陳麗萍,項(xiàng)保利,王布,姬澤萱,郭志青,趙建清

肺癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,每年新發(fā)209萬(wàn)例,死亡176萬(wàn)例[1]。肺癌中約85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC主要以手術(shù)為主的綜合治療,但治療效果并不理想,病死率無(wú)明顯改善[2]。EMSY轉(zhuǎn)錄抑制因子(EMSY transcriptional repressor, EMSY)是定位于DNA損傷部位的核蛋白,能結(jié)合乳腺癌易感基因2,誘導(dǎo)腫瘤基因組不穩(wěn)定,促進(jìn)卵巢癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展[3-4]。p53誘導(dǎo)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白1(p53-induced death domain protein 1,PIDD)富含亮氨酸的重復(fù)序列和死亡結(jié)構(gòu)域,在細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)中起銜接蛋白的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn),PIDD表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)核因子κB的SUMO化修飾,增強(qiáng)核因子κB的活化,抑制DNA損傷后的腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[6]。同源重組修復(fù)是DNA損傷后重要修復(fù)方式,其表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致驅(qū)動(dòng)基因差錯(cuò)積累、腫瘤進(jìn)展及放化療抵抗的形成[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)NSCLC中EMSY、PIDD表達(dá),探討兩者與同源重組修復(fù)基因表達(dá)及臨床病理特征的關(guān)系,分析兩者的診斷價(jià)值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2022年1月—2023年4月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科診治NSCLC患者80例。男42例,女38例,年齡34～78 (64.27±6.29)歲;病程3～36(8.17±3.58)d;均無(wú)明顯誘因及家族史;合并癥:高血壓22例,糖尿病7例;吸煙史30例;病理類(lèi)型:腺癌48例,鱗癌32例;腫瘤最大徑≤3 cm 55例,>3 cm 25例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期54例,Ⅲ期26例;腫瘤分化程度:高中分化47例,低分化33例;合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)(K2022104),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn): ①經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC;②患者既往無(wú)放化療及免疫治療等抗腫瘤治療; ③病例臨床及病理資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并心、肝、肺等臟器異常;②有其他惡性腫瘤病史;③有肺結(jié)核、免疫系統(tǒng)疾病或其他嚴(yán)重感染。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 EMSY、PIDD表達(dá)與同源重組修復(fù)基因: 術(shù)中留取NSCLC癌和癌旁組織(距癌組織>2 cm,病理證實(shí)為正常組織),于液氮中研磨,離心取上清。應(yīng)用組織RNA提取試劑盒(購(gòu)自北京索萊寶公司,貨號(hào)R1240)提取組織總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自北京索萊寶公司,貨號(hào)RP1105)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)組織中EMSY、PIDD及同源重組修復(fù)基因乳腺癌易感基因l(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)、核糖核苷酸還原酶亞單位1(ribonucleotide reductase catalytic subunit M1,RRM1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司,貨號(hào)SR1110。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器購(gòu)自美國(guó)ABI公司,型號(hào)ABI 7500。引物由上海生工科技公司設(shè)計(jì)合成。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:94℃ 5 min,94℃ 30 s,58℃ 34 s,72℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)總體系共20 μl,包括2×SYBR Premix Es Taq 10 μl,上游、下游引物各1 μl,cDNA 1 μl和ddH2O 7 μl。以GAPDH為內(nèi)參,采用相對(duì)比率2-△△Ct法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 EMSY、PIDD表達(dá)與同源重組修復(fù)基因引物序列Tab.1 EMSY and PIDD expression and homologous recombination repair gene primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析;繪制受試者工作特征曲線(xiàn)(receiver operating characteristic curve,ROC),分析EMSY、PIDD對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC癌組織中EMSY、PIDD及同源重組修復(fù)基因的表達(dá) NSCLC癌組織中EMSY、PIDD、BRCA1、ERCC1、RRM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 NSCLC癌組織中EMSY、PIDD及同源重組修復(fù)基因的表達(dá)比較Tab.2 Comparison of expression of EMSY, PIDD, and homologous recombination repair genes in NSCLC cancer tissue

2.2 NSCLC中EMSY、PIDD與同源重組修復(fù)基因表達(dá)的相關(guān)性 NSCLC癌組織中EMSY、PIDD mRNA與BRCA1、ERCC1、RRM1 mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.01),見(jiàn)表3。

2.3 NSCLC中EMSY、PIDD表達(dá)在不同臨床病理特征中差異比較 低分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期Ⅲ期NSCLC癌組織EMSY、PIDD mRNA表達(dá)分別高于高中分化程度、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期NSCLC癌組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表4。

