吳幫林,張偉,朱榮譽,吳述軒,朱賢林

丙泊酚是具有蘇醒快、麻醉誘導時間短、起效迅速等優(yōu)點的常見靜脈全身麻醉藥物,臨床應用較為廣泛,但其可能造成患者認知、記憶功能下降,其病程短則數(shù)天,長則數(shù)月,在嚴重情況下可伴隨終身,對患者身心健康造成了嚴重影響,但丙泊酚影響認知及記憶功能的具體機制尚未完全明確[1-3]。環(huán)腺苷酸/環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAMP/CREB)信號通路可促進神經細胞存活、分化、再生,為細胞內經典傳導途徑之一,但cAMP/CREB信號通路在丙泊酚麻醉致大鼠認知功能損傷及記憶功能下降的確切作用有待進一步探討[4-6]?；诖?本研究探索分析了cAMP/CREB信號通路對丙泊酚麻醉致大鼠認知功能損傷、記憶功能的影響及其機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物: 選取SPF級Wistar大鼠30只,月齡5～11個月,體質量210～300 g,購自廣州博垚生物科技有限公司,均在濕度40%～60%、室溫22～28℃的清潔級動物房中進行適應性喂養(yǎng)5 d,而后進行實驗。動物許可證號:SYXK(粵)2023-0318,參照動物實驗倫理要求的相關規(guī)定進行本實驗操作,且經醫(yī)院倫理委員會批準同意(20210612)。(2)試藥試劑 :丙泊酚購自上海撫生實業(yè)有限公司(貨號S30930-25g),8-溴-環(huán)腺苷酸(8-Br-cAMP)購自艾美捷科技有限公司(貨號14431-10),酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于上海烜雅生物科技有限公司(貨號XY2479A),cAMP、CREB 抗體購于深圳市豪地華拓生物科技有限公司(貨號PL0403123)。(3)儀器設備: Morris水迷宮購自北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司(型號 ACT-200A),光學顯微鏡購于北京中西華大科技有限公司(型號 SS62-XTL-220),酶標儀購于山東萊恩德智能科技有限公司(型號 LD-96A),PCR儀購自上海凌儀生物科技有限公司(型號 2720)。

1.2 實驗方法 2021年12月—2022年2月于湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院動物實驗室進行實驗。參照文獻[7]方法建立丙泊酚麻醉大鼠模型。 30只大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后隨機數(shù)字表法分為對照組、丙泊酚組、8-Br-cAMP+丙泊酚組各10只。8-Br-cAMP+丙泊酚組大鼠大腦側室注射cAMP/CREB信號通路激動劑8-Br-cAMP 10 μl,注射10 min后,對丙泊酚組、8-Br-cAMP+丙泊酚組大鼠尾靜脈分別注射入丙泊酚10 mg/kg,待翻正反射消失后以丙泊酚24 mg·kg-1·h-1維持麻醉 2 h,以大鼠出現(xiàn)呼吸變慢、角膜反射遲鈍、皮膚痛覺消失為建模成功。對照組大鼠肌內注射0.9%氯化鈉4 ml/100 g。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 大鼠一般情況觀察:于麻醉后第1天對各組大鼠精神、毛發(fā)、活動、進食情況進行觀察記錄。

1.3.2 Morris水迷宮測試:于麻醉后第1天進行Morris水迷宮測試,將高50 cm、直徑120 cm、水溫25℃的圓形水池分為4個象限,在第1象限設置直徑高30 cm、寬10 cm平臺,平臺、水池內部均為白色,水池四周為形狀、顏色不同的視標,為防止大鼠看見水下平臺,水中放置鈦白粉,實驗分為學習階段5 d、記憶階段1 d。在學習階段于每天同一時間在象限中點將大鼠投入水中,攝像頭記錄大鼠60 s內尋找平臺所需時間(逃避潛伏期),若超過60 s則記為60 s,每天進行4次學習,將第5天逃避潛伏期作為最終結果,第6天將平臺撤去,將大鼠放入水池任一象限,記錄其穿越平臺次數(shù)。

1.3.3 曠場分析實驗:于麻醉后第2天進行曠場分析實驗,曠場分析箱為黑色無頂塑料箱(80 cm×80 cm×40 cm),箱底均分為9格,將大鼠置于中央格,進行5 min自由探索,通過圖像監(jiān)視系統(tǒng)對大鼠理毛次數(shù)、中央格停留時間、跨格次數(shù)(至少3肢跨入鄰格)、站立次數(shù)(前肢離地>1 cm)進行統(tǒng)計記錄,每只大鼠完成測試后場地采用75%乙醇進行擦拭。

