王晨曦 ，楊 敏，梁紅寶 ，姚景春，張貴民 ，馮 帥，李 峰*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 經(jīng)方與現(xiàn)代中藥融合創(chuàng)新全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

熊膽粉來(lái)源于熊科熊屬動(dòng)物黑熊Selenarctos thinbetanusCuvier 或棕熊UrsusarctosLinnaeus 的干燥膽汁[1]。按產(chǎn)地劃分可分為東膽（東北）和南膽（云、貴、川），尤以云南的品質(zhì)最佳[2-4]。

現(xiàn)代藥理研究表明，熊膽粉具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、解痙、降血壓、調(diào)血脂、降血糖、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、利膽、溶石、抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、解毒、止痛、消腫、明目、去翳、抗疲勞等作用[5]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，熊膽粉化學(xué)成分主要含結(jié)合型熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、?；切苋パ跄懰幔；蛆Z去氧膽酸及膽固醇類，膽色素類，氨基酸類、蛋白質(zhì)、肽、脂肪酸、微量元素等[6-9]。其中，?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸是熊膽粉重要的特征成分。到目前為止，大多數(shù)學(xué)者致力于膽酸成分的藥理、藥化、藥代以及臨床研究，并取得了可喜的成果[10-15]。膽汁酸的代表成分熊去氧膽酸已合成并進(jìn)入國(guó)家基本藥物。但是對(duì)熊膽粉的非膽酸部分的研究比較少。熊膽粉的藥理作用絕大多數(shù)都是膽汁酸類成分發(fā)揮作用，但是熊膽粉的一些作用機(jī)制尚不明確，很可能與其中非膽酸成分有很大關(guān)系。

因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試對(duì)熊膽粉的不同極性部位進(jìn)行提取分析，建立熊膽粉不同極性部位的HPLC 指紋圖譜，研究不同提取溶劑下熊膽粉化學(xué)成分的變化情況，以期為熊膽粉及其相關(guān)中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate3000 型高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；CoronaVeo 型電噴霧檢測(cè)器，賽默飛世爾科技有限公司；ME204 型萬(wàn)分之一電子天平，梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；SB25-12DT型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；SHB-IIIG 型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試劑

對(duì)照品鵝去氧膽酸（批號(hào)110806-202009）、熊去氧膽酸（批號(hào)110755-202005）、?；切苋パ跄懰釋?duì)照品（批號(hào)110816-202110），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品?；蛆Z去氧膽酸，批號(hào)16F-FVB-66-0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，Panphy 公司；三氟乙酸，色譜純，批號(hào)S6786162816，Merck KGaA公司；乙腈，色譜純，批號(hào)B2122101000，云南新藍(lán)景化學(xué)工業(yè)有限公司；無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、三氯甲烷、醋酸乙酯，分析純，批號(hào)分別為B211109、B211123、B211008、B211109、B211012，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.3 樣品

收集不同產(chǎn)地、不同廠家生產(chǎn)的熊膽粉樣品共10 批，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。各樣品均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定，符合要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的配制

精密稱取“1.3”項(xiàng)下的樣品各0.1 g，置100 mL圓底燒瓶中，分別精密加入醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、無(wú)水乙醇、乙腈各50 mL，水浴回流2 h，綜合回收濾液，蒸干，用甲醇定容至50 mL 量瓶中，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取牛磺熊去氧膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，加無(wú)水甲醇溶解、定容、混勻，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.50、0.51、0.49、0.50 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.5%三氟乙酸溶液，梯度洗脫程序：0～24 min，10%～42%乙腈；24～30 min，42%～73%乙腈；30～40 min，73%～90%乙腈；40～50 min，90%～10%乙腈；50～60 min，10%乙腈；體積流量0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。按上述色譜條件，分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A) 和熊膽粉各極性部位 (S1, B) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and different polar parts from Fel Ursi powder (S1, B)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 分別取“2.1”項(xiàng)下S1 樣品的5 種不同溶劑提取所得的供試品溶液各1 份，按“2.3”項(xiàng)下對(duì)應(yīng)色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄HPLC 圖，計(jì)算得醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、無(wú)水乙醇、乙腈部位色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 依次為1.4%、1.6%，2.3%、2.1%，1.3%、1.5%，2.1%、1.8%，2.0%、1.3%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取“2.1”項(xiàng)下S1 樣品的5 種不同溶劑提取所得的供試品溶液各6 份，按“2.3”項(xiàng)下對(duì)應(yīng)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行檢測(cè)，記錄HPLC 圖，計(jì)算得醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、無(wú)水乙醇、乙腈部位色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 依次為1.3%、1.6%，1.4%、2.7%，1.8%、1.5%，1.8%、2.3%，2.2%、1.4%，結(jié)果表明該試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取“2.1”項(xiàng)下S1 樣品的5 個(gè)極性部位的供試品溶液各1 份，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，記錄共有峰的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算得醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、無(wú)水乙醇、乙腈部位色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 依次為1.4%、1.5%，2.1%、2.3%，1.3%、1.5%，2.1%、2.4%，2.2%、1.4%，結(jié)果表明各極性部位的供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 不同極性部位指紋圖譜分析

