許 壯, 丁青芝, 戴意強, 王 喆, 劉振田, 陳小陽, 虞利俊, 夏秀東

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1,鎮(zhèn)江 212013) (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地2,南京 210014) (臨沂市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心3,臨沂 276000) (南京果果食品有限公司4,南京 211299)

酸漿豆腐歷史悠久,其具有持水性好、口感細(xì)膩、味道甘甜等特點[1]。酸漿來源于豆腐制作過程的黃漿水經(jīng)發(fā)酵制得[2,3],與鹽鹵、石膏和GDL等凝固劑相比,更為綠色安全,且黃漿水作為酸漿生產(chǎn)的原料可以減輕其排放造成的環(huán)境污染和處理造成的成本壓力[4]。

酸漿豆腐和普通豆腐的生產(chǎn)工藝制作流程主要包括大豆的篩選清洗、浸泡、打漿、過濾、煮漿、點漿、蹲腦、壓制、成型,其制作方法盡管有一定的相似性,但酸漿作為凝固劑在豆乳中的添加量遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)凝固劑(鹽鹵、石膏和葡萄糖內(nèi)酯),使得點漿時豆乳溫度、蹲腦溫度以及蹲腦時間對豆腐品質(zhì)產(chǎn)生了與傳統(tǒng)凝固劑不同的影響。目前酸漿豆腐生產(chǎn)方式多為手工作坊,酸漿點漿工藝多憑經(jīng)驗,沒有規(guī)范的點漿工藝,制得的豆腐品質(zhì)存在較大差異,導(dǎo)致了酸漿豆腐的接受度遠(yuǎn)不及石膏、鹽鹵等豆腐[5]。為解決以上問題,劉海宇等[6]發(fā)現(xiàn)磨漿料水比在1∶8時得到的豆腐較優(yōu);楊嵐等[7]研究發(fā)現(xiàn)豆腐的凝膠強度隨著點漿時豆乳溫度的升高逐漸升高,但繼續(xù)增加溫度會對豆腐的凝膠強度和含水量產(chǎn)生負(fù)面影響;李娟娟[8]研究了豆乳在點漿后蹲腦不同時間條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)隨著時間延長蛋白質(zhì)的黏彈性逐漸增加。豆乳中主要的蛋白質(zhì)類型為大豆7S和11S球蛋白,對豆腐的凝膠結(jié)構(gòu)及得率有較大影響[9],有研究表明酸漿點漿時,最開始發(fā)生聚集的是11S球蛋白,然后是7S蛋白。因此在酸漿點漿后,蹲腦時間和蹲腦溫度可能會影響豆乳中不同蛋白的聚集,從而對豆腐品質(zhì)產(chǎn)生影響[10,11]。所以對于點漿時豆乳溫度、蹲腦溫度和蹲腦時間對豆腐品質(zhì)及豆乳凝固過程的研究極為重要。

目前相關(guān)報道主要集中在酸漿的pH、添加量、豆水比、煮漿溫度等制作工藝的簡單優(yōu)化[12-14],而對點漿時豆乳溫度、蹲腦溫度以及蹲腦時間在的豆腐品質(zhì)中的作用研究較少。因此,本研究通過SDS-PAGE、低場核磁等技術(shù)探究點漿溫度、蹲腦時間、蹲腦溫度對酸漿豆腐品質(zhì)的影響,并揭示了點漿溫度、蹲腦溫度、蹲腦時間對豆乳凝固過程的影響,旨在為酸漿豆腐生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵因素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆來自本地市售;新鮮黃漿水由實驗室自制;植物乳桿菌ND1031由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與生物工程創(chuàng)新團(tuán)隊提供;甲醇和乙腈(ACN)均為色譜級;考馬斯亮藍(lán)G250、十二烷基硫酸鈉(SDS)、硫酸銨、冰乙酸、β-巰基乙醇、三氟乙酸(TFA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、溴酚藍(lán)和其他化學(xué)試劑均為分析級。