1.3.4 病理學觀察:于上述實驗完成后,將大鼠麻醉后處死,獲取大鼠海馬組織,制成標本,-80℃保存。海馬組織通過梯度酒精脫水、石蠟包埋后將其切薄片,厚5 μm,烘干后脫蠟,采用梯度酒精、蒸餾水行水化及洗滌,之后使用HE染色,于光學顯微鏡下對大鼠海馬組織病理形態(tài)變化進行觀察。

1.3.5 海馬組織氧化應激指標水平檢測:取1.3.4中保存待檢海馬組織,按照試劑盒說明書制作海馬組織勻漿,離心留取上清液,通過ELISA法檢測各組大鼠海馬組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。ELISA 試劑盒由常州貝源鑫生物科技有限公司提供。

1.3.6 海馬組織cAMP、CREB mRNA表達量檢測:取1.3.4中保存待檢海馬組織,提取總RNA,以實時熒光定量法鑒定cAMP、CREB mRNA表達量,海馬組織中的RNA使用Takara逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA,引物序列采用Primer 5.0軟件設計,啟動PCR儀。通過2-△△Ct方法計算出cAMP、CREB的mRNA表達量。

1.3.7 海馬組織cAMP、CREB蛋白檢測:大鼠海馬組織中蛋白依照組織蛋白提取試劑盒說明進行萃取,cAMP、CREB表達量通過Western Blot法進行檢測,于每孔加入海馬組織蛋白80 μg后進行SDS-PDGE電泳,電泳結束后將蛋白電轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉對PVDF膜進行封閉,cAMP、CREB一抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后將cAMP、CREB二抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次,化學發(fā)光顯影采用ECL,以GAPDH為內參,相對條帶灰度光密度值采用Image J軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行

2 結 果

2.1 3組大鼠一般情況觀察 對照組大鼠大小便、進食、活動正常,反應靈敏,毛發(fā)光亮、顏色正常;丙泊酚組大鼠脫毛明顯,毛發(fā)無光澤,反應及行動遲緩,精神萎靡;8-Br-cAMP+丙泊酚組大鼠相對活潑好動,毛發(fā)光亮,進食正常,脫毛不明顯。

2.2 3組大鼠Morris水迷宮測試結果比較 與對照組比較,丙泊酚組大鼠逃避潛伏期時間延長,穿越平臺次數(shù)下降(P<0.01);與丙泊酚組比較,8-Br-cAMP+丙泊酚組大鼠逃避潛伏期時間縮短,穿越平臺次數(shù)上升(P<0.01),見表1。

表1 3組大鼠Morris水迷宮測試結果比較Tab.1 Comparison of Morris water maze test results among three groups of rats

2.3 3組大鼠曠場分析比較 與對照組比較,丙泊酚組理毛次數(shù)、跨格次數(shù)、站立次數(shù)下降,中央格停留時間延長(P<0.01);與丙泊酚組比較,8-Br-cAMP+丙泊酚組理毛次數(shù)、跨格次數(shù)、站立次數(shù)上升,中央格停留時間縮短(P<0.01),見表2。

表2 3組大鼠曠場分析比較Tab.2 Comparison of open field analysis among three groups of rats

2.4 3組大鼠海馬組織病理學變化比較 對照組大鼠海馬區(qū)細胞基本無壞死,且分布均勻;丙泊酚組大鼠海馬區(qū)細胞數(shù)量缺失明顯且分布散亂,壞死細胞較多;8-Br-cAMP+丙泊酚組大鼠海馬區(qū)細胞壞死細胞較少,且分布均勻,見圖1。

圖1 光鏡下大鼠海馬區(qū)組織病理變化對照(HE染色,×200)Fig.1 Comparison of pathological changes in rat hippocampal tissue under light microscopy (HE staining, × 200)

2.5 3組大鼠海馬組織氧化應激指標比較 與對照組比較,丙泊酚組MDA水平上升,SOD水平下降(P<0.01);與丙泊酚組比較,8-Br-cAMP+丙泊酚組MDA水平下降,SOD水平上升(P<0.01),見表3。

表3 3組大鼠海馬組織氧化應激指標水平比較Tab.3 Comparison of oxidative stress index levels in hippocampal tissue of three groups of rats

2.6 3組大鼠海馬組織cAMP、CREB mRNA表達量比較 與對照組比較,丙泊酚組cAMP、CREBmRNA表達量均下降(P<0.01);與丙泊酚組比較,8-Br-cAMP+丙泊酚組cAMP、CREB mRNA表達量均上升(P<0.01),見表4。

表4 3組大鼠cAMP、CREB mRNA表達量比較Tab.4 Comparison of cAMP and CREB mRNA expression levels among three groups of rats

2.7 3組大鼠海馬組織cAMP/CREB信號通路相關蛋白相對表達量比較 與對照組比較,丙泊酚組cAMP、CREB蛋白相對表達量均下降 (P<0.01);與丙泊酚組比較,8-Br-cAMP+丙泊酚組cAMP、CREB蛋白相對表達量均上升 (P<0.01),見表5、圖2。

