汪朝云，陳琴，王筱雅，熊英，張金娟，張晴，馮占輝，葉蘭

（貴州醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院多媒體機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550025）

腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是指原發(fā)非創(chuàng)傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂，是臨床較為常見(jiàn)的腦血管疾病，其主要特點(diǎn)表現(xiàn)為病情危重、救治難度大、致殘率及致死率較高[1-3]。據(jù)研究報(bào)道，全球每10萬(wàn)人中就有10～20人會(huì)發(fā)生ICH，中國(guó)ICH患者占所有住院腦卒中患者的18.8%～47.6%[4-5]。在ICH的病理后遺癥中，因血腫引起的血腦屏障（blood brain barrier, BBB）破壞是主要問(wèn)題之一，在該病的病理生理改變中起著至關(guān)重要的作用。受到外界刺激時(shí)，血腦屏障損傷的標(biāo)志性蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9, MMP-9）表達(dá)增加，進(jìn)一步降解基底膜，促使血腦屏障緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、Occludin表達(dá)降低，使血腦屏障受到破壞?；谠摬〉膬措U(xiǎn)性及目前仍缺乏有效降低病死率和殘疾率的治療方案，本研究探索新型治療靶點(diǎn)和新藥物，對(duì)ICH的預(yù)防及治療具有重要的醫(yī)學(xué)意義。

GW0742是一種脂溶性高易透過(guò)血腦屏障的PPARβ/δ特異性激動(dòng)劑。近年來(lái)GW0742常用于多種中樞系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究。有研究報(bào)道，GW0742對(duì)缺氧缺血大鼠[6-7]、孤獨(dú)癥小鼠[8]、ICH模型小鼠[9]均有保護(hù)作用。基于以上研究背景，本文旨在探討GW0742對(duì)凝血酶誘導(dǎo)體外血腦屏障破壞產(chǎn)生的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取新生3～7日齡的SPF級(jí)SD大鼠若干（由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），每提取1次原代細(xì)胞取5只，雌雄均可。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2018-0001。

1.2 主要材料與試劑

胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（美國(guó)Thermo Fisher公司，2335473CP），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo Fisher公司，8121756），牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）（北京索萊寶科技有限公司，1218Q0511），胰蛋白酶（美國(guó)Thermo Fisher公司，8122140），磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京索萊寶科技有限公司，20210821），D-Hank's緩沖液（美國(guó)Thermo Fisher公司，20210416），青霉素-鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司，20211120），Ⅱ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司，525Z023），明膠（北京索萊寶科技有限公司），嘌呤霉素（北京索萊寶科技有限公司，1221S0435），兔抗大鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體（美國(guó)Thermo Fisher公司，337E3A24），抗兔熒光二抗（上海愛(ài)必信生物科技有限公司，A23D26），凝血酶（上海Sigma公司，SLBW2056），GW0742（美國(guó)MCE公司，20371），GFAP（美國(guó)Thermo Fisher公司，WI3380251），MMP-9抗體、ZO-1抗體、Occludin抗體（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，批號(hào)分別為：A0289、A11417、DF7504），高效RIPA裂解液(組織/細(xì)胞)（北京索萊寶科技有限公司，20210908），Pierce BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司，VK316403），PageRuler預(yù)染蛋白Marker（美國(guó)Thermo Fisher公司，00864849），PVDF微孔轉(zhuǎn)移膜（美國(guó)Millipore公司，R0BB23468）。

1.3 儀器

倒置相差顯微鏡（日本尼康，TS100），正置熒光顯微鏡（蘇州世達(dá)普通信設(shè)備有限公司，RX50），臺(tái)式大容量離心機(jī)（常州朗越儀器制造有限公司，TDL-40B），恒溫?fù)u床（山東歐萊伯儀器有限公司，THZ-82A），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司，2001HY-6003）。

