卞 華, 曹 瑩, 葛 宇

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院1,上海 200233) (上海市獸藥飼料檢測所2,上海 201103)

黃霉素(Flavomycin)為磷酸化多糖類強極性抗生素, 主要由灰綠鏈霉菌厭氧發(fā)酵而成[1-3],只溶于水和甲醇等小分子溶劑中。黃霉素的抗菌作用機理是通過干擾細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)肽聚糖的生物合成,從而抑制細(xì)菌的繁殖[4];黃霉素的促生長原理在于它能提高飼料中能量和蛋白質(zhì)的消化,能使腸壁變薄,從而促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,有效提高飼料的利用率[5]。同時,黃霉素抗菌譜較窄, 主要對革蘭氏陽性菌有效,不容易與別類抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性[6-8],曾一度被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)品飼料中。研究表明,長期服用黃霉素類藥物對人的骨骼發(fā)育會有嚴(yán)重影響,甚至?xí)a(chǎn)生造血功能障礙[9,10]。2005年歐盟農(nóng)業(yè)部長會議[11]決定, 黃霉素等4種抗生素自2006年起禁止使用。日本肯定列表(Japan Positive List System)和美國環(huán)境保護局(EPA)等部門也相繼出臺了禁用規(guī)定。目前我國檢驗檢疫部門已將黃霉素列為飼料和動物源性食品殘留監(jiān)控計劃[12]。

黃霉素為多組分混合物,主要由5種活性成分黃霉素A、黃霉素A12、黃霉素C1、黃霉素C3、黃霉素C4組成,其化學(xué)特性和抗菌活性均十分相似。其中,黃霉素A為最突出的活性組分。然而黃霉素混合物的純度不高,5種活性成分的分離成本極大,無法得到各自單獨的標(biāo)準(zhǔn)品。迄今為止,黃霉素檢測技術(shù)的發(fā)展并不理想,全球有關(guān)黃霉素檢測的研究中均僅測定黃霉素A的含量,結(jié)果并不準(zhǔn)確。我國《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中也僅規(guī)定,可以通過檢測黃霉素A的含量間接監(jiān)控基質(zhì)中黃霉素物質(zhì)的添加量[13,14]。

黃霉素檢測方法包括:微生物法[15,16]、高效液相色譜法[17,18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19]和超高效液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜法[20]等。其中,微生物法屬于篩選法,定量不準(zhǔn)確,并且缺乏特異性;高效液相色譜法(HPLC)具有更好的特異性,在特定的波長下能夠準(zhǔn)確測定黃霉素的不同成分,但是其檢出限較高,無法測定低含量的基質(zhì);液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有高選擇性、高精確度、高通量的獨特優(yōu)勢,能精確測定基質(zhì)中黃霉素A的含量,但因5類物質(zhì)碎片離子的分子量相近,無法準(zhǔn)確分離5種黃霉素活性成分,結(jié)果會有一定的誤差;液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜法(LC-Q-TOF-MS)可以對不同組分的精確分子量與特征碎片進行有效分離和定性分析,但無法準(zhǔn)確定量。至今為止,各種檢測方法都有一定的局限性。在全球范圍中,均沒有關(guān)于黃霉素權(quán)威性的標(biāo)準(zhǔn),國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)體系中也沒有黃霉素相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布。

因此,本實驗參考了國內(nèi)外文獻,根據(jù)不同類別飼料基質(zhì)的特性,對前處理方法進行了研究,利用通透式固相萃取技術(shù),結(jié)合高效液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的特點,探索能同時滿足黃霉素各活性成分均充分分離的方法,并準(zhǔn)確測定黃霉素A的含量,經(jīng)高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜確認(rèn)檢測結(jié)果中黃霉素A的唯一性后,最終利用面積歸一化法精確折算出基質(zhì)中黃霉素的總殘留量。該方法選擇性強、靈敏度高,重復(fù)性好,可為飼料基質(zhì)中黃霉素總含量檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

