黃其峰,童薇,劉洋,江小偉,劉萍

慢性腎小球腎炎是雙側(cè)腎小球彌漫或局部發(fā)生炎性反應(yīng)的腎小球免疫損傷性疾病[1]。若治療不及時(shí),易發(fā)展為腎功能衰竭[2]。因此臨床上急需可靠的慢性腎小球腎炎預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。以往研究發(fā)現(xiàn),微小RNA(miR)-181a-5p、miR-132-5p均與炎性反應(yīng)有關(guān),可抑制神經(jīng)炎性反應(yīng),延緩神經(jīng)功能減退的進(jìn)展[3-5]。腎小球腎炎早期病變?yōu)橄的ぜ?xì)胞增殖等,Liang等[6]研究顯示,在高糖處理的腎小球系膜細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)顯著下降,miR-181a-5p過(guò)表達(dá)能抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖,并降低白介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。孫楓等[7]報(bào)道顯示,在高糖處理的腎小球系膜細(xì)胞中miR-132-5p表達(dá)顯著下調(diào),miR-132-5p過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡,并降低IL-6和TNF-α水平。但目前并無(wú)miR-181a-5p和miR-132-5p在慢性腎小球腎炎中的相關(guān)報(bào)道,因此本研究擬探討慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p和miR-132-5p水平以及二者與預(yù)后的關(guān)系,旨在為減少慢性腎小球腎炎不良預(yù)后的發(fā)生提供參考,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年4月中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院腎內(nèi)科收治的慢性腎小球腎炎患者128例作為慢性腎小球腎炎組(腎炎組),男73例,女55例,年齡30～75(55.21±10.11)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18.61～25.04(22.71±3.79)kg/m2;病理類(lèi)型:IgA系膜增生性腎小球腎炎47例,非IgA系膜增生性腎小球腎炎34例,系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎16例,膜性腎病22例,局灶節(jié)段性腎小球硬化9例。選取同期醫(yī)院體檢健康者130例作為健康對(duì)照組(對(duì)照組),男67例,女63例,年齡29～72(54.95±10.28)歲;BMI為18.52～24.76(22.45±3.64)kg/m2。2組人員的性別、年齡、BMI比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LCL審第20170069號(hào)),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均符合慢性腎小球腎炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8],經(jīng)腎穿刺活檢證實(shí),且為初次確診;②年齡>18歲且肝功能正常;③病例資料完整且配合隨訪。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并腫瘤患者;②合并嚴(yán)重肝功能障礙患者;③合并嚴(yán)重感染性疾病、泌尿系統(tǒng)感染患者;④近6個(gè)月使用腎毒性藥物患者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-181a-5p、miR-132-5p表達(dá)檢測(cè):患者入院后翌日清晨、健康者體檢時(shí)采集空腹肘靜脈血7 ml,離心留取血清,保存在-70℃冰箱中。使用血清總RNA純化試劑盒(批號(hào)WH9042,購(gòu)自揚(yáng)州萬(wàn)禾生物科技公司)提取樣品中總RNA,用10 ng總RNA依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)WH2730,購(gòu)自揚(yáng)州萬(wàn)禾生物科技公司)反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)Pangaea,購(gòu)自北京深藍(lán)云生物科技公司)對(duì)miR-181a-5p、miR-132-5p及內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),miR-181a-5p上游引物:5'-GGAGAACATTCAACGCTGT-3',下游引物:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3';miR-132-5p上游引物:5'-ACCGTGGCTTTCGATTGTTACT-3',下游引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';U6上游引物:5'-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3',下游引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物由上海生工合成。反應(yīng)條件:95℃ 5 min、 95℃ 19 s、62℃ 22 s、72℃ 23 s,共計(jì)36個(gè)循環(huán)。對(duì)miR-181a-5p、miR-132-5p相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT法計(jì)算。

1.3.2 腎功能指標(biāo)檢測(cè):取血清樣本,全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)BX-3010,購(gòu)自日本希森美康公司)檢測(cè)尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平;并計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)[9]。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定胱抑素C(CysC)水平,試劑盒批號(hào)GH-29346,購(gòu)自南昌和利思生物技術(shù)公司。

