李鶴鳴，劉夢(mèng)琴, ，虞艷瑋，沈 燚，杜金蔓，胡思婧，徐金龍，張泉龍，秦路平*，張巧艷*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108

3. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六九醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010051

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種常見的老年性疾病，是參與骨代謝的成骨細(xì)胞的骨形成作用和破骨細(xì)胞（osteoclasts，OCs）的骨吸收作用失衡，導(dǎo)致骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加，以致易于發(fā)生骨折的骨骼疾病[1]。OCs 是唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，由骨髓單核細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和核因子-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的刺激下形成的多核細(xì)胞，其活性受絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的調(diào)控[2]。隨著機(jī)體的衰老，體內(nèi)雌激素水平降低，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成OCs 活性增強(qiáng)，致使骨量減少和OP 的發(fā)生[3-4]。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激的關(guān)鍵機(jī)制[5]，激活OCs 的Nrf2 通路，增強(qiáng)其抗氧化能力，抑制其形成分化和骨吸收活性，可以減緩OP 的發(fā)生發(fā)展。目前，一些抗氧化劑如維生素E、維生素C，尤其是N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）被發(fā)現(xiàn)能夠作為ROS 清除劑抑制OCs 在骨形成作用中的負(fù)面影響[6]。而天然藥物含有豐富的抗氧化成分，從中尋找能夠抑制OCs 骨吸收的活性成分，研究其抑制OCs 形成分化的機(jī)制，可為中藥新產(chǎn)品的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

仙茅為石蒜科植物仙茅CurculigoorchioidesGaertn. 的干燥根莖[7]，含有酚苷、木脂素和環(huán)阿爾廷醇型三萜皂苷等多種結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分，具有補(bǔ)腎陽及與之相關(guān)的調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗抑郁、保肝、保護(hù)心血管、抗骨質(zhì)疏松及植物雌激素樣作用[8-9]，應(yīng)用于二仙湯、黃芪三仙湯、調(diào)經(jīng)促孕丸、更年安片、骨仙片、益氣固本片等多個(gè)中藥方劑和中成藥中，顯示出了良好的應(yīng)用前景。仙茅酚苷類成分為其主要活性成分，具有良好的抗氧化以及抗骨質(zhì)疏松作用[10]，其結(jié)構(gòu)類型包括苯甲酸酯類酚苷如仙茅苷、仙茅苷乙；苔黑酚類酚苷如苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷；含氯苯酚衍生物類酚苷如仙茅素A[11-12]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，仙茅苷能夠通過對(duì)抗氧化應(yīng)激增加鐵超載和表達(dá)嵌合小鼠/人淀粉樣蛋白前體蛋白（Mo/HuAPP695swe）和突變?nèi)嗽缋系鞍?（PS1-dE9）雙轉(zhuǎn)基因小鼠的骨形成[13-14]，并發(fā)現(xiàn)其通過對(duì)抗氧化應(yīng)激抑制OCs 骨吸收的機(jī)制[15]。仙茅苷在《中國藥典》2020 年版規(guī)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.10%，而研究發(fā)現(xiàn)苔黑酚類酚苷在仙茅中質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)1.0%[16]，也具有抗氧化和抗骨質(zhì)疏松的作用[17]，但其深入的機(jī)制尚不清楚。苔黑酚龍膽二糖苷（orcinol gentiobioside，OGB）為仙茅中主要的苔黑酚類酚苷，其是否通過抗氧化發(fā)揮抗OP 作用值得進(jìn)一步探討。因此，本研究以sRANKL 聯(lián)合H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化的OCs 為模型，觀察OGB 對(duì)OCs 形成分化和骨吸收作用的影響，研究其通過NF-κB 和Nrf2通路減緩OCs 氧化應(yīng)激和骨吸收的機(jī)制，以期為仙茅的臨床應(yīng)用及資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

