張 順, 惠哲哲, 王宏亮, 楊 瑞, 梁 犇, 楊駿鵬,邱 瑩, 宋鳳敏, 劉存芳, 高艷紅, 史 娟

(陜西省催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,漢中 723001)

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多酚類化合物。近年來,多酚類物質(zhì)的生物活性及對人體的保健預(yù)防作用日益受到人們的關(guān)注,其清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)氧化、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病、防癌、抗輻射等生物活性功能的發(fā)現(xiàn),使多酚的研究和應(yīng)用越來越受到重視。據(jù)報道,抗癌防癌物中最有希望的一類植物化學(xué)物質(zhì)即是多酚類抗氧化劑[1]。在全球老齡化與亞健康普遍化的當(dāng)下,富含植物活性成分的保健品具有較為廣闊的市場前景。利用植物多酚對人體的多種生理活性,將其開發(fā)為保健食品,食品添加劑、風(fēng)味食品添加劑、風(fēng)味劑成為綠色保健品的開發(fā)熱點(diǎn)[2]。

廣玉蘭為木蘭科、木蘭屬常綠喬木[3]。其葉和花含有多種揮發(fā)油、木蘭堿、黃酮類、酚類等化學(xué)成分,常用于日常頭痛腹瀉、風(fēng)寒嘔吐、高血壓、偏頭疼等[4,5]。近年來,超聲波技術(shù)多應(yīng)用于植物中多酚、黃酮、多糖、皂苷、香豆素等生物活性物質(zhì)的提取。與常規(guī)提取方法相比,超聲波提取方法能提高有效成分的溶出速度、縮短提取時間、節(jié)省溶劑的消耗、提出率高[6]。目前,利用超聲技術(shù)對玉蘭葉中多酚的提取及其抗氧化性能的研究還鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波技術(shù)提取玉蘭葉中的多酚,設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)考察料液比、提取時間、提取溫度等對其多酚提取率的影響,并采用四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝[7-9]。并在此基礎(chǔ)上研究其抗氧化性能及穩(wěn)定性,旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用廣玉蘭資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:廣玉蘭葉(采摘于陜西理工大學(xué)南校區(qū))。

試劑:葡萄糖、沒食子酸、福林酚試劑、硫酸亞鐵、VC、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、水楊酸、氯酸鐵、氯酸鉀、DPPH、廣玉蘭葉、濃鹽酸、碘化鉀、可溶性淀粉、乙醚、無水乙醇、冰乙酸、三氯甲烷、酚酞、氫氧化鉀、硫代硫酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備和儀器

AR124CN電子天平,HHS電熱恒溫水浴鍋,UV-2600紫外可見分光光度計(jì),HG71電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,SB25-12 DTD超聲波清洗機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多酚含量的測定

采用福林酚法測定玉蘭葉多酚的含量,測得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:

A=0.108 64C+0.105 11,R2=0.993 12

式中:A為沒食子酸的吸光度;C為沒食子酸的質(zhì)量濃度。

1.3.2 多酚的提取與檢測

將廣玉蘭葉在烘箱中60 ℃烘干,粉碎過60目篩裝袋備用。準(zhǔn)確稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末,加入提取溶劑乙醇,在超聲波清洗儀中設(shè)定溫度進(jìn)行超聲波提取后,常壓過濾,濾液收集于100 mL容量瓶中,用提取溶劑乙醇定容[10]。取1 mL該樣液于25 mL容量瓶中,并用提取溶劑定容,即為待測樣品溶液。廣玉蘭葉中多酚的檢測:取適當(dāng)濃度的樣品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加入5.0 mL體積分?jǐn)?shù)9.8%福林酚,搖勻反應(yīng)5～7 min,加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.7% Na2CO3溶液,搖勻靜置1 h,于765 nm波長下檢測吸光度值,同時以1.0 mL提取溶劑代替樣品溶液作為空白對照[11]。根據(jù)測得的吸光度值按標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程計(jì)算樣品溶液中總多酚濃度,進(jìn)而計(jì)算廣玉蘭葉樣品中總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)。

式中:c為測定液的質(zhì)量濃度/mg/mL;V為測定液的體積/mL;n為擴(kuò)大倍數(shù);m為測定液的質(zhì)量/mg。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

對廣玉蘭葉中多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,在超聲波條件下,選取乙醇體積分?jǐn)?shù),料液比,超聲時間,超聲溫度4個因素作為參考因子,尋找最佳提取條件。

1.3.3.1 料液比對多酚提取率的影響

稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末5份,選取料液比為1∶8、1∶16、1∶24、1∶32、1∶40,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,超聲時間30 min,超聲溫度60 ℃的條件下,研究料液比變化對多酚提取率的影響。

