楊同昕,董建寧,施雪松,曹紅勇,楊維軍

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,全球每年新發(fā)患者190萬,死亡93.5萬[1]。CRC的治療包括手術(shù)、化療等,但腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率較高,患者生存預(yù)后較差[2]。脊椎蛋白2(Spondin 2,SPON2)屬于細(xì)胞基質(zhì)蛋白Spondin家族成員,能通過整合素家族識(shí)別病原體,參與先天免疫和適應(yīng)性免疫過程[3]。研究發(fā)現(xiàn),SPON2在肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[4-5],介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用,促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)是一種分泌型蛋白,參與調(diào)節(jié)骨骼鈣磷代謝、動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)過程[6]。近年來發(fā)現(xiàn),MGP在胃癌、乳腺癌等腫瘤中過度表達(dá),其通過與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖,是潛在的腫瘤標(biāo)志物[7]。目前CRC中SPON2、MGP表達(dá)的臨床意義尚不清楚,本研究通過檢測CRC中SPON2、MGP的表達(dá),分析兩者與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年1月—2020年1月南京市第一醫(yī)院普外科收治行手術(shù)治療CRC患者94例,男51例,女43例,年齡26～79(64.47±9.79)歲;腫瘤位置:直腸42例,結(jié)腸52例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例;腫瘤直徑≤5 cm者55例,>5 cm者39例;腫瘤TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期61例,Ⅲ期33例;腫瘤分化程度:高中分化59例,低分化35例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過,患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為CRC;②均為原發(fā)初診患者;③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①年齡<18歲或>80歲;②術(shù)前新輔助放化療或靶向治療;③復(fù)發(fā)性CRC、遺傳性CRC或合并其他惡性腫瘤;④合并其他嚴(yán)重臟器功能衰竭;⑤合并肺炎、泌尿系統(tǒng)感染等感染性疾病。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 SPON2、MGP蛋白表達(dá)檢測:留取術(shù)中獲取的部分CRC癌和癌旁組織(距離癌組織邊緣>5 cm)各約100 mg。將CRC癌和癌旁組織常規(guī)10%福爾馬林固定12 h,常規(guī)石蠟包埋后切片(切片機(jī)購自德國Leica公司,型號 RM2125 RTS),厚度4 μm,62℃烤片2 h后進(jìn)行免疫組化染色(試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司,貨號PV-9004)。二甲苯透明化及石蠟包埋, 切片層厚4 μm,62℃烤片2 h后,梯度乙醇水化,在100℃檸檬酸溶液中抗原熱修復(fù)10 min,加入一抗(兔抗人SPON2、MGP單克隆抗體,1∶200,購自美國abcam公司,貨號ab215451,ab273651),4℃過夜,加入二抗(HRP結(jié)合的羊抗兔抗體)37℃下孵育1 h,DAB顯色5 min,蘇木精復(fù)染后,鹽酸酒精分化,梯度乙醇脫水后中性樹膠密封。由2位病理科醫(yī)生在200倍顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號CX31)下閱片, SPON2、MGP蛋白陽性染色為細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色。采用半定量方法,根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比的乘積計(jì)算最終得分。染色強(qiáng)度評分:0分為無染色;1分為淡黃色染色;2分為棕黃色染色;3分為棕褐色染色。陽性細(xì)胞百分比評分:0分為≤5%;1分為6%～25%;2分為26%～50%;3分為51%～75%;4分為≥76%。最終評分>2分為陽性,≤2分為陰性。

1.3.2 隨訪情況:自CRC患者出院時(shí)開始隨訪,隨訪3年,第1年每3個(gè)月隨訪1次,第2～3年每6個(gè)月隨訪1次,隨訪終點(diǎn)時(shí)間為2023年1月。隨訪內(nèi)容為病史、體格檢查、腹盆腔超聲或CT等,記錄患者生存情況、生存時(shí)間等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier生存曲線,Log-Rank法比較不同SPON2、MGP表達(dá)生存曲線的差異。CRC預(yù)后影響因素分析采用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRC癌及癌旁組織中SPON2、MGP蛋白表達(dá)的差異比較 SPON2、MGP蛋白在CRC癌組織細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),部分表達(dá)于細(xì)胞核。CRC癌及癌旁組織中SPON2陽性率分別為65.96%(62/94)和6.38%(6/94)。CRC癌及癌旁組織中MGP陽性率分別為63.83%(60/94)和8.51%(8/94)。SPON2、MGP蛋白在CRC癌組織中的陽性率高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=72.251、62.298,P均<0.001)。