2.5.1 醋酸乙酯部位指紋圖譜 分別取10 批醋酸乙酯部位提取物，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC圖。將圖譜輸入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004A 版）”中，得到10 批不同產(chǎn)地、不同廠家熊膽粉醋酸乙酯部位指紋圖譜疊加圖（圖2），以S1 的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)S1～S10 的指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行多點(diǎn)校正并自動(dòng)匹配，設(shè)定時(shí)間寬度為0.2 min，按平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)定6 個(gè)共有峰，其中1～3、5 號(hào)峰分別與?；切苋パ跄懰?、牛磺鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間相一致。計(jì)算10 批醋酸乙酯提取物指紋圖譜與R 的相似度，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，S1～S3、S5～S8、S10 的相似度均達(dá)到0.95以上；S4 與S9 的相似度達(dá)到0.95，但與其他廠家相比略有不同。

圖2 不同熊膽粉樣品醋酸乙酯部位的HPLC 指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.2 HPLC fingerprint overlay of ethyl acetate extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表2 不同熊膽粉醋酸乙酯部位指紋圖譜與R 的相似度Table 2 Similary between fingerprint of ethyl acetate extracts from different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint

2.5.2 三氯甲烷部位指紋圖譜 分別取10 批三氯甲烷部位提取物，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC 圖。將圖譜輸入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004A 版）”中，得到10 批不同產(chǎn)地、不同廠家熊膽粉三氯甲烷部位指紋圖譜疊加圖（圖3），以S1的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)S1～S10 的指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行多點(diǎn)校正并自動(dòng)匹配，設(shè)定時(shí)間寬度為0.2 min，按平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)定8 個(gè)共有峰，其中3、4、6、7 號(hào)峰分別與牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間相一致。計(jì)算10 批三氯甲烷提取物指紋圖譜與R 的相似度，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，除S8 與S9 略有差別外，S1、S4～S10 的相似度均達(dá)到0.9 以上；S2 與S3 的相似度達(dá)到0.9 以上，但與其他廠家相比略有不同。

圖3 不同熊膽粉樣品三氯甲烷部位的HPLC 指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.3 HPLC fingerprint overlay of chloroform extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表3 不同熊膽粉三氯甲烷部位指紋圖譜與R 的相似度Table 3 Similary between fingerprint of chloroform extracts from different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint

2.5.3 丙酮部位指紋圖譜 分別取10 批丙酮部位提取物，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC 圖。將圖譜輸入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004A版）”中，得到10 批不同產(chǎn)地、不同廠家熊膽粉丙酮部位指紋圖譜疊加圖（圖4），以S1 的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)S1～S10 的指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行多點(diǎn)校正并自動(dòng)匹配，設(shè)定時(shí)間寬度為0.2 min，按平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)定8 個(gè)共有峰，其中3、4、6、7 號(hào)峰分別與?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的對(duì)照品的保留時(shí)間相一致。計(jì)算10 批丙酮提取物指紋圖譜與R 的相似度，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，S1～S4、S6、S7、S10 的相似度均達(dá)到0.9 以上；S8 除與S3、S4、S9 略有差別外，與其他廠家熊膽粉的相似度也均達(dá)到0.9 以上；S5 與S9 和其他廠家相比差別較大。