RAW264.7 細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑

OGB（批號(hào)P23M10S84022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、NAC（批號(hào)L17O9X7236，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、Nrf2抑制劑ML385（批號(hào)L17JD9L77422，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、NF-κB 抑制劑 BAY 11-7082（批號(hào)K10J10D92650，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；重組小鼠可溶性核因子-κB 受體活化因子配基（soluble receptor activator of nuclear factor-κB ligand，sRANKL，批號(hào)0715612J1217）購自美國PeproTech 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司；CCK-8 增殖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)MA0218）購自大連美倫生物醫(yī)藥有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛（批號(hào)XS185001）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；ROS 測(cè)定試劑盒（批號(hào)20200520）、鈣測(cè)定試劑盒（批號(hào) 20201121）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（gamma-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20200529）、小鼠I 型膠原C 末端肽（cross-linked carboxy-terminal telopeptide of type I collagen，CTX-I）ELISA 試劑盒（批號(hào)20201130）、小鼠I 型前膠原氨基端前肽（procollagen type I intactNterminal propeptide，PINP）ELISA 試劑盒（批號(hào)20201130）、小鼠醌氧化還原酶 1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）ELISA 試劑盒（批號(hào)20200601）、小鼠血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）ELISA 試劑盒（批號(hào)20200601）、小鼠還原型輔酶 II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶1（NADPH oxidase 1，NOX1）ELISA 試劑盒（批號(hào)20200601）、小鼠NADPH 氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）ELISA試劑盒（批號(hào)20200601）購自南京建成生物工程研究所；組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）抗體（批號(hào)ab19027）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）抗體（批號(hào)ab33915）購自英國Abcam 公司；活化T-細(xì)胞核因子1（nuclear factor of activated T-cells，NFATc1）抗體、Nrf2 抗體、Kelch 樣ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）抗體、磷酸化p65（p-p65）抗體、p65 抗體、山羊抗兔IgG二抗購自美國CST 公司（批號(hào)分別為8032、12721、8047、3033、8242、7074）；核因子-κB 抑制因子α（inhibitor of NF-κB-α，IκBα）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）抗體、c-Fos抗體（批號(hào)分別為BM3932、BA2202、BA0207-2）購自武漢博士德生物工程有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)AT0010）購自上海維景生物科技有限公司。

1.3 儀器

DMi1 型顯微鏡（德國Leica 公司）；Axio Imager 2 型正置顯微鏡、LSM880 型激光共聚焦顯微鏡（卡爾蔡司股份公司）；1510 型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 H2O2 誘導(dǎo)OCs 模型的建立

將RAW264.7 細(xì)胞在含25 ng/mL sRANKL 的α-MEM 完全培養(yǎng)基中誘導(dǎo)36 h 后，再用含20 μmol/L H2O2的α-MEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)36 h，即可得到H2O2誘導(dǎo)的OCs。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力

將RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板中，貼壁過夜，用20 μmol/L NAC 以及不同劑量（0、1、5、10 μmol/L）的OGB 處理36 h，在給藥基礎(chǔ)上再加入20 μmol/L H2O2，并單獨(dú)設(shè)置H2O2組，繼續(xù)處理36 h，CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.3 TRAP 染色及活性測(cè)定

設(shè)置sRANKL 和H2O2誘導(dǎo)的OCs 模型組、NAC 處理的陽性藥組以及OGB（1、5、10 μmol/L）給藥組，給藥處理36 h 后，在給藥基礎(chǔ)上再加入20 μmol/L H2O2處理36 h，收集上清，按照課題組前期建立的方法[18]測(cè)定TRAP 活性，并按照試劑盒說明書進(jìn)行TRAP 染色，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 F-actin 環(huán)的免疫熒光染色

將RAW264.7 細(xì)胞接種于玻底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分組給藥處理24 h，再加入H2O2并給藥處理12 h，用PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛室溫固定30 min 后，采用鬼筆環(huán)肽和DAPI 對(duì)OCs 細(xì)胞核及F-actin 環(huán)進(jìn)行免疫熒光染色，最后于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 ELISA 檢測(cè)OCs 骨吸收作用

將無菌的牛皮質(zhì)骨切片置于96 孔板，然后將RAW264.7 細(xì)胞接種于板中，培養(yǎng)8 h 后分組給藥處理36 h，再加入H2O2并給藥處理36 h，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)上清液中Ca2+、PINP、CTX-I 的含量。

2.6 ROS 水平檢測(cè)

以sRANKL 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞得到的OCs為對(duì)照組，細(xì)胞分組處理后用PBS 清洗，每孔加入含10 μmol/L DCFH-DA 的無血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗后，于485 nm 激發(fā)波長和528 nm 發(fā)射波長下檢測(cè)其熒光值。

2.7 NADPH 氧化酶及抗氧化酶活性測(cè)定

將sRANKL 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞分化的OCs分組給藥處理36 h，再加入H2O2并給藥處理24 h，PBS 清洗后低溫裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清并按照試劑盒說明書檢測(cè)NOX2、NOX4、HO-1、NQO1 和γ-GCS 活性。