MJ-100A磨漿機,FiveEasy Plus pH計,Sigma 3K15離心機,HH-4 恒溫水浴鍋,LRH-150F生化培養(yǎng)箱,Bio-Rad/1658001電泳儀,Tanon3500 凝膠圖像分析系統(tǒng),TMS-Touch質(zhì)構(gòu)儀,E-poch酶標(biāo)儀,NMI20低場核磁共振分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸漿制備

新鮮黃漿水經(jīng)5 000 g離心10 min以去除不溶物后,于108 ℃滅菌20 min,待冷卻后接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的已活化植物乳桿菌ND1031,在37 ℃發(fā)酵24 h,得到pH為4.0的酸漿。

1.2.2 豆乳及酸漿豆腐制備

200 g大豆清洗3次后在室溫下浸泡12 h,大豆瀝干水分后與水1∶6(質(zhì)量比)磨漿,并用200目濾布去除豆渣,得到生豆乳。生豆乳加熱煮沸5 min,并于75 ℃保溫。向不同溫度(35、45、55、65、75、85、95 ℃)的熟豆乳中加入體積分?jǐn)?shù)20%、pH為4.0的酸漿,在75 ℃下水浴30 min;或向75 ℃下熟豆乳加入20%、pH為4.0的酸漿,在不同溫度下(35、45、55、65、75、85、95 ℃)水浴30 min;或向75 ℃下熟豆乳中加體積分?jǐn)?shù)20%、pH為4.0的酸漿,在75 ℃下水浴不同時間(0、10、15、20、25、30、40 min)后的豆乳于10 000 g離心20 min,得到豆乳上清液(SSF)和豆乳沉淀(SPF)。豆乳沉淀部分用等體積蛋白溶解液(含2 mol/L硫脲,7 mol/L尿素和4%CHAPS)溶解后進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。將蹲腦結(jié)束的豆乳壓制(2.0 kg/cm2)制得酸漿豆腐,并研究點漿溫度、蹲腦溫度和蹲腦時間對酸漿豆腐的得率、含水量、保水性、質(zhì)構(gòu)和感官評價的影響。

1.2.3 豆腐含水量測定

酸漿豆腐含水量測定參照戴意強等[15]的方法。稱取2 g(精確至0.000 1 g)豆腐(W1),置于105 ℃烘箱中直至恒重的豆腐(W2)。豆腐的水質(zhì)量分?jǐn)?shù)(MC)用式(1)表示:

1.2.4 豆腐得率測定

豆腐的得率按照Kang等[16]的方法,用每100 g大豆所獲得的豆腐的濕重表示(g/100 g大豆)。

1.2.5 豆腐保水性測定

保水性(WHC)參照Puppo等[17]的方法進(jìn)行測定。用底部有脫脂棉的50 mL離心管稱取質(zhì)量為m1,稱取1.000 0 g(精確到0.000 1 g)豆腐,放于底部有脫脂棉的50 mL離心管中,稱此時質(zhì)量m2,以4 000 g離心10 min后稱質(zhì)量m3,按式(2)計算保水性。

1.2.6 豆腐質(zhì)構(gòu)測定

豆腐質(zhì)構(gòu)測定參照Ambati等[18]的方法,將豆腐切成5 cm×5 cm×5 cm的立方體,利用TPA進(jìn)行分析,使用TP250探頭將樣品壓縮2次至50%,測試速度為2 mm/s,2次擠壓間隔時間30 s;每種豆腐取3個立方體的樣品測定豆腐樣品的硬度和彈性,記錄測定結(jié)果并分析。

1.2.7 感官評價測定

參照Zhang等[19]方法進(jìn)行感官評定。由20位感官評定員組成,以色澤、氣味、質(zhì)地、口感和可接受程度為感官評定的指標(biāo),每個指標(biāo)實行1～9評分制,如表1所示。