1.3.3 隨訪:慢性腎小球腎炎患者治療后隨訪3年,起始日期為患者治療后出院當(dāng)日,隨訪截止日期為出院當(dāng)日后第3年。根據(jù)患者病情進(jìn)展情況分為:預(yù)后不良亞組26例病情進(jìn)展為終末期腎病,即eGFR<15 ml·min-1·1.73 m-2),預(yù)后良好亞組(病情無(wú)進(jìn)展,未發(fā)展為終末期腎病)102例。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平比較 與對(duì)照組比較,腎炎組血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組和腎炎組血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-181a-5p and miR-132-5p levels between the control group and the nephritis group

2.2 2組腎功能指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較,腎炎組患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平顯著升高(P<0.01),eGFR水平顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組和腎炎組腎功能指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of renal function indicators between the control group and the nephritis group

2.3 血清miR-181a-5p、miR-132-5p與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p與miR-132-5p水平呈正相關(guān)(P<0.01);血清miR-181a-5p和miR-132-5p均與UA、BUN、SCr、CysC水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),與eGFR水平呈正相關(guān)(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between serum miR-181a-5p, miR-132-5p and renal function indicators in patients with chronic glomerulonephritis

2.4 2亞組患者臨床資料、腎功能指標(biāo)及血清miR-181a-5p、miR-132-5p比較 與預(yù)后良好亞組比較,預(yù)后不良亞組患者性別、年齡、BMI、病理類(lèi)型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),血清UA、BUN、SCr、CysC水平顯著升高(P<0.01),eGFR及血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表4。

表4 預(yù)后良好亞組和預(yù)后不良亞組患者臨床資料、腎功能指標(biāo)及血清miR-181a-5p、miR-132-5p比較Tab.4 Comparison of clinical data, renal function indicators, and serum miR-181a-5p and miR-132-5p between patients with good and poor prognosis subgroups

2.5 影響慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析 以慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)是否發(fā)生預(yù)后不良為因變量(0=未發(fā)生,1=發(fā)生),以UA、BUN、SCr、CysC、eGFR、miR-181a-5p、miR-132-5p水平(均是連續(xù)變量)為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):高水平UA、高水平BUN、高水平SCr、高水平CysC、低水平eGFR、低水平miR-181a-5p、低水平miR-132-5p是影響慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 影響慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

2.6 血清miR-181a-5p、miR-132-5p預(yù)測(cè)慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的價(jià)值 繪制血清miR-181a-5p、miR-132-5p及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的ROC曲線,結(jié)果顯示,血清miR-181a-5p、miR-132-5p二者聯(lián)合預(yù)測(cè)慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的AUC分別為0.832、0.801、0.904,二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC顯著高于血清miR-181a-5p、miR-132-5p各自單獨(dú)預(yù)測(cè)AUC(Z=1.714、2.050,P=0.043、0.020),見(jiàn)圖1、表6。

圖1 血清miR-181a-5p、miR-132-5p及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum miR-181a-5p, miR-132-5p, and their combination predicting poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

表6 血清miR-181a-5p、miR-132-5p預(yù)測(cè)慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的價(jià)值Tab.6 Value of serum miR-181a-5p and miR-132-5p in predicting poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

3 討 論

慢性腎小球腎炎若治療不及時(shí),病情容易發(fā)展為慢性腎衰竭[10-11]。盡管腎活檢在診斷各種腎臟疾病方面有極大作用,但這種侵入性操作有時(shí)會(huì)導(dǎo)致出血,尤其在老年患者中出血可能是致命的[12-13]。因此,臨床上尋求預(yù)測(cè)慢性腎小球腎炎預(yù)后的生物標(biāo)志物對(duì)于改善患者生存期方面是必要的。