2.8 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)

設(shè)置對(duì)照組、模型組、給藥組以及ML385（5 μmol/L）或BAY 11-7082（1.5 μmol/L）處理的抑制劑組，分組處理后，收集并裂解細(xì)胞獲得蛋白，通過BCA 法測(cè)定總蛋白濃度，并定量為等濃度等體積的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min 使蛋白變性，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，置于5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉2 h，分別加入c-Fos、CTSK、MMP9、NFATc1、TRAF6、IκBα、p-p65、p65、Nrf2、Keap1及GAPDH 抗體，于4 ℃孵育過夜后TBST 洗膜；加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜，用ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.9 p65 及Nrf2 免疫熒光染色

將RAW264.7 細(xì)胞接種于玻底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分組給藥處理48 h，再加入H2O2并給藥處理4 h，PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，繼續(xù)用PBS 清洗2 次，加入5%牛血清白蛋白于37 ℃封閉1 h，分別加入p65 和Nrf2 抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜，PBS 清洗2 次，加入熒光二抗室溫避光孵育30 min，PBS 清洗2 次后加入DAPI 室溫避光染色10 min，用PBS 清洗2 次后再加入200 μL PBS，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 OGB 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力及H2O2 誘導(dǎo)的OCs 形成和分化的影響

如圖1-A 所示，與對(duì)照組比較，20 μmol/L NAC以及1、5、10 μmol/L OGB 處理36 h 后，在藥物處理的同時(shí)加入 20 μmol/L H2O2再處理 36 h，RAW264.7 細(xì)胞的活力均無明顯變化。TRAP 特異性地分布于OCs 中，如圖1-B、C、D 所示，NAC顯著減少TRAP 陽性細(xì)胞數(shù)量（P＜0.01），OGB 可劑量相關(guān)性地顯著降低OCs 的TRAP 活性（P＜0.05、0.01），減少TRAP 陽性細(xì)胞數(shù)目（P＜0.01），表明OGB 可顯著抑制OCs 的形成和分化。

圖1 OGB 對(duì)sRANKL 和H2O2 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞活力 (A)、TRAP 活性 (B)、TRAP 陽性細(xì)胞數(shù) (C、D) 的影響(±s, n = 6)Fig.1 Effect of OGB on RAW264.7 cells activity (A), TRAP activity (B), number of TRAP positive cells (C, D) induced by sRANKL and H2O2 (±s, n = 6)

3.2 OGB 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的OCs 的F-actin 環(huán)形成和骨吸收的影響

F-actin 環(huán)是OCs 發(fā)揮骨吸收功能的重要結(jié)構(gòu)，如圖2-A 所示，H2O2誘導(dǎo)的OCs 的F-actin 環(huán)厚且完整，不同濃度的OGB 處理后，OCs 的F-actin 環(huán)變薄、缺失，甚至消失，表明OGB 可抑制OCs 的F-actin 構(gòu)建。

圖2 OGB 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的OCs 的F-actin 環(huán)形成 (A) 及骨吸收活性 (B) 的影響 (±s, n = 4)Fig.2 Effect of OGB on construction of F-actin ring (A) and bone resorption activity (B) of OCs induced by H2O2(±s, n = 4)

OCs 能夠分泌骨基質(zhì)降解酶，降解骨基質(zhì)，釋放Ca2+以及膠原降解產(chǎn)物如CTX-I 和PINP，因此，培養(yǎng)OCs 的培養(yǎng)基中Ca2+及CTX-I 和PINP 的水平可用于表征其骨吸收活性。如圖2-B 所示，NAC 顯著降低培養(yǎng)基中Ca2+、CTX-I 和P1NP 的水平（P＜0.05、0.01）；OGB 能夠劑量相關(guān)性地顯著降低培養(yǎng)基中Ca2+的含量（P＜0.05、0.01），降低培養(yǎng)基中CTX-I 和P1NP 的水平（P＜0.05、0.01），顯示出顯著抑制OCs 骨吸收活性的作用。

3.3 OGB 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的OCs 骨吸收相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 和c-Fos 介導(dǎo)OCs 的形成分化，促進(jìn)骨吸收相關(guān)蛋白MMP9 和CTSK 的表達(dá)，使OCs 發(fā)揮骨吸收作用。如圖3 所示，與模型組比較，OGB 能夠顯著下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的OCs 的c-Fos、CTSK 和MMP9 的表達(dá)（P＜0.05、0.01），但對(duì)NFATc1 的表達(dá)無顯著影響。

