡驗證,結果如Fig.3所示,泳道2無任何反應,證明BMPs不影響研究結果的判斷,而泳道1在12.5 kD呈現(xiàn)出單一條帶,泳道3在14.1 kD處有明顯反應,二者皆與預期結果相符,結果表明,2種蛋白質皆偶聯(lián)到BMPs上,初步判定2種免疫磁珠構建成功。

Fig.3 Identification of immunomagnetic beads by Western blotting The samples were separated by SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. The target proteins were then confirmed by respective antibodies. BMPs were used as a blank control. Line M: Protein Marker; Line 1: BMP-(G4S)1-Nb; Line 2: BMPs; Line 3: BMP-(G4S)4-Nb

對SDM Nb-(G4S)1-Cys的孵育時間和孵育濃度進行優(yōu)化,結果如圖Fig.4所示,當孵育30、60、90 min時,隨著孵育時間的增加,偶聯(lián)效率增加,當孵育時間達到120 min時,偶聯(lián)效率達到最高值,若孵育時間繼續(xù)增加,偶聯(lián)效率反而降低,所以SDM Nb-(G4S)1-Cys的最佳孵育時間為120 min。當將1 mg的BMPs與不同濃度的Nb-(G4S)1-Cys孵育120 min時,從Fig.4B顯示,當SDM Nb-(G4S)1-Cys的濃度為1 mg/mL時,二者偶聯(lián)效率最高,1 mg BMPs可偶聯(lián)726±17 μg SDM Nb-(G4S)1-Cys。當BMPs和SDM Nb-(G4S)4-Cys孵育不同時間時,從Fig.4C中顯示,當孵育120 min時,偶聯(lián)效率最高,在最佳孵育時間下,不同濃度的Nb-(G4S)4-Cys與1 mg BMPs孵育,結果發(fā)現(xiàn),1 mg Nb-(G4S)4-Cys與1 mg BMPs進行孵育時,偶聯(lián)效率最高,1 mg BMPs可與692±15 μg SDM Nb-(G4S)4-Cys偶聯(lián)。

Fig.4 The linking ratios of BMPs and Nb-(G4S)1-Cys/Nb-(G4S)4-Cys (A) The linking ratios of SDM Nb-(G4S)1-Cys and BMPs at different times, with 1 mg SDM Nb-(G4S)1-Cys and 1 mg BMPs being incubated; (B) The linking ratios of Nb-(G4S)1-Cys and BMPs after 2 h incubation; (C) The linking ratios of Nb-(G4S)4-Cys and BMPs at different times, with 1 mg SDM Nb-(G4S)4-Cys and 1 mg BMPs being incubated; (D) The linking of different ratios of SDM Nb-(G4S)4-Cys and BMPs after 2 h incubation

2.4 anti-SDM Nb免疫磁珠的表征

取微量BMPs進行透射電鏡分析,先將Nb-(G4S)1-Cys/Nb-(G4S)4-Cys與BMPs進行偶聯(lián),再取微量樣品進行透射電鏡觀察,結果顯示,BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb顆粒與顆粒之間的空隙較大,幾乎皆是單分散顆粒,與BMPs空白對照組在形態(tài)上無明顯區(qū)別(Fig.5A,B,C),BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb的粒徑分布均勻,在20 ～ 60 nm之間,粒徑大小為30 ～ 40 nm的居多,將BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb粒徑與空白對照組BMPs粒徑進行統(tǒng)計學分析,皆無顯著性差異(Fig.D),說明BMPs與SDM Nb偶聯(lián)后,對BMPs的形態(tài)并未造成影響。

Fig.5 Electron microscopy of magnetic particles After the immunomagnetic beads were cleaned with ddH2O, they were dried under infrared light and observed by transmission electron microscopy. (A) BMPs; (B) BMP-(G4S)1-Nb; (C) BMP-(G4S)4-Nb; (D) The size distribution of BMPs、BMP-(G4S)1-Nb and BMP-(G4S)4-Nb

以BMPs作為空白對照,用Zeta電位分析儀對BMPs、BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb的水合粒徑、Zeta電位及分散性進行分析,結果如Table 1所示,—30 mV或+30 mV一般作為水相穩(wěn)定的分界線,Zeta電位高于+30 mV或低于-30 mV,則表明所形成的分散體系較穩(wěn)定,BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb的Zeta電位皆低于-30 mV,說明二者的水相膠體皆比較穩(wěn)定,BMP-(G4S)1-Nb的Zeta電位絕對值更高,水合粒徑更小,多分散性指數(shù)低,綜上表明,BMP-(G4S)1-Nb在水相體系中膠體穩(wěn)定性更強。