表1 酸漿豆腐感官評價表

1.2.8 蛋白含量測定

豆乳中SSF和SPF蛋白質(zhì)含量的測定參照Stanojevic等[9]的方法,取1.2.2中樣品100 μL或BSA加入已稀釋4倍的考馬斯亮藍(lán)G250溶液,混合均勻后暗反應(yīng)10 min,用分光光度計測定樣品在595 nm下的吸收光,并根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到樣品中蛋白含量,單位用mg/mL表示。

1.2.9 SDS-PAGE分析

按照Wu等[20]方法對SSF和SPF進(jìn)行SDS-PAGE分析。準(zhǔn)備以下緩沖液:上樣緩沖液,含質(zhì)量濃度為2 mg/100 mL SDS,體積分?jǐn)?shù)為5%的β-巰基乙醇,體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油,0.02 mg/100 mL溴酚藍(lán);70 mmol/L Tris-HCl緩沖液。向0.9 mL上樣緩沖液中加入0.1 mL樣品液,混合均勻后于95 ℃水浴5 min,冷卻后10 000 g離心10min。樣品的上樣量為10 μL,濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和10%,樣品進(jìn)膠前電壓為60 V,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到分離膠時,電壓增加至90 V。SDS-PAGE電泳完成后,小心取下蛋白膠,并放入考馬斯亮藍(lán)G250溶液中染色,待染色結(jié)束后,將蛋白膠放在脫色液中直至蛋白藍(lán)色條帶顯現(xiàn)且背景清晰。使用Quantity One軟件和Gel-Pro軟件對條帶進(jìn)行分析。結(jié)果表示為SSF或SPF中每個蛋白質(zhì)亞基含量占豆乳中對應(yīng)亞基含量的百分比。

1.2.10 低場核磁共振

參照Tang等[21]的方法,核磁共振Carr-Purcel-Meiboom-Gill (CPMG)序列弛豫測量在臺式脈沖NMR分析儀PQ001上進(jìn)行。質(zhì)子共振頻率22.6 MHz,測量溫度32 ℃。約2 g樣品放入直徑為15 mm的核磁管中,而后放入分析儀中檢測。橫向弛豫時間T2測量所使用參數(shù)τ值(90o～180o脈沖間隔)為50 μs;重復(fù)掃描16次;相鄰重復(fù)測量的間隔時間3 s;回波個數(shù)為3 000。每個樣品有10個重復(fù)。

1.3 實驗數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次,結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較不同處理之間的顯著性差異(P<0.05)。分別用SPSS 22.0軟件和Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同點漿溫度對豆腐品質(zhì)及豆乳中蛋白凝固的影響

2.1.1 不同點漿溫度對豆腐品質(zhì)的影響

選擇蹲腦溫度為75 ℃、蹲腦時間為30 min,分析點漿時不同豆乳溫度對酸漿豆腐品質(zhì)的影響,結(jié)果如表2和圖1所示。隨著點漿時豆乳溫度的升高,豆腐硬度明顯降低,而豆腐的得率、含水量和保水性則呈先升高后降低的趨勢,在豆乳溫度為75 ℃時,酸漿豆腐的硬度最小為16.94 N,而彈性、得率、水質(zhì)量分?jǐn)?shù)和保水性最大分別為4.97 mm、229.50%、75.56%和65.72%。這可能是點漿溫度較低時,蛋白發(fā)生自聚集,在壓制過程中保留水的能力較差,與戴意強等[15]研究發(fā)現(xiàn)的含水量越高,豆腐的硬度越低的結(jié)果一致。如圖1b感官評分結(jié)果所示,在點漿溫度為75 ℃時,此時制得的豆腐口感佳,風(fēng)味優(yōu),表觀、色澤和可接受度較好。因此,當(dāng)點漿時豆乳溫度為75 ℃時,酸漿豆腐品質(zhì)最優(yōu)。

表2 點漿時不同豆乳溫度酸漿豆腐質(zhì)構(gòu)

