張小雪,劉曉婷,李陽,于韜,鄔曉明,高巋然

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,我國乳腺癌發(fā)病率52.81/10萬,死亡率約13.40/10萬[1]。近年來隨著人口老齡化,60歲以上老年乳腺癌患者患病例數(shù)逐漸增多[2]。多聚嘧啶結(jié)合蛋白3(polypyrimidine tract binding protein 3,PTBP3)是一種RNA結(jié)合蛋白,通過RNA識別基序與RNA相互作用,在RNA剪接、成熟、定位和翻譯中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。研究表明,PTBP3的表達失調(diào)與腫瘤發(fā)生和進展有關(guān),如乳腺癌中PTBP3的高表達能阻止ZEB1 mRNA降解來促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤進展[4]。泛素特異性蛋白酶28(ubiquitin specific peptidase 28,USP28)是去泛素化蛋白水解酶家族成員,主要表達于心臟和肌肉中,參與DNA損傷、細胞凋亡等過程的調(diào)控[5]。研究表明,USP28能夠穩(wěn)定促癌蛋白賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1,促進乳腺癌細胞的肝細胞樣特征和腫瘤惡性進展[6]。目前PTBP3、USP28在老年乳腺癌患者中的表達及臨床意義尚不明確。本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌組織中PTBP3、USP28表達,分析兩者與臨床病理特征的關(guān)系及在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的評估價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年2月—2020年2月遼寧省腫瘤醫(yī)院乳腺外科診治老年乳腺癌患者178例,均為女性,年齡60～81(68.41±7.63)歲;病程6～58(12.14±6.89)d;合并高血壓42例、糖尿病21例;有乳腺癌家族史4例;病理類型:浸潤性癌88例,非浸潤性癌90例;腫瘤分化程度:高分化40例,中分化68例,低分化70例;腫瘤TNM分期:Ⅱ期92例,Ⅲ期86例;根據(jù)病理檢查中雌激素受體、孕激素受體及表皮生長因子受體2的表達情況,分為Luminal A型53例,Luminal B型50例,HER2型36例,三陰性型39例。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(201705K1),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①均接受乳腺癌改良根治術(shù)治療,經(jīng)術(shù)后病理組織檢查明確診斷為乳腺癌;②首次診治,術(shù)后結(jié)合放療及化療;③臨床和病理資料完整;④年齡≥60歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①男性患者;②合并急慢性炎性疾病或自身免疫性疾病;③合并其他惡性腫瘤;④雙側(cè)乳腺癌或腫瘤已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 組織中PTBP3、USP28表達檢測:采用免疫組織化學(xué)法,試劑盒購自北京中杉金橋公司,貨號 PV-9004。留取術(shù)中獲取的癌和癌旁組織,分別約100 mg,以10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片,65℃烤片2 h,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,檸檬酸鹽溶液中微波爐中抗原熱修復(fù)10 min,3%雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶,3%羊血清封閉2 h,加入兔抗人PTBP3單克隆抗體(稀釋比為1∶200,購自賽默飛公司,貨號PA5-30344),USP28單克隆抗體(稀釋比為1∶100,購自Abcam公司,貨號ab70893),4 ℃孵育16 h,二抗室溫孵育2 h,DAB顯色10 min,蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化,自來水中返藍。在光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號BX43)下觀察進行半定量染色評分,染色強度(0分:無染色,1分:淺黃色,2分:棕褐色),染色面積(0分:≤25%,1分:>25%～50%,2分:>50%)。兩項乘積為最終免疫組化評分,<2分判定為陰性,≥2分判定為陽性。

1.3.2 隨訪:所有患者以門診復(fù)診及電話回訪方式進行隨診,隨訪3年,第1年每3個月隨訪1次,第2～3年每6個月隨訪1次。隨訪截止至2023年3月1日。記錄末次隨訪時間,患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的時間。隨訪終點為患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或隨訪時間結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示,2組樣本率(%)比較采用卡方檢驗。采用Kaplan-Meier法分析PTBP3、USP28表達對老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響;單因素及多因素Cox回歸分析影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織中PTBP3、USP28表達 乳腺癌組織中PTBP3棕褐色陽性染色主要位于細胞核;USP28棕褐色陽性染色主要位于細胞質(zhì)。乳腺癌組織中PTBP3、USP28陽性率分別為65.17%(116/178)、67.42%(120/178),顯著高于癌旁組織12.92%(23/178)、11.24%(20/178),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2/P=102.080/<0.001、117.725/<0.001)。