1.4 方法

1.4.1 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelium cell, BMEC）的原代培養(yǎng) 取5只新生7日齡的SD大鼠，斷頭處死后浸泡于75%無(wú)水乙醇?xì)⒕? min，置于超凈工作臺(tái)，剪開(kāi)顱骨，取出大腦半球，置于裝有4 ℃預(yù)冷的D-Hank's緩沖液的培養(yǎng)皿中，去除小腦、間腦（包括海馬組織），保留大腦皮質(zhì)部，并將其置于無(wú)菌濾紙上來(lái)回滾動(dòng)，以除去軟腦膜及腦膜大血管等雜質(zhì)，保留大腦皮質(zhì)，依次用預(yù)冷的D-Hank's液、含雙抗的培養(yǎng)基、D-Hank's緩沖液洗滌1次，期間用巴氏吸管或移液槍反復(fù)吹打以除去部分血細(xì)胞、血凝塊及軟腦膜，再將大腦皮質(zhì)部轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中剪至約1 mm×1 mm×1 mm的白色肉泥狀，過(guò)100目細(xì)胞篩，收集網(wǎng)下濾液，1 000 r/min離心10 min，收集沉淀并滴加8 mL 0.1 % Ⅱ型膠原酶于37 ℃搖床下消化25 min，1 000 r/min離心5 min，去除上清液后，底部沉淀加入8 mL 20 % BSA，1 000 r/min離心10 min，收集上清液再次離心，離心3次，混合3次離心后所得沉淀，并用完全培養(yǎng)基混勻后接種于未處理的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1 h，后換用1 %明膠包被的50 mL培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5 %二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，其后全量換用含2 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再改用不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并每隔2 d換液1次，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，貼壁細(xì)胞為BMEC。

1.4.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte, AC）的原代培養(yǎng) 取新生3日齡SD大鼠5只，使用酒精消毒，在超凈臺(tái)下取出大鼠腦組織置于D-Hank's緩沖液中，使用眼科鑷輕輕去除大腦表面膜后，將大腦皮層分離出，放入DMEM/F12培養(yǎng)基中，使用剪刀將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的小組織塊；將組織塊轉(zhuǎn)移至離心管中，加入0.125%胰酶37 ℃消化15 min，每隔5 min輕輕搖晃促進(jìn)消化，消化結(jié)束后使用移液器輕輕將大腦皮層組織吹散，靜置30 s，上清用100目細(xì)胞篩過(guò)濾，1 500 r/min離心5 min；使用DMEM+10% FBS重懸細(xì)胞將細(xì)胞種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)瓶中，每隔3 d半量換液；培養(yǎng)7 d后，在搖床上200 r/min搖晃4 h，去除上清液，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，貼壁細(xì)胞為AC。

1.4.3 原代AC的鑒定 胰酶消化提取原代AC 5 min后，重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打，使之成為單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。根據(jù)需要選擇合適的細(xì)胞密度種于培養(yǎng)板內(nèi)，滴加細(xì)胞懸液時(shí)，需依據(jù)爬片大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置上滴加1滴培養(yǎng)基，然后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養(yǎng)板的張力黏合在一起，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。在培養(yǎng)板中培養(yǎng)好細(xì)胞后，吸出培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，5 min/次，然后加入預(yù)冷的4 %多聚甲醛，常溫固定10 min；除去多聚甲醛后，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，5 min/次；加入含適量Triton X-100的封閉液，封閉30 min，封閉結(jié)束后不用洗，直接上一抗；將GFAP抗體按1∶200比例稀釋在一抗稀釋液中，去除封閉液后，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；去除一抗，加入預(yù)冷的PBS，洗3次，5 min/次；將熒光二抗分別按照1∶400比例稀釋在二抗稀釋液中，去除PBS后，加入二抗，室溫避光孵育1 h，加入預(yù)冷的PBS，洗3次，5 min/次；加入DAPI溶液，室溫避光孵育10 min；去除DAPI，加入預(yù)冷的PBS，洗3次，5 min/次；加入防熒光淬滅溶液，于正置熒光顯微鏡下拍照，鑒定細(xì)胞。