黃霉素固體標(biāo)準(zhǔn)品(11015-37-5, 92%)。折算后,將黃霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度配制為1 000.0 μg/mL,黃霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液質(zhì)量濃度配制為100.0μg/mL(現(xiàn)配現(xiàn)用)。甲醇、乙腈(色譜純);甲酸、氨水(色譜純);乙酸銨(分析純);甲酸銨(分析純)。Oasis PRiME HLB 6cc/200 mg。

e2695 Separations Module液相系統(tǒng),2998 PDA detector檢測器,XEVO TQ-XS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,電噴霧離子源(ESI),AcquityR UPLC H-CLASS 液相色譜系統(tǒng),SYNAPT XS High Resolution Mass Spectrometer四級桿,Synapt HDMS質(zhì)譜分析系統(tǒng),MSZO 204S型電子天平,JM-03D-40超聲波清洗機,D-91126多管渦旋振蕩器,Centrifuge 5804高速離心機,Preekem-N1全自動氮吹濃縮儀,Milli-Q超純水系統(tǒng)。

1.2 試樣處理

提取:稱取試樣5 g (準(zhǔn)確至0.01 g),置于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入25 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸甲醇溶液,渦旋振蕩5 min,超聲10 min,在10 000 r/min離心機上,離心5 min,取上清液置于50 mL容量瓶中,重復(fù)步驟,合并上清液,用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸甲醇溶液定容至刻度。

凈化:吸取10 mL提取液至Oasis PRiME HLB通透式固相萃取小柱中,減壓過濾并保持流速為1～2滴/s,直接收集過濾液。取1 mL凈化后的過濾液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 面積歸一法(供高效液相色譜分離)

將黃霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(100 μg/mL)用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,用于測定標(biāo)樣中各活性成分的峰面積。

1.3.2 基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量)

將黃霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液100 μg/mL用甲醇逐級配制成質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,稱取與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品5.0 g,分別加入各標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0.5 mL,與試樣同時提取和凈化。

1.4 色譜條件

1.4.1 高效液相色譜

色譜柱:DiKMA Platisil 5 μm ODS, 250.0 mm×4.6 mm;柱溫:35 ℃;進樣體積:20 μL;流動相體積比:20 mmol/L乙酸銨溶液(甲酸調(diào)節(jié)pH 至5.0)∶乙腈=55∶45;紫外檢測器:258 nm。

1.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

液相色譜條件:色譜柱: Atlantis T3(100.0 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫:35 ℃;進樣體積:10 μL。流動相A:5 mmol/L 乙酸銨溶液(pH 5.0);流動相B:乙腈;流速0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0.0～1.0 min,10%B;1.0～1.1 min,10%B～95%B;1.1～4.0 min,95%B;4.0～4.1 min,95%B～10%B,4.1～7.0 min,10%B,質(zhì)譜儀器條件:電噴霧負(fù)離子模式(ESI-),多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管壓力:3.0 kV;椎孔電壓:40 V;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:550.0 ℃;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;反吹氣流速:150 L/h;碰撞氣流速:0.15 mL/min;霧化氣壓力:0.7 MPa。母離子、子離子、去簇電壓(DP)、碰撞氣能量(CE),見表1。

表1 黃霉素A化合物的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

黃霉素為強極性弱酸性混合物,在反相柱上不易保留。普通改良的C18色譜柱并不適用于黃霉素混合物。黃霉素C1、黃霉素C3、黃霉素C4幾乎沒有得到有效的分離,并且,黃霉素A12與黃霉素A被同時洗脫,形成很強的前伸效應(yīng),導(dǎo)致峰形很寬。結(jié)果表明,黃霉素混合物能在更適合酸性鹽流動相體系下的鉑金柱DIKMA Platisil 5 μm ODS, 250.0 mm×4.6 mm中得到較好的分離,提供更好的峰型(圖1),其可能與鉑金柱中去活化的酸性游離硅羥基固定相對5種活性組分在四氫吡喃基團上不同的R1、R2、R3基團有不同的分子間作用力(表2),從而產(chǎn)生了不同的分離結(jié)果。