圖3 OGB 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的OCs 骨吸收相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig.3 Effect of OGB on expressions of bone resorption related proteins in OCs induced by H2O2 (±s, n = 3)

3.4 OGB 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的OCs 的ROS 水平及NADPH 氧化酶和抗氧化酶活性的影響

H2O2誘導(dǎo)增加OCs 的ROS 水平，促進(jìn)OCs 的形成、分化和骨吸收活性。ROS 的產(chǎn)生由NADPH氧化酶調(diào)控，HO-1、NQO1、γ-GCS 等抗氧化酶可對(duì)抗ROS 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。如圖4-A 所示，H2O2處理顯著增加OCs 內(nèi)ROS 的水平（P＜0.05），NAC 和OGB 可顯著降低H2O2誘導(dǎo)的OCs 內(nèi)ROS的水平（P＜0.05、0.01）。如圖4-B、C 所示，H2O2的誘導(dǎo)使OCs 的NOX4 活性顯著增加（P＜0.01），NAC 和高劑量的OGB 可以顯著抑制OCs 的NOX4活性（P＜0.05、0.01），但H2O2及NAC 和OGB 對(duì)OCs 的NOX2 活性均無明顯的影響。如圖4-D、E、F 所示，H2O2顯著降低OCs 內(nèi)HO-1 和NQO1 的活性（P＜0.05、0.01），NAC 和OGB 處理后，HO-1、NQO1 的活性顯著增加（P＜0.05、0.01）；H2O2處理顯著增加OCs 的γ-GCS 活性（P＜0.01），相較模型組，NAC 和OGB 處理對(duì)OCs 的γ-GCS 活性沒有顯著的影響，表明OGB 可減緩H2O2引起的OCs氧化應(yīng)激。

3.5 OGB 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的OCs 中Nrf2 通路的調(diào)控作用

Nrf2 是調(diào)控氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。如圖5所示，OGB 能夠增加H2O2誘導(dǎo)的OCs 的Nrf2 表達(dá)（P＜0.05）及其核轉(zhuǎn)位，但對(duì)其Keap1 的表達(dá)沒有顯著的影響，Nrf2 通路抑制劑ML385 在一定程度上逆轉(zhuǎn)OGB 對(duì)OCs 的Nrf2 核轉(zhuǎn)位的促進(jìn)作用，表明OGB 能夠通過激活Nrf2 通路減緩H2O2誘導(dǎo)的OCs 的氧化應(yīng)激。

圖5 OGB 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的OCs 中Nrf2 通路 (A) 和Nrf2 核轉(zhuǎn)位 (B) 的調(diào)控作用 (±s, n = 3)Fig.5 Regulatory effect of OGB on Nrf2 pathway (A) and nucleus translocation of Nrf2 (B) in OCs induced by H2O2(±s, n = 3)

3.6 OGB 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的OCs 中NF-κB 通路的調(diào)控作用

進(jìn)一步研究了OGB 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的OCs 中NFκB 通路的調(diào)控作用。如圖6 所示，OGB 能夠顯著抑制TRAF6 的募集（P＜0.05），降低IκBα 的降解（P＜0.05），抑制p65 的磷酸化（P＜0.05），阻止p65的入核，進(jìn)而抑制NF-κB 通路的激活。當(dāng)OGB 與NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082 聯(lián)用后，OGB 對(duì)IκBα 降解的抑制作用增強(qiáng)（P＜0.05），表明OGB 能夠通過抑制NF-κB 通路的激活，抑制OCs 的形成和分化。

圖6 OGB 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的OCs 中NF-κB 通路 (A) 和p65 核轉(zhuǎn)位 (B) 的調(diào)控作用 (±s, n = 3)Fig.6 Regulatory effect of OGB on NF-κB pathway (A) and nucleus translocation of p65 (B) in OCs induced by H2O2(±s, n = 3)