圖4 不同熊膽粉樣品丙酮部位的HPLC 指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.4 HPLC fingerprint overlayof acetone extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表4 不同熊膽粉丙酮部位指紋圖譜與R 的相似度Table 4 Similary between fingerprint of acetone extracts from different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint

2.5.4 乙腈部位指紋圖譜 分別取10 批乙腈部位提取物，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC 圖。將圖譜輸入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004A版）”中，得到10 批不同產(chǎn)地、不同廠家熊膽粉乙腈部位指紋圖譜疊加圖（圖5），以S1 的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)S1～S10 的指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行多點(diǎn)校正并自動(dòng)匹配，設(shè)定時(shí)間寬度為0.2 min，按平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)定10 個(gè)共有峰，其中4、6、8、9 號(hào)峰分別與?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間相一致。計(jì)算10 批乙腈提取物指紋圖譜與R 的相似度，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，除S4 與S5 略有差別外，S1～S8、S10 的相似度均達(dá)到0.9 以上；S9 除與S5、S7 略有差別外，與其他廠家熊膽粉的相似度均達(dá)到0.9 以上。

圖5 不同熊膽粉樣品乙腈部位的HPLC 指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.5 HPLC fingerprint overlay of acetonitrile extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表5 不同熊膽粉乙腈部位指紋圖譜與共有模式相似度Table 5 Similary between fingerprint of acetonitrile extracts from different Fel Ursi powder samples and common mode

2.5.5 乙醇部位指紋圖譜 分別取10 批乙醇部位提取物，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC 圖。將圖譜輸入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004A 版）”中，得到10 批不同產(chǎn)地、不同廠家熊膽粉乙醇部位指紋圖譜疊加圖（圖6），以S1 的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)S1～S10 的指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行多點(diǎn)校正并自動(dòng)匹配，設(shè)定時(shí)間寬度為0.2 min，按平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)定16 個(gè)共有峰，其中6、9、13、15 號(hào)峰分別與牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間相一致。計(jì)算10 批乙醇提取物指紋圖譜與R的相似度，結(jié)果見(jiàn)表6。可見(jiàn)，S1～S10 的相似度均達(dá)到0.95 以上。

圖6 不同熊膽粉樣品乙醇部位的HPLC 指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.6 HPLC fingerprint overlay of ethyl alcohol extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表6 不同熊膽粉乙醇部位指紋圖譜與共有模式相似度Table 6 Similary between fingerprint of ethyl alcohol extracts from different Fel Ursi powder samples and common mode

2.5.6 5 種不同溶劑提取指紋圖譜 選取樣品S1、S7、S10 的醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙腈以及乙醇部位提取物的HPLC 圖，從5 種不同提取部位中共得到15 個(gè)指紋色譜圖（z1～z3 為醋酸乙酯部位，z4～z6 為三氯甲烷部位，z7～z9 為丙酮部位，z10～z12 為乙腈部位，z13～z15 為乙醇部位），將圖譜輸入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004A 版）”中，得到5 種不同溶劑提取部位指紋圖譜疊加圖（圖7），以z14 的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)z1～z15 的指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行多點(diǎn)校正并自動(dòng)匹配，設(shè)定時(shí)間寬度為0.2 min，按平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，共標(biāo)定8 個(gè)共有峰。其中3～5、7 號(hào)分別與牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間相一致。

圖7 不同熊膽粉樣品不同極性提取部位的HPLC 指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.7 HPLC fingerprint of different extraction site of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

將z1～z15 各色譜峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行顯著性差異分析，發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為4.696（共有峰1）、4.834（共有峰2）、25.412（共有峰3）、26.89、29.266（共有峰4）、29.695 min時(shí)，不同極性溶劑之間P≤0.05，說(shuō)明不同極性部位間化學(xué)成分含量差異明顯。