慢性腎小球腎炎發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究顯示其發(fā)病機(jī)制可能由免疫相關(guān)的細(xì)胞因子介導(dǎo),各種細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié),共同參與炎性反應(yīng)[14]。miRNAs是短的非編碼RNA(17～22個(gè)核苷酸),可以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),阻止信使RNA(mRNA)翻譯或促使mRNA降解[15]。Zhang等[16]研究表明,脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)細(xì)胞IL-1β和TNF-α等炎性因子均升高,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p高表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞焦亡,從而抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)。Cao等[17]報(bào)道,人HK-2細(xì)胞用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1處理可在體外模擬腎纖維化,而提高miR-181a-5p活性可抑制HK-2細(xì)胞腎纖維化的進(jìn)展。Xu等[18]發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)下降,并通過(guò)增強(qiáng)纖連蛋白和膠原蛋白I的表達(dá),以促進(jìn)HK-2細(xì)胞腎纖維化。miR-132-3p已成為慢性炎性疾病的介質(zhì),Fang等[19]報(bào)道,miR-132-3p的表達(dá)增強(qiáng)會(huì)減輕巨噬細(xì)胞的炎性應(yīng)激反應(yīng)和M1極化。陳剛等[20]發(fā)現(xiàn),血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)后miR-132-5p表達(dá)水平顯著下降,增強(qiáng)miR-132-5p活性可使得oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中炎性因子水平下降。高繼英等[21]研究表明,miR-132-5p過(guò)表達(dá)可抑制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,從而減輕帕金森細(xì)胞模型損傷。本研究發(fā)現(xiàn),慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平顯著低于健康人,與上述研究的結(jié)果相似[16-20],提示miR-181a-5p、miR-132-5p可能參與慢性腎小球腎炎疾病的發(fā)生。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良慢性腎功能衰竭患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平明顯低于預(yù)后良好患者,提示miR-181a-5p、miR-132-5p可能影響慢性腎小球腎炎患者預(yù)后情況,推測(cè)miR-181a-5p、miR-132-5p可能通過(guò)調(diào)控腎血管內(nèi)皮細(xì)胞平滑肌細(xì)胞活力和炎性反應(yīng)從而影響患者預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn),低水平miR-181a-5p、miR-132-5p是影響慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,且血清miR-181a-5p、miR-132-5p預(yù)測(cè)慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的AUC分別為0.832、0.801,提示其對(duì)于預(yù)估慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良有一定幫助,臨床上要監(jiān)控miR-181a-5p和miR-132-5p低水平患者,及時(shí)給予治療,以改善預(yù)后。

臨床上評(píng)價(jià)腎功能損害常通過(guò)檢測(cè)腎小管重吸收和排泄功能及腎小球?yàn)V過(guò)率,常用指標(biāo)有UA、BUN、Scr、CysC及eGFR等[22]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性腎小球腎炎患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平顯著高于健康人,eGFR顯著低于健康人;3年內(nèi)預(yù)后不良患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平較預(yù)后良好患者更高,eGFR水平較預(yù)后良好患者更低;提示慢性腎小球腎炎患者腎功能存在損害,且患者腎功能越差其預(yù)后不良的可能性越高。慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p與miR-132-5p水平呈正相關(guān),血清miR-181a-5p和miR-132-5p均與UA、BUN、SCr、CysC水平呈負(fù)相關(guān),與eGFR水平呈正相關(guān),表明miR-181a-5p和miR-132-5p可能存在相互作用,共同影響患者腎功能,從而影響患者預(yù)后。ROC曲線分析還顯示,血清miR-181a-5p和miR-132-5p聯(lián)合預(yù)測(cè)慢性腎小球腎炎患者3年內(nèi)預(yù)后不良的AUC為0.904,優(yōu)于二者各自單獨(dú)預(yù)測(cè),提示二者聯(lián)合預(yù)估患者3年內(nèi)預(yù)后效果可能更好。

綜上所述,慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平較低,二者與腎功能關(guān)系密切,miR-181a-5p、miR-132-5p低水平可能會(huì)導(dǎo)致患者3年內(nèi)預(yù)后不良,二者聯(lián)合有助于評(píng)估患者3年內(nèi)預(yù)后情況。本研究的不足之處在于未探究血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平對(duì)慢性腎小球腎炎患者長(zhǎng)期預(yù)后的影響,后期將擴(kuò)大樣本量,采用多中心研究的方式,進(jìn)一步探究二者對(duì)患者長(zhǎng)期預(yù)后的作用。

利益沖突:所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃其峰:設(shè)計(jì)研究方案,課題設(shè)計(jì),實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);童薇:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;劉洋、江小偉:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理,論文修改;劉萍:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析