姚曉紅，孫宏，沈琦，周航海，趙志偉，吳逸飛，王新，湯江武*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430000)

西蘭花富含維生素、糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此有“蔬菜皇冠”的美譽(yù)。西蘭花(Brassicaoleracea)莖葉中粗蛋白含量在20%以上，還含有多糖、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分，是一種潛在的植物蛋白飼料資源[1]。我國(guó)西蘭花種植面積預(yù)計(jì)已超過(guò)2.7萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量超過(guò)100萬(wàn)t[1]。同時(shí)，每年至少超過(guò)30萬(wàn)t的西蘭花廢棄莖葉被丟棄在農(nóng)田中，這些廢棄莖葉的纖維含量較高，直接用于動(dòng)物飼喂則難以被動(dòng)物消化。另外，廢棄莖葉中的含水率超過(guò)90%，極易腐爛，造成環(huán)境的污染[2]。利用微生物發(fā)酵技術(shù)，將西蘭花廢棄莖葉作為非常規(guī)飼料進(jìn)行開(kāi)發(fā)，有效解決西蘭花種植地區(qū)環(huán)境污染的同時(shí)，還能緩解我國(guó)蛋白飼料資源短缺的現(xiàn)狀，為我國(guó)飼料工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供支持和保障[3]。本文從西蘭花種植土壤中分離出一株高效纖維素降解菌，對(duì)其進(jìn)行了菌株鑒定，將其用于西蘭花廢棄莖葉的發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了分析，為西蘭花廢棄莖葉制備發(fā)酵飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

西蘭花廢棄莖葉中粗蛋白含量2.62%，含水率85%，由臺(tái)州天萊生物科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

(1)酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

(2)產(chǎn)纖維素酶菌種篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，磷酸二氫鉀1 g，氯化鈉5 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.3 菌種的分離與篩選

1.3.1 纖維素降解菌的生物富集及初篩

取西蘭花廢棄莖葉切成0.5～1 cm左右的塊狀，稱取10 g塊狀莖葉加入裝有100 mL滅菌YPD液體培養(yǎng)基中，同時(shí)采用四分法取西蘭花種植地泥土100 g，加入裝有500 mL滅菌YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h。完成培養(yǎng)后，靜置片刻，用無(wú)菌吸管吸取上清液并進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋液涂布于纖維素初篩培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h，有透明圈長(zhǎng)出的菌落即為能產(chǎn)生纖維素分解酶的菌落，并對(duì)其進(jìn)行多次平板劃線純化。然后將經(jīng)過(guò)純化后有透明圈的菌株轉(zhuǎn)接到纖維素篩選培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)3 d。將4 mL 1 mg·mL-1的剛果紅溶液均勻覆蓋于平板上，染色30 min后棄去剛果紅溶液，再用1 mol·L-1NaCl溶液沖洗30 min，利用十字交叉法測(cè)量菌落直徑d(mm)和透明圈D(mm)，根據(jù)H值(H=D/d)篩選比值大的菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定[4]。

1.3.2 纖維素降解菌的復(fù)篩

活化初篩獲得的菌種，將其接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。于4 ℃，6 000 r·min-1將發(fā)酵液離心10 min，對(duì)獲得的上清液(即粗酶液)進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.4 纖維素酶活力測(cè)定

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將配制好的1 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別吸取0、200、400、600、800、1 000 μL于10 mL比色管中，用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，用蒸餾水作為對(duì)照組。分別加入1.5 mL DNS試劑，煮沸5 min。冷卻后，加水稀釋至10 mL。于540 nm波長(zhǎng)處，以空白對(duì)照調(diào)零，測(cè)定吸光值。以吸光度值為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程。

1.4.2 CMC活性測(cè)定[5-6]

采用DNS法測(cè)定纖維素酶活性。取3支10 mL比色管，加入用醋酸-醋酸鈉緩沖液配制的0.5%(m/V)CMC-Na溶液1.5 mL，于40 ℃水浴預(yù)熱10 min，迅速加入0.5 mL粗酶液，40 ℃反應(yīng)30 min，立即加入DNS試劑1.5 mL以終止反應(yīng)。將混合液于沸水浴煮沸5 min后冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，充分搖勻，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算纖維素酶活性。

1.4.3 濾紙酶活性測(cè)定[6-7]

將濾紙剪成1 cm×6 cm的長(zhǎng)條，放入10 mL比色管中，加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL醋酸鈉緩沖液；將試管置于40 ℃恒溫水浴中處理30 min，取出后迅速加入1.5 mL DNS試劑，充分搖勻，煮沸5 min。取出冷卻后，定容至10 mL，充分搖勻，于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濾紙酶活性。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株于YPD平板劃線活化，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征、大小及顏色，鏡檢觀察革蘭氏染色后菌體的大小、形態(tài)、芽孢形成情況，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[8]進(jìn)行部分生理生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.5.2 菌種的16S rRNA基因測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取目標(biāo)菌株的基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為27F和1492R通用引物。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括：上下游引物各0.75 μL、DNA模板1 μL、Taq酶0.25 μL、dNTP 0.5 μL、10×酶緩沖液4 μL，ddH2O 17.75 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 31 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)，通過(guò)Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 西蘭花生物飼料制備方法