注:不同小寫字母表示同一品質(zhì)指標(biāo)下不同點漿溫度之間結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05)。圖1 點漿時不同豆乳溫度酸漿豆腐的品質(zhì)分析

2.1.2 點漿時不同豆乳溫度對豆腐水分分布的影響

點漿時不同豆乳溫度的酸漿豆腐中水分分布的弛豫曲線如圖2所示,隨著弛豫時間增加,所呈現(xiàn)3個峰為T2b、T21、T22,T21和T22被認(rèn)為是和大分子緊密結(jié)合的水,而T21組分超過總信號量的90%,T2b和T22對保水性和物理特性影響很小[22],所以本研究著重研究T21組分。弛豫時間指的是各組分曲線最高點所對應(yīng)的時間,李騰[23]研究表明T21弛豫時間與豆腐保水性呈極強的正相關(guān),當(dāng)點漿時豆乳溫度為75 ℃時,豆腐水分分布的T21弛豫時間最大為32.75 ms,這與豆腐含水量與保水性研究結(jié)果一致。這可能是因為點漿時不同的豆乳溫度會對豆腐的凝膠強度和保水性造成一定影響[24],從而影響豆腐的水分分布。

圖2 點漿時不同豆乳溫度酸漿豆腐水分分布的弛豫曲線

2.1.3 不同點漿溫度對豆乳中蛋白凝固的影響

新鮮煮沸的豆乳在10 000 g離心作用下幾乎沒有蛋白質(zhì)沉淀。然而當(dāng)向煮沸的豆乳中添加凝固劑時,大豆蛋白發(fā)生相互聚集,形成凝聚體[25]。如圖3所示,隨著點漿時豆乳溫度的增加,離心后SPF蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度維持在8.35 mg/mL,SSF蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約1.10 mg/mL,這可能是因為點漿結(jié)束后,繼續(xù)對豆乳進(jìn)行了一段時間的水浴,未反應(yīng)完全的蛋白質(zhì)繼續(xù)反應(yīng),導(dǎo)致對蛋白含量幾乎無影響,但是由于溫度的變化,可能對蛋白凝膠強度和持水性等豆腐品質(zhì)有較大影響[26]。

在豆乳中,7S和11S球蛋白是2種主要的蛋白質(zhì)類型[27]。點漿時不同豆乳溫度對豆乳SSF和SPF含量中7S和11S大豆蛋白各亞基的分布及變化如圖4所示。隨著點漿時豆乳溫度的增加,SPF中的亞單位蛋白帶的強度和含量無明顯變化,以及SSF中亞單位蛋白帶和含量也呈現(xiàn)相同變化,與蛋白含量變化結(jié)果一致。

圖3 點漿時不同豆乳溫度對豆乳SPF及SSF蛋白含量

圖4 點漿時不同豆乳溫度誘導(dǎo)豆乳蛋白凝固的SSF和SPF蛋白電泳

2.2 不同蹲腦溫度對豆腐品質(zhì)及豆乳中蛋白凝固的影響

2.2.1 不同蹲腦溫度對豆腐品質(zhì)的影響

選擇點漿時豆乳溫度為75 ℃和蹲腦時間為30 min,分析不同蹲腦溫度對酸漿豆腐品質(zhì)的影響,如表3和圖5所示。隨著蹲腦溫度的升高,酸漿豆腐的硬度先降低后升高,而豆腐得率、含水量和保水性先升高后降低,在蹲腦溫度為75 ℃時,豆腐硬度最小,為13.52 N,而彈性、得率、水質(zhì)量分?jǐn)?shù)和保水性最高,分別為5.76 mm、235.1%、75.81%、65.89%。這可能是因為豆乳體系蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜,當(dāng)點漿結(jié)束后還存在少量的蛋白未形成凝聚體,還需要提供適宜的反應(yīng)條件,但如果維持反應(yīng)的溫度過高,會對凝膠強度和持水性出現(xiàn)負(fù)面影響[7,28]。結(jié)合圖5b感官評分結(jié)果,當(dāng)蹲腦溫度為75 ℃時,酸漿豆腐口感佳,風(fēng)味優(yōu),表觀、色澤和可接受度都最好,此時酸漿豆腐品質(zhì)最優(yōu)。