圖1 乳腺癌和癌旁組織中PTBP3、USP28表達(免疫組化染色,×200)Fig.1 Expression of PTBP3 and USP28 in breast cancer and adjacent tissues (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 乳腺癌中PTBP3、USP28表達在不同臨床病理參數(shù)中的差異 乳腺癌組織中PTBP3、USP28陽性率在 TNM分期Ⅲ期、中低分化程度高于TNM分期Ⅱ期、高分化程度,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01),見表1。

表1 乳腺癌中PTBP3、USP28表達在不同臨床病理參數(shù)中的差異比較 [例(%)]Tab.1 Comparison of PTBP3 and USP28 expressions in different clinicopathological parameters in breast cancer

2.3 PTBP3、USP28表達對老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響 178例患者隨訪3年,失訪1例,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移38例。3年無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為78.53%(139/177)。3年無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率PTBP3陽性組為70.43%(81/115),低于陰性組的93.55%(58/62)(Log Rankχ2=12.521,P<0.001);3年無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率USP28陽性組為72.27%(86/119),低于陰性組的91.38%(53/58)(Log Rankχ2=8.511,P=0.003),見圖2。

圖2 PTBP3、USP28表達對老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響Fig.2 Effect of PTBP3 and USP28 expression on postoperative recurrence and metastasis of elderly breast cancer patients

2.4 多因素Cox回歸分析影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素 以老年乳腺癌患者是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移為因變量(1=是,0=否),以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量進行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示: PTBP3陽性、USP28陽性、腫瘤分期Ⅲ期、中低分化程度是影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素,見表2。

表2 多因素Cox回歸分析影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素Tab.2 Multifactor Cox regression analysis of factors affecting postoperative recurrence and metastasis of elderly breast cancer patients

3 討 論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤,是全球范圍內(nèi)女性癌癥相關(guān)死亡的首要原因[7]。手術(shù)聯(lián)合輔助化療和放療能夠有效提高乳腺癌患者生存率,但老年乳腺癌患者具有重要器官功能衰退、合并基礎(chǔ)疾病增多及手術(shù)耐受力變差等特點,容易發(fā)生術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8]。因此,尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測老年乳腺癌預(yù)后的指標(biāo),對于選擇個體化的治療方案,減少術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生,具有重要意義。

PTBP3屬于多嘧啶序列結(jié)合蛋白家族成員,其作為RNA 結(jié)合蛋白,在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年來發(fā)現(xiàn),PTBP3在胃癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中異常表達升高[9-10],其能上調(diào)TWIST等基因的表達,促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。本研究中,乳腺癌組織中PTBP3陽性表達率更高,提示PTBP3參與乳腺癌的腫瘤發(fā)生。乳腺癌中PTBP3的表達受缺氧微環(huán)境的調(diào)節(jié)。有學(xué)者報道,乳腺癌中缺氧微環(huán)境能夠促進長鏈非編碼RNA BCRT1的過度表達,其競爭性結(jié)合微小RNA-1303,阻止PTBP3 mRNA的降解,導(dǎo)致乳腺癌中PTBP3蛋白表達升高,PTBP3一方面促進乳腺癌腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲,還能夠通過外泌體途徑,介導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化,降低機體抗腫瘤的免疫殺傷作用,促進乳腺癌腫瘤細胞的免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤過度增殖[11]。本研究中,PTBP3表達與乳腺癌不良臨床病理特征有關(guān),提示PTBP3的表達參與促進乳腺癌的腫瘤進展。有研究報道,PTBP3能夠通過結(jié)合ZEB1 mRNA的3’非編碼區(qū),阻止其降解,ZEB1作為轉(zhuǎn)錄因子,能夠上調(diào)間質(zhì)性標(biāo)志物N-鈣黏素及波形蛋白等的表達,誘導(dǎo)乳腺腫瘤細胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進腫瘤細胞遷移、侵襲和干細胞特性形成,增強乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力,導(dǎo)致腫瘤TNM分期增高,降低腫瘤細胞的分化程度[12]。本研究中,PTBP3陽性老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,表明PTBP3表達有助于評估老年乳腺癌患者預(yù)后。分析其原因,一方面是PTBP3陽性表達的腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強,肉眼難以分辨的微小轉(zhuǎn)移病灶術(shù)中難以徹底切除,造成術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[13]。另一方面可能是PTBP3陽性表達的乳腺癌腫瘤細胞呈現(xiàn)干細胞特征,對紫杉醇等化療藥物的耐藥性增強,老年乳腺癌患者術(shù)后輔助化療治療的敏感性降低。研究發(fā)現(xiàn),PTBP3能夠與自噬相關(guān)蛋白-12 mRNA的3’-非編碼區(qū)中的多個位點結(jié)合,導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白-12的過度表達,促進細胞自噬,增加腫瘤細胞對吉西他濱等化療藥耐藥性的形成[14]。因此,PTBP3可能是新的評估老年乳腺癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