1.4.4 體外BBB的構(gòu)建 分別構(gòu)建BMEC單層培養(yǎng)模型和BMEC+AC共培養(yǎng)模型，分為BMEC單層培養(yǎng)模型組、BMEC+AC共培養(yǎng)組及Blank組（只加培養(yǎng)基）。取原代培養(yǎng)傳至第2代的BMEC胰酶消化后，于Transwell小室上室接種BMEC，接種密度為5×106個(gè)/mL，下室只加培養(yǎng)基，構(gòu)建單層培養(yǎng)模型；取原代培養(yǎng)傳至第2代的BMEC和AC胰酶消化后，于Transwell小室上室接種BMEC，接種密度為5×106個(gè)/mL，下室接種AC，接種密度為5×106個(gè)/mL，構(gòu)建共培養(yǎng)模型；于Transwell小室上室、下室加入培養(yǎng)基，構(gòu)建Blank組；期間每2 d換液1次，培養(yǎng)5～8 d后檢測(cè)體外血腦屏障的通透性。

1.4.5 體外BBB通透性的檢測(cè) ①4 h滲漏試驗(yàn)：取構(gòu)建好的體外BMEC單層培養(yǎng)模型、BMEC+AC共培養(yǎng)模型及只加培養(yǎng)基的Blank組，將Transwell小室上室及下室的培養(yǎng)基吸盡，并用PBS沖洗3次后，分別于上室和下室加入0.5和1.5 mL的完全培養(yǎng)基，使上室和下室存在一定的液面差，并將其放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于4 h后觀察液面變化情況。②熒光素鈉通透性試驗(yàn)：配置不同濃度（0、0.2、2.0和20.0 μg/mL）熒光素鈉，于多功能酶標(biāo)儀下536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；取構(gòu)建好的體外BMEC單層培養(yǎng)模型、BMEC+AC共培養(yǎng)模型及只加培養(yǎng)基的Blank組，將Transwell小室的上室及下室的培養(yǎng)基吸盡，并用PBS沖洗3次后，于BBB單層培養(yǎng)、共培養(yǎng)及Blank組的上室加入含20 μg/mL熒光素鈉基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.5 mL，下室加入不含熒光素鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基1.5 mL，并分別于培養(yǎng)0.5、1.0、2.0 h吸取下室培養(yǎng)基各100 μL備用，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，于多功能酶標(biāo)儀下536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算熒光素鈉透過(guò)BBB的量。

1.4.6 體外ICH模型的構(gòu)建 取體外BBB共培養(yǎng)模型，分為Control組與ICH組，Control組加入完全培養(yǎng)基處理，ICH組加入40 u/mL凝血酶處理，分別處理12 h后，檢測(cè)通透性變化，方法同1.4.5。

1.4.7 給藥 取體外BBB共培養(yǎng)模型，將其分為Control組、ICH組，以及GW0742低、中、高劑量組（1.25、2.50、5.00 μmol/L）5個(gè)組，Control組加入完全培養(yǎng)基，ICH組、GW0742低、中、高劑量組中均加入40 u/mL的凝血酶，各組分別培養(yǎng)12 h后，Control組、ICH組加入完全培養(yǎng)基，低、中、高劑量組給予相應(yīng)劑量的GW0742，分別培養(yǎng)24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4.8 Western blotting檢測(cè)蛋白ZO-1、MMP-9、Occludin的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量各組蛋白，制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下快速封閉液封閉20 min后，加入β-actin一抗（1∶1 000）、ZO-1一抗（1∶1 000）、MMP-9一抗（1∶1 000）、Occludin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次，5 min/次，室溫孵育二抗2 h，TBST清洗3次，5 min/次，使用ECL曝光顯影，分析各組條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組計(jì)量資料的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料的比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng)

2.1.1 BMEC的原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的BMEC呈短梭型和多角形生長(zhǎng)，當(dāng)長(zhǎng)至第5天后長(zhǎng)成其典型的“鋪路石”狀。見(jiàn)圖1。

圖1 原代培養(yǎng)BMEC的生長(zhǎng)情況（倒置相差顯微鏡×100）

2.1.2 AC的原代培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 原代培養(yǎng)AC 7 d，第7天去除小膠質(zhì)細(xì)胞，原代AC的形態(tài)呈星形發(fā)散生長(zhǎng)，從胞體發(fā)出許多突起和分支；原代培養(yǎng)的AC經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，所提原代細(xì)胞確為AC，且其純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求（見(jiàn)圖2、3）。