注:不同小寫字母表示同一品質(zhì)指標(biāo)下不同蹲腦溫度之間結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05)。圖5 不同蹲腦溫度酸漿豆腐的品質(zhì)分析

表3 不同蹲腦溫度酸漿豆腐質(zhì)構(gòu)

2.2.2 不同蹲腦溫度對豆腐水分分布的影響

不同蹲腦溫度下豆腐水分分布的的弛豫曲線如圖6所示。結(jié)果表明,當(dāng)蹲腦溫度為75 ℃時,豆腐中水分分布的T21弛豫時間最大分別為32.75 ms,這與豆腐的保水性研究結(jié)果一致。這可能是因為蹲腦溫度會對點漿后蛋白反應(yīng)及結(jié)構(gòu)造成影響,從而影響對酸漿豆腐的凝結(jié)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而造成豆腐的水分分布的差異[11,29]。

2.2.3 不同蹲腦溫度對豆乳中蛋白凝固的影響

如圖7所示,隨著蹲腦溫度的升高,豆乳中的蛋白顆粒形成的凝聚體越來越多,離心后豆乳SPF中蛋白質(zhì)含量逐漸增加,而SSF中蛋白質(zhì)含量隨著溫度升高而逐漸下降,并在75 ℃時達(dá)到平衡,說明75 ℃是蹲腦溫度的關(guān)鍵溫度。

圖7 不同蹲腦溫度SPF及SSF蛋白含量

如圖8所示,不同蹲腦溫度對SSF和SPF中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖結(jié)果表明,隨著蹲腦溫度的升高,SPF中的蛋白亞基濃度隨著蹲腦溫度的升高而增加,而SSF中蛋白質(zhì)亞基條帶強度與蹲腦溫度呈負(fù)相關(guān)。隨著蹲腦溫度的升高,SPF的各蛋白亞基含量逐漸增加,而SSF的各蛋白亞基含量逐漸減少,并在75 ℃時達(dá)到平衡,與上述蛋白含量變化一致。這可能是因為大豆蛋白的主要組成是7S和11S球蛋白,其中7S組分包括α、α’及β3個亞基,11S組分包括6個酸性A亞基和6個堿性B亞基,蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜[27],需要提供適宜的溫度條件以供繼續(xù)反應(yīng)。因此,75 ℃的蹲腦溫度是豆乳凝固的關(guān)鍵點。

圖8 SSF和SPF蛋白電泳圖以及各蛋白亞基相對含量

2.3 不同蹲腦時間對豆腐品質(zhì)及豆乳中蛋白凝固的影響

2.3.1 不同蹲腦時間對豆腐品質(zhì)的影響

選擇點漿時豆乳溫度為75 ℃、蹲腦溫度為75 ℃,分析不同蹲腦時間對豆腐品質(zhì)的影響,如表4和圖9所示。隨著蹲腦時間的延長,酸漿豆腐的硬度先降低后升高而彈性、得率、含水量和保水性都想先增加后減少,并在當(dāng)蹲腦時間為20 min時達(dá)到最值,此時制得的豆腐硬度最小為15.80 N,而彈性得率、水質(zhì)量分?jǐn)?shù)、保水性都最高,分別為5.15 mm、241.3%、76.36%、65.68%。結(jié)合圖9b感官評分結(jié)果,蹲腦時間為20 min時,豆腐口感佳,風(fēng)味優(yōu),表觀、色澤和可接受度都最好。有研究表明,酸漿豆腐中主要以β結(jié)構(gòu)為主,點漿后0 min時,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由無規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)向β轉(zhuǎn)角、β折疊和α螺旋,且α螺旋的占比較少。點漿后10 min,α螺旋減少,β折疊增多,在點漿后20～30 min內(nèi),體系趨于穩(wěn)定,主要體現(xiàn)在得率與豆腐質(zhì)構(gòu)上,此時豆腐的品質(zhì)最好[8,11],本研究結(jié)果也表明蹲腦時間在20～30 min時,豆腐品質(zhì)最佳。