圖1 SPON2、MGP蛋白在CRC癌及癌旁組織中的表達(dá)差異(免疫組化染色,×200)Fig.1 Differential expression of SPON2 and MGP proteins in CRC cancer and adjacent tissues (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 SPON2、MGP表達(dá)在CRC不同臨床病理特征患者中比較 低分化程度、TNM分期Ⅲ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者SPON2、MGP陽性率分別高于高中分化、TNM分期I～Ⅱ期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表1。

表1 SPON2、MGP蛋白表達(dá)在CRC患者不同臨床病理特征中比較[例(%)]Tab.1 Comparison of SPON2 and MGP protein expression in different clinical and pathological characteristics of CRC patients

2.3 SPON2、MGP蛋白表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)系 CRC患者隨訪中死亡32例,失訪2例,3年生存率為65.22%(60/92)。SPON2陽性組、陰性組3年生存率分別為54.84%(34/62)和86.67%(26/30);MGP陽性組、陰性組3年生存率分別為53.33%(32/60)和87.50%(28/32)。SPON2陽性組、MGP陽性組3年累積生存率低于SPON2陰性組、MGP陰性組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/P=8.966/0.003、12.420/<0.001),見圖2。

圖2 Kaplan-Meier曲線分析SPON2、MGP蛋白表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Kaplan Meier curve analysis of the relationship between SPON2, MGP protein expression and prognosis in CRC patients

2.4 CRC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 以CRC患者預(yù)后為因變量,以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示:腫瘤TNM分期Ⅲ期、低分化程度、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、SPON2陽性、MGP陽性是影響CRC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,見表2。

表2 CRC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Tab.2 Multivariate Cox regression analysis of prognosis in CRC patients

3 討 論

CRC是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,男性常見,隨著人們生活水平及飲食方式的改變,其發(fā)病率有不斷升高的趨勢[8]。目前CRC的治療以手術(shù)輔以放化療的綜合治療為主,但術(shù)后仍有許多患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致不良預(yù)后。目前腫瘤TNM分期是臨床中評估CRC患者預(yù)后的主要依據(jù),但CRC具有高度異質(zhì)性的特點(diǎn),即使相同分期、相同治療方案的CRC患者,疾病進(jìn)展存在較大差距,許多患者不能獲益[9]。深入研究CRC疾病機(jī)制,尋找能夠有效評估預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物,對于CRC的個(gè)體化治療,具有重要意義。

SPON2編碼基因位于4p16.3,包含TSR結(jié)構(gòu)域和FS結(jié)構(gòu)域,能夠作為模式識(shí)別受體結(jié)合細(xì)菌脂多糖、整合素等識(shí)別病原體,啟動(dòng)內(nèi)源性免疫反應(yīng)。研究表明,肺癌中SPON2的表達(dá)能激活核因子κB信號通路,上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2和9的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。本研究中,CRC癌組織中SPON2表達(dá)上調(diào),提示SPON2可能與CRC的腫瘤發(fā)生有關(guān)。CRC中SPON2的表達(dá)受結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1的表達(dá)調(diào)控。研究表明,結(jié)腸癌組織中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1的表達(dá)異常升高,其能與SPON2基因啟動(dòng)子結(jié)合,促進(jìn)SPON2蛋白的過度表達(dá),增強(qiáng)CRC腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。本研究中,CRC中SPON2表達(dá)與不良臨床病理特征有關(guān),提示SPON2參與促進(jìn)CRC腫瘤的惡性進(jìn)展。分析其原因,CRC中SPON2能夠激活整合素β1/富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2,促進(jìn)單核細(xì)胞的細(xì)胞骨架重塑和跨內(nèi)皮遷移,并通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞中CC趨化因子配體2的表達(dá),誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化,促進(jìn)腫瘤免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤過度增殖和侵襲[12]。另外,SPON2表達(dá)升高還能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子A和C的表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的腫瘤血管新生及淋巴管生成,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生血行轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移[13]。本研究中,CRC組織中SPON2陽性表達(dá)的患者生存預(yù)后較差,提示SPON2是新的CRC預(yù)后評估的腫瘤標(biāo)志物。分析其原因,SPON2陽性的CRC腫瘤細(xì)胞惡性程度高,腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng),腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高,導(dǎo)致患者預(yù)后較差。有學(xué)者利用高親和力SPON2肽配體競爭性結(jié)合靶向SPON2的SH結(jié)構(gòu)域保守殘基,降低SPON2的生物學(xué)活性,結(jié)果胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力明顯受到抑制,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存率也顯著增加[14]。因此,SPON2的表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展,是新的CRC預(yù)后評估腫瘤標(biāo)志物,以SPON2為靶點(diǎn)是潛在的CRC治療方案,值得臨床深入研究。