西蘭花廢棄莖葉用碎草機(jī)切成1～2 cm小段，與米糠和玉米皮按3∶1∶1比例混合均勻，接種0.5%的菌液，裝入發(fā)酵用呼吸袋中，每袋裝量500 g，做3個(gè)重復(fù)，于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 d，取樣于50 ℃烘箱烘干進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。取攪拌均勻的混合原料放入-20 ℃冰箱保存作對(duì)照組。

1.7 指標(biāo)測(cè)定

粗蛋白含量測(cè)定方法參照GB/T 6432—2018，粗纖維含量測(cè)定方法參照GB/T 6434—2006，粗多糖含量測(cè)定方法參照SN/T 4260—2015[9]，粗灰分含量測(cè)定方法參照GB/T 6438—2007，乳酸含量測(cè)定參照GB/T 12456—2008[10]，小肽含量測(cè)定參照GB/T 22492—2008《大豆肽粉》三氯乙酸法[11]。發(fā)酵結(jié)束后，取2 g烘干后的發(fā)酵樣品，用電鏡專用膠帶固定樣品，經(jīng)高真空離子濺射儀噴鍍處理，利用Hitachi Regulus 8100掃描電鏡進(jìn)行樣品表面結(jié)構(gòu)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的初篩

將分離樣品適當(dāng)稀釋后涂布于纖維素初篩平板，37 ℃培養(yǎng)72 h，選取生長(zhǎng)快速且透明圈清晰的菌株測(cè)量菌落直徑d和透明圈直徑D，計(jì)算H=D/d值，結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

表1 纖維素降解菌初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of cellulose-degrading bacteria

圖1 纖維素降解菌的篩選Fig.1 Screening of cellulose-degrading bacteria

從初篩結(jié)果可以看出，菌株XLG2-1的H值最大，其次為Bsk-9，其菌落直徑和透明圈直徑都較大，說(shuō)明該菌的生長(zhǎng)能力和降解纖維素的能力均較強(qiáng)。根據(jù)H值大小，選取H較大的5株菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 纖維降解菌的復(fù)篩

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)DNS法以葡萄糖添加量(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以D值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.354 1x+0.027 9，R2=0.999 5，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的估算值與實(shí)際值的擬合度很高。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Glucose standard curve

2.2.2 發(fā)酵液酶活性測(cè)定

將初篩獲得的菌種活化后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液于5 000 r·min-1離心10 min，取上清液適當(dāng)稀釋后測(cè)定CMC活性、FPA活性和蛋白酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩Fig.3 Secondary screening of cellulase producing strains

從圖3可知，菌株Y1-3產(chǎn)FPA活性最高，其次為XLG2-1，菌株XLG2-1產(chǎn)CMC活性最高，其次為Bsk-9。圖4結(jié)果顯示，菌株Bs2產(chǎn)蛋白酶活性最高，其次為XLG2-1。綜合上述結(jié)果，選取菌株XLG2-1作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 纖維素降解菌的菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

從圖5中1可見(jiàn)，菌株XLG2-1在YPD平板上的菌落呈圓形，米黃色，表面濕潤(rùn)、凸起，邊緣整齊。圖5中2透射電鏡下觀察菌體呈短桿狀。從表2生理生化結(jié)果可知，該菌株能水解淀粉、葡萄糖和蔗糖。根據(jù)菌落和菌體形態(tài)及生理生化結(jié)果，同時(shí)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]，初步鑒定菌株XLG2-1為芽孢桿菌屬。

表2 菌株XLG2-1的部分生理生化結(jié)果Table 2 Partial physiological and biochemical results of strain XLG2-1

1表示菌株XLG2-1菌落形態(tài)，2表示菌株XLG2-1透射電鏡下菌體形態(tài)。圖5 菌株XLG2-1形態(tài)Fig.5 Morphology of strain XLG2-1

2.3.2 菌種16S rDNA序列測(cè)定

經(jīng)序列分析，菌株XLG2-1的16S rDNA的序列長(zhǎng)度為1 466 bp，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)，發(fā)現(xiàn)該菌株與短小芽孢桿菌Bacilluspumilus(NR 112637)有較高的同源性。綜合上述結(jié)果，鑒定該菌株為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus。

圖6 菌株XLG2-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of strain XLG2-1

2.4 發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分的變化

由表3結(jié)果可知，對(duì)照組和發(fā)酵組的粗多糖含量差異極顯著(P<0.01)，粗蛋白、粗灰分、小肽含量有顯著差異(P<0.05)，而粗脂肪和粗纖維含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。發(fā)酵后的粗蛋白含量比對(duì)照組提高了0.41百分點(diǎn)，小肽和粗多糖含量分別比對(duì)照組提高了11.5和10.4百分點(diǎn)。發(fā)酵組的粗脂肪、粗纖維和粗灰分含量分別比對(duì)照組降低了0.21、0.25和0.02百分點(diǎn)。