注:不同小寫字母表示同一品質(zhì)指標(biāo)下不同蹲腦時間之間結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05)。圖9 不同蹲腦時間的酸漿豆腐分析

表4 不同蹲腦時間對酸漿豆腐質(zhì)構(gòu)影響

2.3.2 不同蹲腦時間對豆腐水分分布的影響

不同蹲腦時間下豆腐水分分布的弛豫曲線如圖10所示。結(jié)果表明,蹲腦時間對T21的弛豫時間影響較大即對豆腐的保水性影響較大。當(dāng)蹲腦時間為20 min時,豆腐水分分布的T21組分和弛豫時間均高于其他蹲腦時間制得的豆腐為43.29 ms?？赡苁且驗辄c漿結(jié)束后蛋白之間還需要繼續(xù)反應(yīng)[8],而反應(yīng)時間過長,蛋白凝聚體長時間暴露可能會導(dǎo)致巰基氧化現(xiàn)象嚴(yán)重,對豆腐凝膠造成負(fù)面影響[28],從而對豆腐的水分分布造成差異。

圖10 不同蹲腦時間豆腐水分分布的弛豫曲線

2.3.3 不同蹲腦時間對豆乳中蛋白凝固的影響

圖11為固定點漿時豆乳溫度為75 ℃、蹲腦溫度為75 ℃時,不同蹲腦時間對豆乳蛋白凝固過程的影響。隨著蹲腦時間的延長,豆乳中的蛋白顆粒形成的凝聚體越來越多。離心后SPF中蛋白質(zhì)含量逐漸增加,而SSF中蛋白質(zhì)含量逐漸下降,在20 min時達(dá)到平衡,說明蹲腦時間20 min時是豆乳凝固關(guān)鍵點。

圖12為不同蹲腦時間對SSF和SPF含量中7S和11S大豆蛋白各亞基的分布及變化。如圖12所示,SPF中的蛋白亞基濃度隨著蹲腦時間的延長而增加,而SSF中蛋白亞基與之呈相反規(guī)律。圖12c和圖12d為不同蹲腦時間誘導(dǎo)豆乳蛋白凝固的SSF和SPF各蛋白亞基占總蛋白含量變化,結(jié)果表明,SPF中7S蛋白含量明顯低于11S蛋白含量,隨著蹲腦時間的延長,沉淀中各蛋白亞基含量隨之增加,但7S蛋白的增速要顯著大于11S蛋白,并在20 min時達(dá)到平衡。這可能是因為點漿結(jié)束后,參與反應(yīng)的主要是7S蛋白,它的含量較少,反應(yīng)較慢[30],所以沉淀蛋白含量呈現(xiàn)上升后趨于穩(wěn)定的趨勢,與豆腐品質(zhì)研究結(jié)果一致。

圖12 不同蹲腦時間誘導(dǎo)豆乳蛋白凝固的SSF和SPF蛋白電泳以及各蛋白亞基占總蛋白含量的百分比

3 結(jié)論

本研究以豆腐品質(zhì)(感官評分、含水量、保水性、得率、彈性、硬度等)為指標(biāo),通過分析點漿時豆乳溫度、蹲腦溫度以及蹲腦時間對豆乳中大豆蛋白凝固過程、蛋白亞基條帶和豆腐中水分分布的變化,不僅優(yōu)化酸漿豆腐制作工藝參數(shù),還闡明了這3個因素導(dǎo)致豆腐品質(zhì)差異的機理。