MGP是人體內(nèi)血管和軟骨鈣化的抑制因子,廣泛表達(dá)于骨、心臟及肺臟等人體組織中,參與骨組織代謝和異位鈣化。近年來發(fā)現(xiàn),MGP mRNA在乳腺癌、腎癌、肝癌和卵巢癌中均異常表達(dá)上調(diào),可能是新的腫瘤早期診斷及預(yù)后評估的腫瘤標(biāo)志物[7, 15]。本研究中,CRC癌組織中MGP表達(dá)上調(diào),提示MGP可能參與CRC的腫瘤發(fā)生。CRC中MGP的表達(dá)上調(diào)與Wnt通路的激活有關(guān)。研究表明,CRC中存在Wnt/β-連環(huán)蛋白通路過度激活的現(xiàn)象,β-連環(huán)蛋白活化后進(jìn)入細(xì)胞核并在轉(zhuǎn)錄水平直接上調(diào)MGP的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞干性特征形成,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[16-17]。本研究中,MGP表達(dá)與CRC不良臨床病理特征有關(guān),提示MGP促進(jìn)CRC的腫瘤進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),CRC中MGP的表達(dá)升高能夠磷酸化激活核因子κB,上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面程序性死亡因子配體1的表達(dá),其能結(jié)合CRC腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞表面的程序性死亡因子1,促進(jìn)CD8+T細(xì)胞耗竭及免疫效應(yīng)能力的降低,導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸及腫瘤進(jìn)展[18]。另有研究報(bào)道,CRC腫瘤細(xì)胞中MGP的表達(dá)上調(diào)能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度,促進(jìn)p65磷酸化,進(jìn)而上調(diào)癌基因c-MYC、細(xì)胞間黏附分子1和血管內(nèi)皮生長因子A的表達(dá),增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移能力[19]。本研究中,CRC癌組織中MGP陽性是CRC患者不良生存預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示檢測CRC癌組織中MGP的表達(dá)有助于評估CRC患者的生存預(yù)后。分析其原因,一方面是MGP陽性表達(dá)的CRC腫瘤細(xì)胞惡性程度高,腫瘤轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng),術(shù)中難以徹底切除,術(shù)中殘留的微小病灶均能增加術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面,MGP的表達(dá)能夠增強(qiáng)CRC腫瘤細(xì)胞對放化療等治療的抵抗性,降低術(shù)后輔助治療療效。有研究發(fā)現(xiàn),CRC中MGP的過表達(dá)能夠通過上調(diào)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1,下調(diào)P型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶,提高腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性,而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中敲除MGP的表達(dá)能夠顯著增加CRC腫瘤細(xì)胞系對奧沙利鉑的敏感性[20]。因此,MGP參與CRC腫瘤的發(fā)生發(fā)展,是新的評估CRC預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述,CRC中SPON2、MGP表達(dá)升高,兩者與CRC患者的TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),均參與CRC的腫瘤進(jìn)展過程。腫瘤TNM分期Ⅲ期、低分化程度、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、SPON2陽性、MGP陽性是影響CRC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。臨床醫(yī)師可根據(jù)CRC癌組織中SPON2、MGP的表達(dá),同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)TNM分期、腫瘤分化程度等臨床病理特征,對CRC患者生存預(yù)后進(jìn)行評估,指導(dǎo)臨床診治。本研究也存在不足,為單中心回顧性研究,樣本量有限,有待今后設(shè)計(jì)前瞻性多中心大樣本臨床試驗(yàn),深入研究SPON2、MGP的臨床價(jià)值。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊同昕:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;董建寧:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;施雪松:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;曹紅勇:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;楊維軍:課題設(shè)計(jì),論文撰寫