2.6 化學(xué)模式識(shí)別

2.6.1 聚類分析 采用SPSS 21.0 軟件將10 批熊膽粉樣品醋酸乙酯部位6 個(gè)共有峰，三氯甲烷部位8個(gè)共有峰，丙酮部位8 個(gè)共有峰，乙腈部位10 個(gè)共有峰，乙醇部位16 個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，分別得到10×6、10×8、10×8、10×10、10×16 階的原始數(shù)據(jù)矩陣；綜合醋酸乙酯部位、三氯甲烷部位、丙酮部位、乙腈部位、乙醇部位共有峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，得到10×48 的原始數(shù)據(jù)矩陣，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)，采用組間連接法，以平方歐氏距離為分類依據(jù)，對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，綜合聚類結(jié)果見(jiàn)圖8。當(dāng)平方歐氏距離為5 時(shí)，10 批熊膽粉樣品被分為5 類，S1、S2、S7、S10 聚為一類，S6、S8、S3 聚為一類，S4、S5、S9 分別被單獨(dú)聚為一類；當(dāng)平方歐氏距離為10 時(shí)，10 批熊膽粉樣品被分為3 類，S1～S3、S6～S8、S10 聚為一類，S4、S9 聚為一類，S5 單獨(dú)聚為一類；當(dāng)平方歐氏距離為15 時(shí)，10 批熊膽粉樣品被分為2 類，S1～S3、S5～S8、S10 聚為一類，S4、S9 聚為一類。由于S1～S3 產(chǎn)地是四川，S4～S7 產(chǎn)地是云南，S8、S9 產(chǎn)地是吉林，S10 產(chǎn)地是福建，通過(guò)聚類結(jié)果可知，相同產(chǎn)地的熊膽粉，受不同廠家加工方法不同的影響，也存在一定的質(zhì)量差異。

圖8 聚類分析樹狀圖Fig.8 Dendrogram of cluster analysis

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 采用SIMCA 14.1 軟件分別對(duì)10 批熊膽粉樣品醋酸乙酯部位6 個(gè)共有峰，三氯甲烷部位8 個(gè)共有峰，丙酮部位8 個(gè)共有峰，乙腈部位10 個(gè)共有峰，乙醇部位16 個(gè)共有峰進(jìn)行PCA，計(jì)算得分圖，具體見(jiàn)圖9。S1～S3 產(chǎn)地是四川，在得分圖中為藍(lán)色點(diǎn)；S4～S7 產(chǎn)地是云南，在得分圖中是紅色點(diǎn)；S8、S9 產(chǎn)地是吉林，在得分圖中是紫色點(diǎn)；S10 產(chǎn)地是福建，在得分圖中是綠色點(diǎn)。

圖9 熊膽粉不同極性部位PCA 得分圖Fig.9 PCA score plot for different polar parts of Fel Ursi powder

從圖9 可知，醋酸乙酯部位S1～S3、S7、S8、S10 質(zhì)量相似，S5、S6 質(zhì)量相似，S4、S9 質(zhì)量相似；三氯甲烷部位S4～S6 質(zhì)量相似，S2、S3 質(zhì)量相似，S7、S8、S10 質(zhì)量相似，S1、S9 質(zhì)量相似；丙酮部位S1、S2、S4、S8、S10 質(zhì)量相似，S3、S6、S7 質(zhì)量相似，S5、S9 質(zhì)量相似，分別單獨(dú)一類；乙腈部位S1、S2、S6、S7、S10 質(zhì)量相似，S3、S8、S5 質(zhì)量相似，S4、S9 質(zhì)量相似，分別單獨(dú)一類；乙醇部位S1、S2、S6、S7 質(zhì)量相似，S5、S8 質(zhì)量相似，S4、S10 質(zhì)量相似，S3、S9 質(zhì)量相似，分別單獨(dú)一類。根據(jù)PCA 結(jié)果，可知相同產(chǎn)地的熊膽粉，受不同廠家加工方法不同的影響，也存在一定的質(zhì)量差異。此結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