圖1 黃霉素混合物的高效液相色譜分離圖

表2 黃霉素活性成分的結(jié)構(gòu)信息

2.1.2 流動相的確定

以DB32/T 1279—2008[21]標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù),將20 mmol/L甲酸銨和乙酸銨分別作為預(yù)選水相,乙腈和甲醇作為預(yù)選有機相。實驗表明,甲酸銨和乙酸銨均屬于弱酸弱堿鹽,陰離子和陽離子均水解,水溶液顯中性,無法分離得到目標(biāo)物,需要將溶液環(huán)境用甲酸調(diào)整到pH 5.0后能得到較明顯的目標(biāo)峰。通常,在pH 3.5～5.5時,相同濃度的乙酸銨-酸溶液比甲酸銨-酸溶液緩沖能力略強,最終選擇20 mmol/L乙酸銨為水相。同時,當(dāng)有機相采用甲醇時,目標(biāo)物的保留時間都更早,導(dǎo)致黃霉素A12與黃霉素A,黃霉素C3與黃霉素C4都包裹在一起,乙腈的極性相對較弱,更適合于黃霉素混合物的分離。

另外,當(dāng)有機相的比例大于48%時,黃霉素A12與黃霉素A分離效果理想,但黃霉素C1、黃霉素C3、黃霉素C4的出峰時間明顯前移,與主峰黃霉素A同時被洗脫;當(dāng)有機相的比例小于43%時,黃霉素A12會延后,同樣會與黃霉素A同時被洗脫。最終,當(dāng)有機相的比例為45%時,能得到最清楚和最穩(wěn)定的分離結(jié)果。5個化合物在6次平行性實驗得出保留時間的偏差在0.16 s以內(nèi)。

2.1.3 黃霉素標(biāo)準(zhǔn)品各組分含量的確定

根據(jù)國內(nèi)外飼料生產(chǎn)企業(yè)所提供的信息,在黃霉素被廣泛使用時,主要由4家公司制備合成黃霉素類抗生素。利用高效液相色譜條件測定黃霉素標(biāo)樣(50 μg/mL),分離后的黃霉素各活性組分經(jīng)面積歸一化法和統(tǒng)計模型加權(quán)平均后(表3),得出黃霉素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.2%,RSD為0.66%。值得一提的是,黃霉素雜質(zhì)峰在258 nm處的光譜圖均與黃霉素主要活性成分的光譜圖不符(圖1),已在配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液時進行了折算,不在研究考慮范圍之內(nèi),不納入面積歸一法中進行計算。

表3 黃霉素A在不同黃霉素標(biāo)準(zhǔn)品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=6)

2.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

黃霉素極性較強,普通的C18柱子容易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響,峰形不理想。Atlantis?T3色譜柱使用高純度硅膠及雙鍵鍵合C18技術(shù),并對填料的孔徑大小、端基封口以及 C18的鍵合密度進行優(yōu)化,從而使色譜柱具有對黃霉素A保留能力強,對低pH條件下的色譜十分有利,能保證黃霉素A具有良好的分離穩(wěn)定性,色譜柱峰形尖銳對稱,靈敏度更高,保留時間也更適合。