表4 癌組織中EMSY、PIDD mRNA表達(dá)在不同NSCLC臨床病理特征中的比較Tab.4 Comparison of EMSY and PIDD mRNA expression in different clinical and pathological characteristics of NSCLC in cancer tissues

2.4 EMSY、PIDD mRNA表達(dá)對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值 繪制 EMSY、PIDD mRNA及兩項(xiàng)聯(lián)合診斷NSCLC價(jià)值的ROC曲線(xiàn),并計(jì)算曲線(xiàn)下面積(AUC),結(jié)果顯示:EMSY、PIDD mRNA及兩項(xiàng)聯(lián)合診斷NSCLC的AUC分別為0.834、0.802、0.906,兩項(xiàng)聯(lián)合診斷NSCLC的AUC大于EMSY、PIDD mRNA單一診斷(Z=4.751、5.257,P均<0.001),見(jiàn)表5、圖1。

圖1 EMSY、PIDD mRNA診斷NSCLC的價(jià)值ROC曲線(xiàn)分析Fig.1 ROC curve analysis of the diagnostic value of EMSY and PIDD mRNA for NSCLC

表5 EMSY、PIDD mRNA診斷NSCLC的價(jià)值比較Tab.5 Comparison of the diagnostic value of EMSY and PIDD mRNA in NSCLC

3 討 論

NSCLC是肺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型,目前NSCLC的治療包括手術(shù)、輔助放化療等,特別是近年來(lái)靶向治療及免疫治療取得了巨大突破,但其僅限于部分具有特定驅(qū)動(dòng)基因突變的患者。部分NSCLC患者存在放化療抵抗或治療一段時(shí)間后形成耐藥性,均可導(dǎo)致術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,進(jìn)而導(dǎo)致患者不良預(yù)后。深入研究NSCLC癌變機(jī)制對(duì)于NSCLC臨床診治意義重大。

同源重組修復(fù)是真核細(xì)胞內(nèi)一種DNA雙鏈斷裂的修復(fù)方式,可在電離輻射、抗癌化療藥物及遺傳毒性藥物等損害過(guò)程中產(chǎn)生,DNA雙鏈得不到修復(fù),可導(dǎo)致染色體斷裂和細(xì)胞死亡。BRCA1主要參與核苷酸剪切修復(fù)和同源重組修復(fù)。ERCC1是核苷酸剪切修復(fù)家族成員,與XPF形成異源二聚體,在DNA單鏈?zhǔn)軗p處的5’端進(jìn)行剪切而發(fā)揮功能。RRM1是核苷酸還原酶調(diào)節(jié)M1亞單位,當(dāng)ERCC1將DNA鏈中受損的部分切除后,DNA鏈上留下的空缺由RRM1提供的核苷酸來(lái)填補(bǔ)。本研究中,NSCLC中同源重組修復(fù)基因表達(dá)升高,與既往研究中免疫組化的結(jié)果一致[8],表明NSCLC中存在同源重組修復(fù)基因表達(dá)失常。NSCLC中同源重組修復(fù)基因的表達(dá)異常升高可引起斷裂的DNA雙鏈不恰當(dāng)修復(fù),導(dǎo)致染色體缺失、重排、轉(zhuǎn)位及倒置,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。另外,同源重組修復(fù)基因的表達(dá)異常升高能夠增強(qiáng)腫瘤對(duì)放化療等輔助治療的抵抗性,導(dǎo)致不良預(yù)后[9]。