2.6.3 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 為進(jìn)一步尋找對(duì)熊膽粉質(zhì)量產(chǎn)生影響貢獻(xiàn)較大的成分，采用SIMCA 14.1 軟件分別對(duì)5 個(gè)極性部位的指紋圖譜進(jìn)行OPLS-DA，得到變量重要性投影（variable important in project，VIP）值，結(jié)果見(jiàn)圖10。其中，醋酸乙酯模型自變量擬合指數(shù)RX2＝0.967，因變量擬合指數(shù)RY2＝0.957，模型預(yù)測(cè)指數(shù)Q2＝0.914；三氯甲烷模型RX2＝0.981，RY2＝0.791，Q2＝0.664；丙酮模型RX2＝0.965，RY2＝0.825，Q2＝0.739；乙腈模型RX2＝0.952，RY2＝0.824，Q2＝0.717；乙醇模型RX2＝0.945，RY2＝0.925，Q2＝0.917。

圖10 熊膽粉不同極性部位VIP 圖 (OPLS-DA)Fig.10 VIP value of different polar parts of Fel Ursi powder (OPLS-DA)

5 個(gè)極性部位的R2和Q2均超過(guò)0.5，表示模型擬合結(jié)果穩(wěn)定可靠。如圖10 所示，橫坐標(biāo)為共有峰編號(hào)，縱坐標(biāo)為VIP 值，VIP 值越高，對(duì)模型貢獻(xiàn)率越高，進(jìn)一步篩選VIP＞1 的共有峰：醋酸乙酯部位為1（?；切苋パ跄懰幔?、2（?；蛆Z去氧膽酸）、5（鵝去氧膽酸）號(hào)峰；三氯甲烷部位為1、3（?；切苋パ跄懰幔?、4（?；蛆Z去氧膽酸）號(hào)峰；丙酮部位為1、3（?；切苋パ跄懰幔?、4（牛磺鵝去氧膽酸）號(hào)峰；乙腈部位為1、2、4（?；切苋パ跄懰幔?、6（?；蛆Z去氧膽酸）號(hào)峰；乙醇部位為6（?；切苋パ跄懰幔?、10、13（熊去氧膽酸）、15（鵝去氧膽酸）號(hào)峰。結(jié)果表明，上述色譜峰所代表的化學(xué)成分分別是熊膽粉各極性部位質(zhì)量差異的標(biāo)志性成分。其中，?；切苋パ跄懰崾? 種極性部位共同的質(zhì)量差異標(biāo)志性成分。經(jīng)過(guò)200 次置換檢驗(yàn)，5 種極性溶劑模型Q2回歸線與縱軸的相交點(diǎn)均小于0，說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合，模型驗(yàn)證有效，認(rèn)為該結(jié)果可用于熊膽粉質(zhì)量差異的標(biāo)志性成分的篩選。

4 討論

中藥是由多種成分組成的復(fù)合體，HPLC 指紋圖譜的研究角度很多，是考察單一溶劑處理的提取物的指紋圖譜，掩蓋了不同極性部位指紋圖譜的差別[16-19]，本研究建立熊膽粉5 個(gè)極性部位HPLC 指紋圖譜，利用多種化學(xué)模式識(shí)別方法綜合分析不同極性部位的指紋圖譜信息[20-22]，更加客觀地反映熊膽粉內(nèi)在質(zhì)量，深入研究熊膽粉中化學(xué)成分分布情況，為其臨床用藥的合理性及進(jìn)一步的藥性研究提供研究依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)最初選取了石油醚、醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、無(wú)水乙醇、乙腈、無(wú)水甲醇、純化水、正丁醇9 種溶劑，以綠野廠家的熊膽粉為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)HPLC 法發(fā)現(xiàn)石油醚提取出來(lái)的化學(xué)成分極少，且無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、純化水、正丁醇4 種溶劑提取出來(lái)的化學(xué)成分相似，故只采用醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、無(wú)水乙醇、乙腈作為實(shí)驗(yàn)試劑。實(shí)驗(yàn)最初選用超聲法進(jìn)行熊膽粉有效成分的提取，對(duì)比回流提取，發(fā)現(xiàn)超聲提取的醋酸乙酯部位、丙酮部位、乙腈部位熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量明顯低于回流提取，故實(shí)驗(yàn)最終選用回流法進(jìn)行熊膽粉有效成分的提取。