研究分別選取乙腈、甲醇作為備選有機相,以超純水、體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水為備選水相,流動相兩兩配比。結(jié)果表明甲醇和乙腈作為有機相,都能較好地分離出黃霉素A,但乙腈相對于甲醇,系統(tǒng)整體的柱壓下降了13%,目標(biāo)峰的保留時間也更為穩(wěn)定。在負(fù)離子模式下,微量的氨水可以提供ESI源在Q1四極桿內(nèi)離子化所需的負(fù)離子,從而提高離子化效率,得到更好的色譜峰形和更高的靈敏度[22]。但本實驗發(fā)現(xiàn),在高pH值的流動相環(huán)境下,黃霉素A的響應(yīng)值反而降低,主要與黃霉素呈弱酸性有關(guān)。相反,實驗同樣嘗試了pH 5.0的5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相,其使得黃霉素A的離子峰形更加尖銳,響應(yīng)也更高。

黃霉素是以黃霉素A(C69H108N5O34P)、黃霉素A12(C68H106N5O34P)、黃霉素C1(C62H96N5O28P)、黃霉素C3(C63H98N5O28P)、黃霉素C4(C63H98N5O29P)為主的多組分混合物?？紤]到5種活性成分的分子質(zhì)量均在1 000 u以上,將配制的質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的黃霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液通過注射泵注入質(zhì)譜儀中進行一級質(zhì)譜全掃描(分子量掃描范圍:50～2 000 u),黃霉素在電離過程中產(chǎn)生2個明顯的母離子,分別為[M-2H]2-m/z1 580.7和[M-2H]2-m/z789.9,其中[M-2H]2-m/z789.9的響應(yīng)遠高于[M-2H]2-m/z1 580.7(圖2),因此在質(zhì)譜優(yōu)化過程中以[M-2H]2-m/z789.9作為黃霉素的母離子。根據(jù)文獻可知,[M-2H]2-m/z789.9為黃霉素A的母離子,因此實驗利用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜主要測定黃霉素混合物中黃霉素A的含量。

同樣地,將母離子[M-2H]2-m/z789.9進行二級質(zhì)譜全掃描(分子質(zhì)量掃描范圍:50～800 u),只找到了2對離子[M-2H]2-m/z789.9/553.9和[M-2H]2-m/z789.9/575.9,且2個通道幾乎都沒有雜質(zhì)干擾(圖2)。因此實驗對2對離子進行CE優(yōu)化,并選取相對豐度較高且穩(wěn)定的特征碎片離子[M-2H]2-m/z789.9/575.9作為定量離子,[M-2H]2-m/z789.9/553.9作為定性離子對,以滿足歐盟657/2002/CE指令對禁用藥物定性檢測的規(guī)定,即滿足1個母離子和至少2個子離子共4個識別點數(shù)的要求[23]。圖3為黃霉素A的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖。

圖2 黃霉素標(biāo)樣的一級掃描和二級全掃描質(zhì)譜圖

圖3 黃霉素A的TIC和MRM色譜圖(100.0 ng/mL)

另外,為了驗證黃霉素A的色譜分離具有唯一性,不受其他組分的影響。實驗還利用LC-Q-TOF-MS高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜儀在相同的流動相條件下研究了黃霉素混合物的分離結(jié)果。最終發(fā)現(xiàn),黃霉素A在9.087min保留,此時無其他黃霉素活性成分(圖4)。由上而下依次為8.933 min處黃霉素A12[M-2H]2-m/z1 567.6/782.8的母離子全掃圖;9.087 min處黃霉素A [M-2H]2-m/z1 581.6/789.9的母離子全掃圖;9.606 min處黃霉素C1[M-2H]2-m/z1 389.6/693.8的母離子全掃圖;9.995 min處黃霉素C3[M-2H]2-m/z1 403.6/700.8的母離子全掃圖;10.279 min處黃霉素C4[M-2H]2-m/z1 419.6/708.8的母離子全掃圖。LC-Q-TOF-MS能較好地分離5種活性成分,但定量的穩(wěn)定性卻不是很理想,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在16%以上。

圖4 黃霉素混合物在超高分辨質(zhì)譜儀中分離的結(jié)果(100.0 ng/mL)