1.3.3.2 超聲時間對多酚提取率的影響

稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末5份,在料液比1∶16,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,超聲溫度60 ℃的條件下,改變超聲時間為20、30、40、50、60 min,研究時間對多酚提取率的影響。

1.3.3.3 超聲溫度對多酚提取率的影響

稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末5份,在料液比1∶16,超聲時間40 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的條件下,改變超聲溫度為40、50、60、70、80 ℃,研究溫度對多酚提取率的影響。

1.3.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取率的影響

稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末5份,在料液比1∶16,超聲時間40 min,超聲溫度70 ℃的條件下,改變乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%,研究溶劑濃度對多酚提取率的影響。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以超聲溫度、超聲時間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)共4個因素,以玉蘭葉多酚提取率為考察指標(biāo),選擇L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.3.5 玉蘭葉多酚抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 DPPH自由基清除活性的測定

將2.0 mL的DPPH溶液分別和2.0 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL濃度樣品溶液,充分混合均勻,在室溫條件(27 ℃)下避光溫浴30 min后用分光光度計(jì)在波長517 nm處測量吸光度A1。對照實(shí)驗(yàn)用等量的無水乙醇代替DPPH溶液測量吸光度A2[12],空白實(shí)驗(yàn)用等量的無水乙醇代替樣品溶液測量吸光度A3。樣品溶液對DPPH自由基的清除率計(jì)算公式:

1.3.5.2 羥自由基清除活性的測定

分別吸取6 mmol/LFeSO4溶液、6 mmol/L過氧化氫溶液、6 mmol/L水楊酸溶液和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的樣品溶液1 mL,使其充分混合均勻,并于40 ℃水浴中放置30 min后用分光光度計(jì)在波長510 nm處測吸光度為A1。取1 mL蒸餾水代替過氧化氫溶液所測得的吸光度為A2;取1 mL無水乙醇代替樣品溶液所測得的吸光度為A3[13]。樣品溶液對羥自由基清除率的計(jì)算公式同1.3.5.1。

1.3.6 廣玉蘭葉中多酚的抗氧化活性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 紫外光照射對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

取濃度為1.3 mg/mL多酚提取液裝入100 mL容量瓶中定容并置于紫外光下,光源垂直距離為10 cm,分別照射1、2、3、4、5 h,以原液作為對照,測定其對DPPH自由基抗氧化性的變化,平行測定3次,取平均值[14]。

1.3.6.2 溫度對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

取濃度為1.3 mg/mL多酚提取液分別裝入4個100 mL容量瓶中定容,分別置于20、40、60、80 ℃條件下進(jìn)行避光處理,分別測定處理1、2、3、4、5 h后,抗氧化性的變化。以原液作為對照,測定其對DPPH抗氧化性的變化,平行測定3次,取平均值。

1.3.6.3 添加劑對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

取濃度為0.3 mg/mL多酚提取液裝入5 mL透明的玻璃管中,分為3組,分別加入濃度1.0 m的葡萄糖,檸檬酸,苯甲酸鈉溶液1 mL,暗處理,并保證3組均在室溫條件下進(jìn)行。以原液作為對照,每隔2 h測定1次對DPPH自由基的清除率,平行測定3次,取平均值。根據(jù)結(jié)果來分析添加劑對DPPH自由基的活性變化。

1.3.6.4 氧化劑與還原劑對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

向3個100 mL容量瓶分別加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)為 0.6%的H2O2溶液,1.0 mL濃度為0.06 moL/L的KClO3,1.0 mL濃度為0.06 moL/L的VC,30 ℃下攪拌反應(yīng)后避光處理,以原液作為對照,分別測定處理2、4、6 h后,氧化劑和還原劑處理下其對DPPH清除能力的變化。

1.3.6.5 金屬離子對玉蘭葉多酚的影響

取質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL多酚提取液0.5 mL 9份,分別裝入5 mL透明的試管中。并分別加入2 mL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的Fe3+,K+,Co2+,Zn2+,Ca2+,Na+,Cu2+,Mg2+,Al3+溶液,以蒸餾水作為對照,搖勻,在室溫下避光放置1 h后,在517 nm處測定其酚類物質(zhì)濃度,平行測次3次,取平均值。

1.3.7 廣玉蘭葉中多酚對油脂氧化敗酸的影響

準(zhǔn)確稱取50 g油脂置于250 mL錐形瓶中,除空白對照,其他錐形瓶中以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%的多酚提取液,混合均勻,置于(60±0.5)℃的恒溫箱中,每隔24 h搖勻1次,并交換其在恒溫箱中的位置。每5 d取樣測定油脂的過氧化值和酸價。每個樣品重復(fù)測定3次。