表3 西蘭花莖葉發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分的變化Table 3 Changes in nutrient composition of stem and leaf of Brassica oleracea before and after fermentation

2.5 發(fā)酵前后掃描電鏡對(duì)比

將發(fā)酵前后的西蘭花廢棄莖葉進(jìn)行電鏡掃描，從圖7結(jié)果可知，發(fā)酵前西蘭花廢棄莖葉的結(jié)構(gòu)比較完整、緊密，發(fā)酵后樣品的結(jié)構(gòu)疏松，表面有大量孔洞(箭頭指向)，有利于微生物附著。與對(duì)照相比，菌株XLG2-1能利用西蘭花廢棄莖葉生長(zhǎng)繁殖，并破壞其結(jié)構(gòu)。

1和2分別為對(duì)照組和發(fā)酵組。圖7 西蘭花莖葉發(fā)酵前后掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy of broccoli stems and leaves before and after fermentation

3 結(jié)論與討論

3.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

土壤的成分非常復(fù)雜，不僅包括氧化的腐殖質(zhì)、動(dòng)植物殘骸和微生物分解的有機(jī)質(zhì)，還有豐富的土壤微生物[13]。由于西蘭花中含有較高含量的纖維素，西蘭花種植土壤中可能含有較多的纖維素降解菌，因此，本實(shí)驗(yàn)以西蘭花種植土壤為樣品，采用剛果紅平板染色和酶活性測(cè)定法篩選獲得一株纖維素降解菌，經(jīng)測(cè)序鑒定為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus，該菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)CMC活性為12.79 U·mL-1，F(xiàn)PA活性為8.99 U·mL-1。本研究與趙龍妹等[14]和吳潔等[15]的報(bào)道相同，表明土壤中含有豐富的功能微生物菌種，其中芽孢桿菌屬下的部分菌種具有產(chǎn)纖維素酶特性和纖維素降解能力。本研究顯示，菌株XLG2-1具有較高的產(chǎn)CMC能力，趙龍妹等[14]從玉米田篩選的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)XT2，李文兵等[16]從牛糞中篩選的內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillusendophticus)CK41，及王堯悅等[17]篩選獲得的枯草芽孢桿菌N3的CMC活性。以上酶活力結(jié)果存在差異可能與菌種來(lái)源及培養(yǎng)條件等有關(guān)。

3.2 西蘭花廢棄莖葉發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分分析

西蘭花莖葉粉中粗蛋白含量高達(dá)23.0%，除此之外還含有粗脂肪(4.24%)、粗灰分(12.2%)和粗纖維(7.36%)[18]。由于其較高的粗蛋白含量，可以作為畜禽的蛋白資源。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后西蘭花廢棄莖葉中粗纖維含量明顯降低了0.25百分點(diǎn)，粗多糖含量有明顯提高，比對(duì)照組提高了10.4百分點(diǎn)，并且掃描電鏡結(jié)果顯示，西蘭花廢棄莖葉的結(jié)構(gòu)被破壞，說(shuō)明菌株XLG2-1能在一定程度上降解纖維，將其轉(zhuǎn)化為單糖或二糖，作為自身生長(zhǎng)的碳源。同時(shí)，在發(fā)酵過(guò)程中粗蛋白和小肽含量也有明顯提高，這可能與菌株XLG2-1較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力有關(guān)，將原料中大分子蛋白降解為小分子肽。同時(shí)，菌株自身的生長(zhǎng)也會(huì)引起蛋白含量的增加。張立靜等[19]篩選獲得一株具有較好纖維素降解能力的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)T-7，當(dāng)蔗糖和尿素的添加量分別為2%時(shí)，纖維素降解率在第8 d達(dá)到40.34%。田久東[20]從田間土壤中分離獲得產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，將其組成復(fù)合菌種，發(fā)酵西蘭花渣50%、米糠粕20%、麩皮20%、噴漿玉米皮10%組成的飼料，發(fā)酵后飼料中酸溶蛋白含量為6.68%，與對(duì)照組(未添加發(fā)酵劑)相比含量提高150%，粗蛋白和還原糖含量分別為23.5%和3%，相較于對(duì)照組分別提高了15%和50%。以上結(jié)果表明，將菌株XLG2-1用于西蘭花廢棄莖葉發(fā)酵可達(dá)到降解纖維素，改善粗蛋白和小肽含量的目的。本研究的結(jié)果對(duì)于緩解農(nóng)業(yè)廢棄物污染問(wèn)題以及非常規(guī)飼用原料的資源化開(kāi)發(fā)都具有十分重要的意義。