通過(guò)對(duì)不同批次的熊膽粉不同極性溶劑提取物中的成分進(jìn)行了指紋圖譜方法考察，比較5 個(gè)指紋圖譜共有模式可清晰地觀察到不同極性部位的化學(xué)成分種類不同，且每個(gè)極性部位間化學(xué)成分含量差異明顯。10 批熊膽粉醋酸乙酯共有模式共標(biāo)記6 個(gè)共有峰，三氯甲烷共有模式共標(biāo)記8 個(gè)共有峰，丙酮共有模式共標(biāo)記8 個(gè)共有峰，乙腈共有模式共標(biāo)記10 個(gè)共有峰，乙醇共有模式共標(biāo)記16 個(gè)共有峰，5 個(gè)極性部位均指認(rèn)了4 個(gè)指紋峰（牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸）；采用5 種不同極性溶劑對(duì)熊膽粉進(jìn)行提取，不同溶劑提取所得的成分種類有所不同，分析不同極性部位的共有模式可知，3～5、7、8 號(hào)峰在5 種溶劑中均被提取出，而1、2 號(hào)峰在醋酸乙酯部位未被提取出，其峰主要來(lái)源于三氯甲烷、丙酮、乙腈、乙醇部位；6 號(hào)峰主要來(lái)源于醋酸乙酯、乙醇部位。

采用5 種不同極性溶劑對(duì)熊膽粉進(jìn)行提取，不同溶劑提取所得的成分含量差異明顯，按成分含量從高到低排序，醋酸乙酯部位依次為鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸，且熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的成分含量顯著大于?；切苋パ跄懰?、牛磺鵝去氧膽酸；三氯甲烷部位依次為牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸，且牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸的成分含量顯著大于熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸；丙酮部位依次為牛磺熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸，且?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、鵝去氧膽酸的成分含量顯著大于熊去氧膽酸；乙腈部位依次為?；蛆Z去氧膽酸、?；切苋パ跄懰?、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸，且?；蛆Z去氧膽酸的成分含量顯著大于?；切苋パ跄懰?、鵝去氧膽酸，熊去氧膽酸的含量最少；乙醇部位為?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸，且?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸的成分含量顯著大于熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸。

由此可見(jiàn)，在不同極性溶劑下，熊膽粉中所提取出的主要成分種類和含量也有所不同。在此條件下，可通過(guò)譜效關(guān)系的研究方法，將熊膽粉不同極性溶劑的指紋圖譜與藥理藥效結(jié)果進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，探究熊膽粉不同功效的質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker），從而為熊膽粉譜效關(guān)系的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

熊膽粉按產(chǎn)地劃分可分為東膽（東北）和南膽（云、貴、川），尤以云南產(chǎn)的品質(zhì)最佳。但是，對(duì)熊膽粉進(jìn)行聚類分析和PCA，發(fā)現(xiàn)即使是相同產(chǎn)地的熊膽粉，也存在一定程度上的質(zhì)量差異，不同產(chǎn)地的熊膽粉也會(huì)有質(zhì)量相近的情況。主要原因可能是不同廠家對(duì)熊膽汁引流加工的工藝不同[23-24]，從而產(chǎn)生質(zhì)量上的差異。現(xiàn)代生產(chǎn)的熊膽粉大多來(lái)源于養(yǎng)殖熊，因此，按產(chǎn)地條件來(lái)挑選野生熊膽粉的方法已不再科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。通過(guò)比較5 種不同溶劑提取的熊膽粉指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)不同極性部位的指紋圖譜差異較大，歸因于各廠家對(duì)熊膽汁引流加工的工藝不同。

對(duì)熊膽粉進(jìn)行OPLS-DA，發(fā)現(xiàn)熊膽粉質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分是牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、未知成分乙醇部位10 號(hào)峰、乙腈部位1、2 號(hào)峰。但哪些成分是熊膽粉主要功效的Q-Marker，仍有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)主要考察了熊膽粉不同極性部位指紋圖譜的差別，并確認(rèn)了各化學(xué)成分峰的歸屬，為熊膽粉譜效關(guān)系的研究提供一定依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突