過氧化值和酸價的測定參照GB 5009.37—2003《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》;根據(jù)GB 10146—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食用動物油脂》和GB 2716—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》,動物油中的過氧化值應(yīng)≤0.2 g/100 g,約為7.9 mmol/kg,酸價應(yīng)≤2.5 mg/g(以KOH計(jì));植物油中的過氧化值≤0.25 g/100 g,約為9.9 mmol/kg,酸價應(yīng)≤3.0 mg/g(以KOH計(jì))[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最佳料液比的確定

從圖1可以看出,提取率與液料比并不具有一定的線性關(guān)系,提取率先隨著料液比的增加而增加,當(dāng)達(dá)到一定的提取率時,隨著料液比的增加提取率反而下降。這是因?yàn)槔^續(xù)增加乙醇會導(dǎo)致其他醇溶性雜質(zhì)溶出,影響測定結(jié)果,導(dǎo)致提取率下降[16]。因此最佳料液比為1∶16。

圖1 不同影響因素的提取效果

2.1.2 最佳超聲時間的確定

從圖1可以看出,在一定范圍內(nèi),廣玉蘭葉中多酚的提取率隨提取時間的延長而不斷提高,但當(dāng)超聲時間超過40 min后,提取率迅速變小,這可能是因?yàn)檩^長時間的超聲處理影響了部分玉蘭葉多酚的組成及結(jié)構(gòu),并且隨著時間的延長,溶劑揮發(fā)也越多,進(jìn)一步影響提取率[17]。故確定最佳超聲時間為40 min。

2.1.3 最佳超聲溫度的確定

從圖1可以看出,超聲溫度為40～70 ℃時,廣玉蘭葉中多酚提取率隨溫度的升高而增大,溫度高于70 ℃時,提取率下降。這是由于溫度過高,小部分溶劑揮發(fā)損失,導(dǎo)致多酚提取不完全。此外,溫度過高,還可引起多酚變質(zhì)或者分解[18]。綜合各因素考慮,確定70 ℃為最佳超聲溫度。

2.1.4 最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

從圖1可以看出,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～80%時,多酚的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加,這是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)較易溶于乙醇,乙醇含量越大,廣玉蘭葉中多酚的析出越好。之后提取率略微下降,可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)的增大,其他一些醇溶性雜質(zhì)溶出也增多,影響了多酚的測定,同時,乙醇體積分?jǐn)?shù)過高會使蛋白質(zhì)的變性,對乙醇提取多酚物質(zhì)有一定的影響,阻礙多酚化合物的溶解。因此,選取最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)的極差分析

由表2可知,最佳的提取條件是A2B3C3D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,液料比為1∶16,超聲時間為50 min,超聲溫度為80 ℃。由極差分析可知,在實(shí)驗(yàn)所選水平內(nèi)4個因素對玉蘭葉多酚提取率影響程度大小順序?yàn)?超聲溫度>料液比>超聲時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。在最佳提取條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),廣玉蘭葉中多酚得率的平均值為12.8%,即121.477 mg/g,高于正交實(shí)驗(yàn)中各條件的結(jié)果得率,證明該條件為廣玉蘭葉中多酚提取的最優(yōu)工藝。

表2 正交實(shí)驗(yàn)的極差分析

2.3 玉蘭葉多酚抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

如圖2所示,多酚對DPPH自由基和羥自由基均具有一定的清除作用,但對DPPH自由基清除能力明顯優(yōu)于羥基自由基,且隨著濃度的增加而增加,增加較為明顯。玉蘭葉多酚對羥基自由基清除率也與濃度呈正相關(guān)。因?yàn)槎喾訉PPH自由基清除作用明顯,所以選用DPPH自由基作為玉蘭葉多酚抗氧化穩(wěn)定性的研究對象。

2.3.1 紫外光對玉蘭葉多酚抗氧化性的影響

如圖3所示,紫外光照射使廣玉蘭葉的多酚對DPPH自由基的清除率產(chǎn)生波動,但與對照實(shí)驗(yàn)相比,其波動范圍很小且在6 h后仍保持良好的清除率,說明玉蘭葉多酚對紫外線照射具有較好的穩(wěn)定性。