USP28基因位于人類11號染色體,具有N端泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能夠輔助識別和招募泛素鏈底物,發(fā)揮去泛素水解酶的活性。研究表明,USP28在肺鱗癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中過度表達,其能夠增強叉頭盒C1等癌基因的蛋白穩(wěn)定性,促進腫瘤有氧糖酵解,促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[15-16]。本研究中,乳腺癌組織中USP28陽性表達率較癌旁組織更高,與腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān),表明USP28參與乳腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展。乳腺癌中USP28的表達受缺氧誘導(dǎo)因子1α的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌缺氧環(huán)境會上調(diào)腫瘤細胞中缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達,缺氧誘導(dǎo)因子1α能夠通過激活SUMO特異性蛋白酶1,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)USP28的表達[17]。另外,USP28作為具有腫瘤促進作用的去泛素化酶,進一步促進缺氧誘導(dǎo)因子-1α的去泛素化修飾,增加缺氧誘導(dǎo)因子-1α的穩(wěn)定性,激活下游血管內(nèi)皮生長因子等促癌基因表達,導(dǎo)致腫瘤血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。Chen等[18]發(fā)現(xiàn),腫瘤相關(guān)成纖維細胞衍生的外泌體顯著促進了乳腺癌MDA-MB-231和MCF7細胞中miR-500a-5p的表達,miR-500a-5p與USP28結(jié)合協(xié)同促進腫瘤增殖。本研究中,USP28陽性老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險明顯增加,提示USP28是新的評估老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)后腫瘤標(biāo)志物。研究表明,USP28的表達升高能夠募集到DNA損傷位點,增強DNA 重組修復(fù)基因Np63的表達,降低對順鉑等化療治療的敏感性[19]。尚有研究證實,應(yīng)用USP28特異性抑制劑能夠增強p53蛋白穩(wěn)定性,促進DNA損傷中p53依賴的G2/M期阻滯,增加放化療治療的敏感性[20]。因此,乳腺癌中USP28的表達促進腫瘤惡性進展,可能是評估老年乳腺癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述,老年乳腺癌組織中PTBP3、USP28表達升高,與腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān),均參與老年乳腺癌的腫瘤進展。PTBP3陽性、USP28陽性是影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素,是新的評估老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)志物。本研究也存在局限,樣本量有限,未能對不同臨床特征的患者進行分層研究,有待今后設(shè)計大樣本前瞻性多中心臨床研究,進一步研究兩者的臨床價值。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張小雪:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;劉曉婷:實施研究過程,數(shù)據(jù)收集,分析整理;李陽:課題設(shè)計,收集病例,資料整理收集,分析試驗數(shù)據(jù);于韜:論文審核,論文修改;鄔曉明:進行統(tǒng)計學(xué)分析,資料整理收集;高巋然:提出研究思路,課題設(shè)計,論文修改