EMSY也稱(chēng)為C11orf30,基因定位于人類(lèi)染色體11q13.5,編碼蛋白能夠結(jié)合乳腺癌中BRCA2并使其失活,導(dǎo)致DNA損傷后不能及時(shí)修復(fù),導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[10]。本研究中,NSCLC癌組織中EMSY表達(dá)升高,提示EMSY可能參與NSCLC的腫瘤發(fā)生。EMSY作為一種原癌基因,在卵巢癌中均存在EMSY基因啟動(dòng)子序列的單核苷酸性位點(diǎn)的突變現(xiàn)象,導(dǎo)致EMSY基因表達(dá)上調(diào),降低對(duì)紫杉醇化療的敏感性[11]。另有研究表明,Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1能夠泛素化修飾EMSY,促進(jìn)EMSY蛋白經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解,而NSCLC中Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1基因突變導(dǎo)致EMSY蛋白穩(wěn)定性增加,導(dǎo)致EMSY表達(dá)水平升高[12]。本研究中,NSCLC中EMSY的表達(dá)與不良臨床病理特征有關(guān),提示EMSY促進(jìn)NSCLC的腫瘤進(jìn)展。分析其機(jī)制,NSCLC中EMSY的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)BRCAness表型的形成,腫瘤同源重組修復(fù)功能缺陷導(dǎo)致高腫瘤突變負(fù)荷,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[12-13]。此外,EMSY作為染色質(zhì)重塑復(fù)合體的重要組成成分,其過(guò)度表達(dá)能夠抑制干擾素刺激基因的表達(dá),抑制Ⅰ型干擾素反應(yīng)及先天免疫信號(hào)通路的傳導(dǎo),促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃避[12, 14]。本研究發(fā)現(xiàn),NSCLC中EMSY與同源重組修復(fù)基因表達(dá)有關(guān),提示EMSY能影響NSCLC中同源重組修復(fù)基因的表達(dá)。研究表明,EMSY能參與NRC相互作用因子1染色質(zhì)重塑復(fù)合體的形成,促進(jìn)組蛋白H3的去甲基化,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)BRCA1、ERCC1、RRM1等同源重組修復(fù)基因的表達(dá)[15]。而B(niǎo)RCA1、ERCC1、RRM1等同源重組修復(fù)基因的表達(dá)上調(diào)能夠增強(qiáng)NSCLC腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療治療的抵抗性,降低放化療治療的療效,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[7]。因此,NSCLC中EMSY促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,以EMSY為靶點(diǎn)的治療可能是潛在的NSCLC新的治療方案。

PIDD是依賴(lài)于p53的效應(yīng)因子,在細(xì)胞核中以SUMO化修飾方式激活,并活化核因子κB,啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)作用[16]。本研究中,NSCLC中PIDD表達(dá)升高,與不良臨床病理特征有關(guān),提示PIDD參與NSCLC腫瘤發(fā)生發(fā)展。PIDD作為一種分子開(kāi)關(guān),其表達(dá)及功能受伴侶分子的影響。研究發(fā)現(xiàn),受體相互作用蛋白1結(jié)合于PIDD基因,促進(jìn)PIDD基因的表達(dá),PIDD能夠抑制天冬氨酸蛋白酶2,抑制p53的細(xì)胞周期阻滯效應(yīng),激活下游核因子κB通路,促進(jìn)腫瘤惡性增殖[17]。有學(xué)者報(bào)道,在NSCLC中,PIDD能夠增強(qiáng)Kelch樣環(huán)氧氯丙胺相關(guān)蛋白1與核因子E2相關(guān)因子2相互作用,減少核因子E2相關(guān)因子2的泛素蛋白酶體途徑降解,上調(diào)成纖維生長(zhǎng)因子21的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)[18]。本研究中,NSCLC中PIDD與同源重組修復(fù)基因表達(dá)有關(guān),提示PIDD能影響NSCLC的同源重組修復(fù)過(guò)程。研究表明,PIDD能夠與DNA依賴(lài)性蛋白激酶催化亞基相互作用,促進(jìn)其募集到停滯的復(fù)制叉,激活A(yù)TR信號(hào)通路,上調(diào)同源重組修復(fù)基因表達(dá),維持細(xì)胞在放化療等應(yīng)激條件下的細(xì)胞存活[19-20]。另外,PIDD可通過(guò)促進(jìn)腫瘤中同源重組過(guò)程,增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力,但不完整的DNA損傷修復(fù)導(dǎo)致腫瘤積累DNA損傷,促進(jìn)腫瘤逃逸免疫監(jiān)視,導(dǎo)致腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[21-23]。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),EMSY、PIDD mRNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC具有較高的診斷價(jià)值,診斷的敏感度和特異度分別為0.871,0.802,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述,EMSY、PIDD在NSCLC癌組織中表達(dá)升高,與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期有關(guān),均參與NSCLC的腫瘤進(jìn)展。NSCLC中EMSY、PIDD表達(dá)可能通過(guò)促進(jìn)同源重組修復(fù)基因表達(dá),干擾腫瘤DNA損傷修復(fù)過(guò)程,是潛在的NSCLC腫瘤治療靶點(diǎn)。臨床醫(yī)師可根據(jù)EMSY、PIDD的表達(dá),評(píng)估NSCLC腫瘤惡性程度,指導(dǎo)臨床診治,以改善患者預(yù)后。但本研究也存在不足,樣本量有限,未能深入研究EMSY、PIDD調(diào)控同源重組修復(fù)基因表達(dá)的機(jī)制,有待今后進(jìn)行深入探索。

利益沖突:所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

陳麗萍:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);項(xiàng)保利、王布:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;姬澤萱:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理;郭志青:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;趙建清:課題設(shè)計(jì),論文修改