圖2 DPPH自由基與·OH清除活性的測定

圖3 紫外光對玉蘭葉多酚抗氧化性的影響

圖4 溫度對玉蘭葉多酚清除DPPH的影響

2.3.2 溫度對廣玉蘭葉提取液中多酚清除DPPH的影響

如圖4所示,玉蘭葉多酚在20、40、60、80 ℃條件下處理1 h后,室溫20 ℃時的清除率最高。隨著時間的增加,在室溫20 ℃的條件下,玉蘭葉多酚對DPPH自由基的清除率基本保持不變;在40 ℃和60 ℃的處理?xiàng)l件下,其對DPPH自由基的清除率在逐漸增大,并且趨于一致;在80 ℃的處理?xiàng)l件下,其對DPPH自由基的清除率相對穩(wěn)定。在不同溫度處理6 h后,玉蘭葉多酚仍保持良好的清除能力,說明玉蘭葉多酚對DPPH自由基的清除率受溫度影響不大。

2.3.3 添加劑對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

如圖5所示,2 h內(nèi),在3種添加劑的處理下,玉蘭葉多酚清除DPPH的能力都呈現(xiàn)下降趨勢,2～4 h 內(nèi)略微增長,4～6 h又開始下降較小幅度。與對照實(shí)驗(yàn)相比,6 h后,經(jīng)添加劑處理的多酚都降低了極大的清除能力。可見,多酚對DPPH自由基的清除能力在添加劑處理下是不穩(wěn)定的。

圖5 添加劑對玉蘭葉多酚清除 DPPH 自由基的影響

2.3.4 氧化劑與還原劑對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

如圖6所示,隨著氧化時間的增加,氧化劑H2O2和KClO3對玉蘭葉多酚DPPH自由基的清除能力趨于下降趨勢,因?yàn)檠趸瘎┫牧擞裉m葉多酚中大量的抗氧化成分;還原劑VC使其清除能力增強(qiáng),這是因?yàn)閂C對DPPH自由基具有還原作用。實(shí)驗(yàn)說明,在廣玉葉多酚中添加一定量的H2O2,KClO3和VC能顯著降低或提高玉蘭葉多酚的抗氧化性。

圖6 氧化劑與還原劑對玉蘭葉多酚清除 DPPH 自由基的影響

2.3.5 金屬離子對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

如圖7所示,相對于初始玉蘭葉多酚對DPPH自由基的清除能力,在9種金屬離子處理后,添加了Na+和K+的溶液對DPPH自由基的清除能力變大;而其他Fe3+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Al3+溶液,都使玉蘭葉多酚對DPPH自由基清除能力降低,其中添加了Ca2+的溶液對DPPH自由基的清除能力下降最大。Cu2+和Fe3+雖然對清除能力影響不大,但使玉蘭葉多酚溶液顏色迅速變深,說明廣玉蘭多酚不適合用銅質(zhì)和鐵質(zhì)的器皿儲存和加工,用鋁制的容器較好。

圖7 金屬離子對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

2.4 廣玉蘭葉中多酚對油脂氧化敗酸的影響

如圖8、圖9所示:在對大豆油及豬油添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的廣玉蘭多酚進(jìn)行高強(qiáng)度氧化過程,同空白組做對照實(shí)驗(yàn),表明不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的玉蘭葉多酚對油脂的酸價和過氧化值具有抑制作用,且與多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)。

圖8 玉蘭葉多酚對大豆油過氧化值的影響

圖9 玉蘭葉多酚對大豆油酸價的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波法提取玉蘭葉多酚,取得了較好的效果。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過正交實(shí)驗(yàn)選擇出玉蘭葉多酚的最佳提取工藝條件是:乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,液料比為1∶16,超聲時間為40 min,超聲溫度為80 ℃。各因素對生物堿提取率影響程度大小順序?yàn)槌暅囟?料液比>超聲時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。并重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,多酚提取率均值為12.8%,即121.477 mg/g。本實(shí)驗(yàn)表明,利用超聲波提取玉蘭葉多酚的方法可行,具有提取時間短、原料少等特點(diǎn)。

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,多酚對DPPH自由基和羥基自由基都具有一定清除能力。但對DPPH自由基清除能力最強(qiáng),而對羥基自由基的清除能力較弱?？梢钥闯鲇裉m葉多酚具有明顯的抗氧化活性,從資源利用的角度來看,廣玉蘭葉具有較大的開發(fā)潛力。

由玉蘭葉多酚的抗氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在添加劑,氧化還原劑的處理下,玉蘭葉多酚抗氧化穩(wěn)定性較差。紫外光照和溫度對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基穩(wěn)定性影響較小。在9種金屬離子的處理下,玉蘭葉多酚適用于鋁制的容器儲存和加工。在對油脂的高強(qiáng)度氧化實(shí)驗(yàn)中,玉蘭葉多酚對油脂的酸價和過氧化值均具有較好的抑制作用。