3 討論

磺胺類藥物因具有價格低廉、抗菌譜廣等優(yōu)點,而廣泛應用于預防和治療養(yǎng)殖業(yè)中的疾病,但其會通過食物鏈進入人體[14],許多國家對食品中磺胺類藥物的殘留做出了相關規(guī)定。有的國家甚至對不同磺胺藥的殘留量進行限定,這就對檢測磺胺類藥物的免疫分析法提出更高的要求。尋根究底是需要制備兼具高特異性和高親和力的識別材料。由于磺胺類藥物具有高度相似的結構[15],只制備針對某一種磺胺類藥物的高特異性多克隆抗體和單克隆抗體非常困難,所以本文選擇利用基因工程技術,制備具有巨大應用潛力的Nb,與傳統(tǒng)抗體相比,納米抗體不僅尺寸較小、特異性高和理化性質穩(wěn)定,而且利用微生物生產表達時無需翻譯后修飾,可實現(xiàn)大規(guī)模生產,顯著降低生產成本[9]。

Nb與新型材料的結合會提高檢測的靈敏度,20世紀70年代,美國工作者發(fā)現(xiàn)并報道了MTB[16],BMPs是一種由其在胞內合成的生物膜包被的納米磁性材料[17],因為其具有獨特的特征,例如順磁性、納米級尺寸(40～120 nm)和高分散性,且被穩(wěn)定的細胞質膜覆蓋,被認為具有良好的生物相容性[18],因此,BMPs能夠輕松地與蛋白質和基因結合,具有各種技術應用的潛力,使用其作為載體不僅高富載,而且復合物易于從溶液中分離。本文選用BMPs作為載體,Nb作為免疫配基制備免疫磁珠,通過Western印跡初步驗證發(fā)現(xiàn),BMPs上偶聯(lián)有納米抗體,隨后,本文對孵育時間和孵育濃度進行優(yōu)化,結果發(fā)現(xiàn),最佳孵育時間是120 min,最佳孵育濃度為1 mg BMPs分別與1 mg/mL Nb-(G4S)1-Cys、1 mg/mL Nb-(G4S)4-Cys進行孵育,在最優(yōu)條件下,1 mg BMPs可與726±17 μg Nb-(G4S)1-Cys偶聯(lián),1 mg BMPs可與692±15 μg SDM Nb-(G4S)4-Cys偶聯(lián),偶聯(lián)效率的不同是因二者之間的連接肽長度不同,連接肽是基因融合技術成功實現(xiàn)的重要技術手段,借助一段合適的核苷酸序列將目的基因連接起來,其在生物體內表達成為一條單一的肽段[19]。主要分為剛性連接肽和柔性連接肽,柔性連接肽即成柔軟線性的一類易彎折的氨基酸序列,常見為(G4S)n重復序列,因其柔軟性好和親水性強,所以本文選擇在Nb的末端引入柔性連接肽,使Nb更好的展示在BMPs上。

Table 1 Hydration radius, potential and dispersion of immunomagnetic beads

長度是選擇連接肽時主要考慮的因素,本文在anti-SDM Nb的C端引入(G4S)1、(G4S)4 2種長度的柔性連接肽,對2種抗體構建的免疫磁珠偶聯(lián)效率進行比較,結果發(fā)現(xiàn),(G4S)1具有更高的偶聯(lián)效率,免疫磁珠表征發(fā)現(xiàn),BMP-(G4S)1-Nb的Zeta電位絕對值更高,水合粒徑更小,多分散性指數(shù)低(BMP-(G4S)1-Nb的水合粒徑為275.4±1.089,Zeta電位為-49.74±1.29 mV,分散性為0.0158±0.028;BMP-(G4S)4-Nb的水合粒徑為305.3±2.119,Zeta電位為-43.46±1.73 mV,分散性為0.0245±0.031),BMP-(G4S)1-Nb在水相體系中膠體穩(wěn)定性更強。綜上所述,BMP-(G4S)1-Nb免疫磁珠的性能優(yōu)于BMP-(G4S)4-Nb,本研究制備的2種免疫磁珠皆可用于快速檢測養(yǎng)殖環(huán)境和動物產品中的SDM,為今后選擇具有合適長度連接肽提供理論依據(jù)。