圖2 3組大鼠海馬組織cAMP/CREB信號通路相關蛋白WB圖Fig.2 WB diagram of cAMP/CREB signaling pathway related proteins in the hippocampus of three groups of rats

表5 3組大鼠海馬組織cAMP/CREB信號通路相關蛋白相對表達量比較Tab.5 Comparison of relative expression levels of cAMP/CREB signaling pathway related proteins in hippocampal tissue of three groups of rats

3 討 論

丙泊酚是在臨床各科手術麻醉中廣泛應用的新型靜脈麻醉藥,但有學者認為,丙泊酚可能造成長時期行為改變,記憶、學習功能異常等[8-9]。本研究通過尾靜脈注射丙泊酚模擬臨床丙泊酚麻醉過程,發(fā)現(xiàn)丙泊酚麻醉可延長逃避潛伏期及中央格停留時間,減少穿越平臺、理毛、跨格、站立次數(shù),其結果與既往研究中丙泊酚誘導大鼠認知功能損傷結果相符[10]。

本研究結果顯示,8-Br-cAMP+丙泊酚組逃避潛伏期時間短于丙泊酚組,穿越平臺次數(shù)多于丙泊酚組,中央格停留時間短于丙泊酚組,理毛、跨格、站立次數(shù)多于丙泊酚組。水迷宮實驗基本原理是利用鼠類本能尋找水中休息場所、先天游泳能力,判斷其記憶、學習能力,近年來逐漸應用于大鼠認知功能的評估中[11-13]。曠場分析實驗的原理是基于動物活動具有畏懼、趨避空曠場地、探索新環(huán)境,可反映出動物面對新環(huán)境時的情緒變化、習慣、探究行為,其中理毛、跨格、站立可對動物自身興奮性、新環(huán)境滿意程度進行反映,理毛、跨格、站立次數(shù)隨興奮性、滿意度的提升而增加;中央格停留時間可反映動物認知空間的能力,正常情況下動物可避開空曠環(huán)境活動,因此可迅速離開中央格,若其新環(huán)境認知能力較差或存在認知功能障礙則可延長其中央格停留時間[14-16]。上述結果均提示激活cAMP/CREB信號通路可改善丙泊酚麻醉造成的大鼠興奮性、環(huán)境適應力下降,提升認知、記憶能力。

有關學者研究發(fā)現(xiàn)[17-19],激活cAMP/CREB信號通路可控制阿爾茨海默癥造成的認知障礙,且可改善衰老大鼠模型認知能力,其機制可能與清除氧自由基有關。本研究重點在于進一步明確cAMP/CREB信號通路對丙泊酚麻醉致認知功能損傷及記憶功能的影響,結果顯示,與對照組比較,丙泊酚組MDA水平上升,SOD水平下降,但8-Br-cAMP+丙泊酚組MDA水平低于丙泊酚組,SOD水平高于丙泊酚組,此外本研究HE染色結果顯示丙泊酚組大鼠海馬區(qū)細胞數(shù)量缺失明顯且分布散亂,壞死細胞較多,8-Br-cAMP+丙泊酚組大鼠海馬區(qū)細胞壞死較少,且分布均勻。提示丙泊酚可造成海馬組織內氧化應激水平上調,進而引發(fā)認知功能損傷及記憶功能下降,而激活cAMP/CREB信號通路可緩解氧化應激損傷,其結果與既往研究結果基本一致。分析其原因為:海馬組織是負責儲存信息的大腦邊緣系統(tǒng)部分,為記憶、學習的關鍵部位,當遭受氧化應激損傷時可造成海馬神經細胞凋亡,從而影響了認知、記憶能力[20-22]。麻醉藥品可造成小膠質細胞大量活化,促進氧自由基產生,使得MDA水平上升,SOD水平下降,氧化應激反應加劇[23]。cAMP/CREB信號通路在中樞神經系統(tǒng)中具有重要作用,可參與人類學習、記憶密切相關的神經細胞存活、分化,且可調節(jié)氧化應激反應[24]。以上結果均提示cAMP/CREB信號通路可能通過調控氧化應激反應影響丙泊酚麻醉大鼠的認知功能、記憶功能。

綜上所述,丙泊酚麻醉后大鼠伴隨逃避潛伏期時間、中央格停留時間延長,穿越平臺次數(shù)、理毛次數(shù)、跨格次數(shù)、站立次數(shù)下降等表現(xiàn),經cAMP/CREB信號通路激動劑8-溴-環(huán)腺苷酸干預后可改善上述情況,其機制可能與調節(jié)海馬組織氧化應激反應有關。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

吳幫林:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;張偉:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;朱榮譽:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù);吳述軒:課題設計,論文審核;朱賢林:進行統(tǒng)計學分析,論文審核