圖2 原代培養(yǎng)AC的生長(zhǎng)情況（倒置相差顯微鏡×100）

圖3 原代AC的GFAP免疫熒光鑒定（正置熒光顯微鏡× 200）

2.2 體外BBB通透性的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 4 h滲漏試驗(yàn) 與Blank組比較，BMEC單層培養(yǎng)組能維持一定的液面差；與BMEC單層培養(yǎng)組比較，BMEC+AC共培養(yǎng)組能維持較好的液面差。通透性為：Blank組＞ BMEC單層培養(yǎng)組＞ BMEC+AC共培養(yǎng)組。見(jiàn)圖4。

圖4 4 h滲漏試驗(yàn)

2.2.2 熒光素鈉通透性試驗(yàn) Blank組、BMEC單層培養(yǎng)組及BMEC+AC共培養(yǎng)組熒光素鈉滲透濃度在0.5、1.0和2.0 h時(shí)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，與Blank組比較，BMEC單層培養(yǎng)組熒光素鈉滲透濃度降低，通透性降低（P＜0.05）；與BMEC單層培養(yǎng)組比較，BMEC+ AC共培養(yǎng)組熒光素鈉滲透濃度降低，通透性降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1和圖5。

表1 培養(yǎng)0.5、1.0和2.0 h時(shí)各組熒光素鈉的滲透濃度比較 （μg/mL，±s）

表1 培養(yǎng)0.5、1.0和2.0 h時(shí)各組熒光素鈉的滲透濃度比較 （μg/mL，±s）

注：①與Blank組比較，P＜0.05；②與BMEC單層培養(yǎng)組比較，P＜0.05。

0.5 h 10.0±0.178 6.88±0.368①2.33±0.933②129.000 0.000組別Blank組BMEC單層培養(yǎng)組BMEC+AC共培養(yǎng)組F 值P 值1.0 h 11.0±0.611 8.67±0.254①4.58±1.04②63.300 0.000 2.0 h 11.9±0.149 9.93±0.855①7.51±0.892②29.100 0.000

圖5 熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線及熒光素鈉滲透濃度比較

2.3 體外ICH模型的通透性評(píng)價(jià)

2.3.1 4 h滲漏試驗(yàn) 與Control組比較，ICH組液面差降低，通透性增加（見(jiàn)圖6）。

圖6 體外BBB雙層模型及體外ICH模型的滲漏性試驗(yàn)

2.3.2 熒光素鈉通透性試驗(yàn) Control組的熒光素鈉的滲透濃度與ICH組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Control組比較，ICH組在0.5、1.0和2.0 h時(shí)，熒光素鈉滲透濃度增加，通透性增加。見(jiàn)表2和圖7。

表2 兩組熒光素鈉的滲透濃度比較 （μg/mL，±s）

表2 兩組熒光素鈉的滲透濃度比較 （μg/mL，±s）

注：?與Control組比較，P＜0.05。

組別Control組ICH組t 值P 值2 h 7.51±0.89 10.3±0.61?20.100 0.011 0.5 h 2.33±0.93 4.74±0.57?14.500 0.018 1 h 4.58±1.04 9.29±0.49?50.600 0.002

圖7 Control組與ICH模型組通透性比較

2.3.3 形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)12 h后，與Control組比較，ICH組的緊密連接結(jié)構(gòu)明顯被破壞，細(xì)胞形態(tài)改變（紅色箭頭所示）。見(jiàn)圖8。

圖8 Control組與ICH組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡×100）

2.4 藥效研究結(jié)果

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，與Control組比較，ICH組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)明顯皺縮、拉長(zhǎng)；與ICH組比較，給藥組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯皺縮、拉長(zhǎng)，呈劑量依賴。見(jiàn)圖9。

圖9 給藥后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 （倒置相差顯微鏡×100）

2.4.2 各組ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 Control組、ICH組、GW0742低、中、高劑量組的ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，與Control組比較，ICH組MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），ZO-1、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與ICH組比較，GW0742高劑量組MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），ZO-1、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖10。

表3 各組ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：①與Control組比較，P＜0.05；②與ICH組比較，P＜0.05。

組別Control組ICH組GW0742低劑量組GW0742中劑量組GW0742高劑量組F 值P 值Occludin蛋白1.02±0.054 0.579±0.082①0.610±0.073 0.718±0.041 0.801±0.070②22.400 0.000 ZO-1蛋白0.833±0.142 0.429±0.140①0.541±0.086 0.697±0.025②0.734±0.103②6.610 0.007 MMP-9蛋白0.515±0.079 0.779±0.069①0.754±0.076 0.738±0.025 0.533±0.023②13.200 0.001