2.2.2 提取條件的選擇

通過對黃霉素A分子結(jié)構(gòu)的研究,可知其僅溶于水和低分子醇。實驗考察了甲醇和甲醇/水對飼料基質(zhì)加標(biāo)樣品回收率的影響(禽濃縮飼料、禽配合精飼料、禽添加劑預(yù)混合飼料、畜濃縮飼料、畜配合精飼料、畜添加劑預(yù)混合飼料)。結(jié)果表明,當(dāng)提取溶劑為甲醇,6種基質(zhì)提取效率均較高,接近80%,而甲醇/水提取效率較低(見表4)?？赡苁且驗辄S霉素為弱酸性物質(zhì),水為弱電離介質(zhì),水中的羥基對黃霉素A的作用力要遠小于甲醇中的羥基。實驗進一步考查了體積分?jǐn)?shù)10%氨化甲醇溶液和0.1%甲酸甲醇溶液對于黃霉素A回收率的影響。0.1%甲酸甲醇溶液有助于提升黃霉素A的回收率,甲酸除了能降低提取液的pH值,還具有協(xié)助甲醇沉淀蛋白類雜質(zhì)的作用,可以進一步降低基質(zhì)效應(yīng)。另外,考慮到黃霉素A在電離過程中會失去電子,本實驗嘗試用10%氨化甲醇溶液作為提取液,但回收率有一定的下降,這是因為氨化甲醇作為提取液更適用于肉制品基質(zhì)中黃霉素A的提取[24,25],對于基質(zhì)更為復(fù)雜的飼料基質(zhì)來說,氨水提取時,會造成飼料黏糊成小顆粒,降低提取回收率的同時,影響結(jié)果的穩(wěn)定性。因此,實驗最終選擇10%甲酸甲醇溶液作為提取劑。

表4 不同提取劑對6種飼料基質(zhì)中黃霉素A提取回收率的影響(n=6)

2.2.3 凈化條件的確定

基質(zhì)經(jīng)過0.1%甲酸甲醇提取后,吸取10 mL上清液,選擇C18、Oasis HLB, Oasis PRiME HLB和氨基Amino-NH2固相萃取小柱進行凈化條件考察(飼料基質(zhì)中,抗生素的添加含量通常較高,無需濃縮)。由表5可見,只有Oasis PRiME HLB固相萃取對于黃霉素A的回收率有一定的提升作用。

利用普通C18和Oasis HLB凈化提取液,得到的黃霉素A回收率均有一定的下降,無法充分地去除雜質(zhì)。主要由于黃霉素A用甲醇提取,而常用的SPE(Solid-Phase Extraction)通常用強極性溶劑(如甲醇)洗脫,導(dǎo)致目標(biāo)物大多在上樣時沒有保留。另外,在洗脫過程中,因為飼料基質(zhì)的復(fù)雜性,導(dǎo)致SPE柱經(jīng)常堵塞,對結(jié)果的穩(wěn)定性也有一定的影響。而Oasis PRiME HLB能有效地將雜質(zhì)保留在填料中,其通過篩板、填料以及制作工藝上的特殊設(shè)計,使樣品經(jīng)提取后直接過柱凈化、收集,將黃霉素A在凈化過程中的損失降低到了最低。6種基質(zhì)的總體回收率上升了1.6%,特別能將添加劑預(yù)混合飼料基質(zhì)的回收率提升至80%左右。同時,整個凈化過程較為穩(wěn)定,樣品更加潔凈,基質(zhì)效應(yīng)更小;Amino-NH2適合于極性化合物,弱陰離子交換萃取,但對于黃霉素A的保留結(jié)果也不理想,并且伴有較強的基質(zhì)效應(yīng)。因此,本實驗選用Oasis PRiME HLB固相萃取作為凈化方式。

表5 不同凈化條件對飼料中黃霉素A的提取效率的影響(n=6)