4 討論

雌激素缺失和衰老導(dǎo)致的機(jī)體氧化應(yīng)激已被證實(shí)是OP 發(fā)生的關(guān)鍵因素[19]，減緩機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)成為調(diào)控骨代謝、減少骨丟失的新策略。抗氧化劑NAC 能夠阻止RANKL 介導(dǎo)的NF-κB、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）以及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路的激活，抑制OCs 的形成分化[20]。許多中藥及天然化合物如白藜蘆醇、紅景天苷等也被證實(shí)能夠調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激，具有減少骨丟失的作用[6]。課題組前期發(fā)現(xiàn)仙茅酚苷類成分對(duì)去卵巢大鼠和快速老化小鼠的骨丟失具有確切的防治作用[17,21]，并可通過對(duì)抗氧化應(yīng)激降低ROS 對(duì)成骨細(xì)胞功能的損傷作用和對(duì)OCs 功能的激活作用[22]，仙茅苔黑酚葡萄糖苷也被證實(shí)可通過與p38 結(jié)合，促進(jìn)成骨細(xì)胞活性，減緩糖皮質(zhì)激素所致OP 小鼠的骨丟失[23]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OGB 抑制氧化應(yīng)激OCs 的形成分化和骨吸收的作用，并揭示了OGB 發(fā)揮這一作用的機(jī)制。

OCs 作為唯一進(jìn)行骨吸收的功能細(xì)胞，其形成分化受轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 和c-Fos 的調(diào)節(jié)[24]。OCs通過F-actin 環(huán)附著在骨基質(zhì)上，分泌TRAP、MMP9和CTSK，降解骨礦物質(zhì)和骨膠原，進(jìn)行骨吸收[25]。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑NCA 以及OGB 可顯著減少H2O2誘導(dǎo)的OCs 的TRAP 活性及TRAP 陽性細(xì)胞的數(shù)目，抑制其轉(zhuǎn)錄因子c-Fos 的表達(dá)、F-actin 環(huán)的形成及骨基質(zhì)降解酶MMP9 和CTSK 的活性，降低骨基質(zhì)降解產(chǎn)物Ca2+、CTX-I 和PINP 的釋放，顯示出良好的抑制H2O2誘導(dǎo)的OCs 形成分化和骨吸收活性作用，與陽性藥NAC 相比，OGB 具有相同甚至更好的抗OP 作用。

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)OCs 的形成和分化。NADPH 氧化酶，如NOX1、NOX2 和NOX4 參與調(diào)控OCs 中ROS 產(chǎn)生，骨骼中過多的ROS 將直接增加OCs 活性[26]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS 激活的OCs 骨吸收作用是由轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 調(diào)控的[27]，穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf2被細(xì)胞質(zhì)中的Keap1 結(jié)合，進(jìn)行泛素介導(dǎo)的降解，而氧化應(yīng)激則導(dǎo)致Keap1 釋放，阻止了Nrf2 的降解，此時(shí)Nrf2 被激活并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，促進(jìn)HO-1、NQO1、γ-GCS 和G6PD 等抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)節(jié)OCs 內(nèi)ROS 水平，調(diào)控RANKL 依賴的OCs 形成和分化，減緩骨質(zhì)的破壞[28]。研究發(fā)現(xiàn)，OGB 能夠降低H2O2誘導(dǎo)的OCs 中NOX4 水平，促進(jìn)Nrf2 的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而提高抗氧化酶HO-1、NQO1 和γ-GCS 的水平，清除ROS，表明OGB可激活Nrf2 通路減緩OCs 的氧化應(yīng)激。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS 還將作為第二信使激活OCs 的NF-κB 信號(hào)通路[29]。在OCs 分化和成熟的過程中，RANKL 和ROS 促進(jìn)TRAF6 的募集，激活下游NF-κB 通路，IκB 被IκB 激酶復(fù)合物磷酸化并從三聚體解離，p65 表現(xiàn)出核轉(zhuǎn)位的活性，入核后誘導(dǎo)OCs 轉(zhuǎn)錄因子c-Fos 的表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP9、CTSK 以及TRAP 的表達(dá)和活性，促使OCs 的骨吸收作用[30]。本研究證實(shí)OGB 能夠抑制氧化應(yīng)激OCs的TRAF6 募集，抑制IκBα 的降解、p65 的磷酸化及其核轉(zhuǎn)位，表明OGB 可通過抑制H2O2誘導(dǎo)OCs的NF-κB 通路激活，抑制OCs 的形成分化和骨吸收作用。

綜上，本研究闡明了OGB 通過調(diào)節(jié)NF-κB 和Nrf2 通路減緩H2O2誘導(dǎo)的OCs 氧化應(yīng)激和骨吸收的機(jī)制，結(jié)合前期文獻(xiàn)報(bào)道可為仙茅酚苷類成分的開發(fā)利用，以及仙茅防治OP 的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突