圖10 各組ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白表達(dá)

3 討論

ICH是一種較為嚴(yán)重的腦血管疾病，致殘率和致死率均較高[10]。而在ICH的幾種病理后遺癥中，血腫引起B(yǎng)BB的破壞是主要問(wèn)題之一，在該病的病理生理改變中起著至關(guān)重要的作用。ICH發(fā)生后，血液成分進(jìn)入大腦，激活先天和獲得性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致各種細(xì)胞因子、趨化因子、自由基及其他潛在有毒化學(xué)物質(zhì)的釋放[11]；在這些分子共同作用下，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷，表現(xiàn)為BBB完整性受損、鄰近組織破壞，以及細(xì)胞死亡[12]；而血腦屏障的破壞又導(dǎo)致組織滲出、神經(jīng)元壞死和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重腦水腫[13]。因此，深入探討并研究ICH后血腦屏障破壞的繼發(fā)性損傷機(jī)制及相關(guān)治療藥物可能為ICH的防治提供新的思路。

血腦屏障主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞組成，其中腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的主要組成部分，而腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與其他外周血管內(nèi)皮細(xì)胞不同的是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞主要由緊密連接蛋白將腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接在一起，形成了這一特殊屏障，因此，當(dāng)血腦屏障受到破壞時(shí)，血腦屏障打開(kāi)，緊密連接蛋白會(huì)相應(yīng)發(fā)生改變，如ZO-1、Occludin、Claudin蛋白會(huì)相應(yīng)下調(diào)，血腦屏障損傷的標(biāo)志蛋白MMP-9會(huì)相應(yīng)上調(diào)。

凝血酶是ICH后凝血瀑布被激活所釋放的一種酶，凝血酶可以參與ICH所致的損傷，同時(shí)也可作用于多種類(lèi)型的細(xì)胞，包括腦內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞，并能導(dǎo)致血腦屏障破壞和腦水腫形成；凝血酶在ICH后除參與凝血外，同時(shí)也是一種促炎因子和神經(jīng)毒性介質(zhì)，體外高濃度可抑制神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，將大劑量凝血酶直接注入腦內(nèi)會(huì)引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間充質(zhì)細(xì)胞增殖、瘢痕形成、腦水腫形成和癲癇發(fā)作。因此為模擬ICH的病理生理過(guò)程，選擇在體外血腦屏障模型構(gòu)建成功后加入40 u/mL凝血酶來(lái)模擬體外ICH細(xì)胞模型。

GW0742是一種特異性的PPARβ/δ激動(dòng)劑，近年來(lái)其在多種中樞疾病中均有研究，如缺氧缺血、孤獨(dú)癥、ICH動(dòng)物疾病模型中均有報(bào)道。因此更為深入地研究探討其對(duì)ICH的作用是必要的，本研究旨在利用原代提取的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞于體外構(gòu)建血腦屏障模型，待血腦屏障模型構(gòu)建成功后以40 u/mL凝血酶處理12 h模擬體外ICH模型，后給予GW0742，研究GW0742是否對(duì)ICH所致血腦屏障破壞具有保護(hù)作用，以期為后續(xù)ICH研究治療提供依據(jù)。通過(guò)體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，ICH后血腦屏障損傷的標(biāo)志蛋白MMP-9表達(dá)升高，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá)下降；給予GW0742后，血腦屏障損傷的標(biāo)志蛋白MMP-9表達(dá)下降，Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)升高，改善了由凝血酶誘導(dǎo)的血腦屏障破壞情況；因此推測(cè)GW0742能對(duì)ICH所致血腦屏障破壞具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與其抑制MMP-9的過(guò)度表達(dá)及促進(jìn)了緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本文通過(guò)原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體外血腦屏障，并以40 u/mL凝血酶模擬體外ICH模型促使血腦屏障破壞，后給予GW0742治療，結(jié)果表明GW0742對(duì)ICH所致血腦屏障破壞具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與其抑制MMP9的過(guò)度表達(dá)及促進(jìn)緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá)有關(guān)。