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 檢出限、定量限和線性關(guān)系

飼料基質(zhì)復(fù)雜,本實驗選擇畜用(牛)和禽用(雞)各3類基質(zhì)的空白樣品作為考察對象。在空白基質(zhì)中添加一定濃度的黃霉素對照品,按照該方法進行測定。在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上,依據(jù)定量離子信號與噪聲比例,即s/n≥3的含量為檢出限(LOD),s/n≥10的含量為定量限(LOQ)的原則,確定質(zhì)譜方法的檢出限為100 μg/kg,定量限為250 μg/kg。黃霉素A在10.0～1 000.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。其中,畜濃縮飼料基質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 8,線性方程為Y=246.899X+1 164.82。圖5為(牛)預(yù)混飼料基質(zhì)的空白和加標(biāo)總離子流圖。

注:加標(biāo)水平:5 LOQ。圖5 (畜)預(yù)混料基質(zhì)色譜圖

2.3.2 回收率和精密度

選取畜和禽的空白基質(zhì)進行為期1個月的加標(biāo)回收率及精密度實驗,樣品分別添加低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(6基質(zhì)×6平行×4批次)。不同飼料基質(zhì)中黃霉素A的平均加標(biāo)回收率為69.69%～88.60%,RSD為0.96%～3.38%。

由表6可知,濃縮飼料基質(zhì)的回收率結(jié)果較為理想,回收率較高,穩(wěn)定性也較強。濃縮飼料的顆粒較大,比表面積較小,目標(biāo)物更容易被有機溶劑提取[26];基質(zhì)相對復(fù)雜的添加劑預(yù)混合飼料為一種或多種微量組分與稀釋劑或載體按要求配比,均勻混合后制成的中間型配合飼料產(chǎn)品。添加劑預(yù)混合飼料顆粒最細(xì),目標(biāo)物通常較難被提取,基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致禽類和畜類基質(zhì)整體的回收率均偏低,約3%;配合精飼料主要由能量飼料和蛋白質(zhì)飼料組成,基質(zhì)本身最為復(fù)雜,其中的顆粒大小不同,但平均比表面積較小[27]。因此,配合精飼料與添加劑預(yù)混合飼料的平均回收率沒有顯著差異,但配合精飼料結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更小,結(jié)果更為穩(wěn)定。實驗結(jié)果均滿足食品質(zhì)量規(guī)范技術(shù)要求,因此可以說明本方法的準(zhǔn)確性和精密度均較為理想,能夠滿足黃霉素精確定量的檢測要求。

表6 不同飼料基質(zhì)中黃霉素A及其折算后黃霉素的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 結(jié)論

黃霉素A在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定下的線性范圍為10.0～1 000.0 ng/mL,基質(zhì)曲線線性相關(guān)性均良好,線性相關(guān)系數(shù)均>0.998 6。各飼料基質(zhì)的最低檢出限為100 μg/kg,定量限為250 μg/kg,加標(biāo)回收率在69.69%～88.60%之間,RSD在0.96%～3.38%之間。同時,黃霉素5種活性成分可以通過高效液相色譜法分離而得,經(jīng)面積歸一化法可知黃霉素A的所占比例為86.2%,RSD為0.66%,實驗結(jié)果穩(wěn)定,可以用黃霉素A來折算黃霉素的含量,最終得出各類飼料基質(zhì)中,黃霉素類抗生素殘留量的回收率在80.66%～102.55%之間。結(jié)果符合《獸藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》和GB/T 23182—2008相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。因此,該方法適用于常用飼料中黃霉素的測定,對黃霉素總殘留量檢測在飼料領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的制定具有較高的參考價值。

致謝

感謝農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管司和上海市食品質(zhì)量安全檢測與評價專業(yè)技術(shù)平臺對本實驗的支持,感謝農(nóng)業(yè)部委員會專家對本實驗方法的認(rèn)可和優(yōu)化意見,并感謝上海市獸藥飼料檢測所的專家和美國普渡大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的教授對本實驗的指導(dǎo)和建議。