胥國(guó)麟，葉曉林，錢體軍，王云濤，趙文珍

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000）

不孕不育群體的人群數(shù)量逐年增加，其中男性因素導(dǎo)致的不育達(dá)到50%〔1〕。對(duì)于男性不育而言，弱精子癥是目前較為關(guān)注的疾病之一，導(dǎo)致弱精子癥的原因很多，其中活性氧損傷被認(rèn)為是最主要的原因之一〔2〕。目前，隨著超重人數(shù)的增加，超重人群與弱精子癥之間的關(guān)系被廣泛關(guān)注，肥胖癥是一種慢性代謝性疾病，能形成過(guò)量的活性氧造成慢性全身性損傷，可能會(huì)導(dǎo)致精子活力降低及精子畸形率增加〔3〕。過(guò)氧化物還原酶家族成員過(guò)氧化物還原酶2（peroxiredoxin 2，PRDX2），在卵巢、睪丸、附睪及哺乳動(dòng)物精子中均有表達(dá)，該家族被認(rèn)為是清除活性氧最有效的家族之一，能夠維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡〔4〕。既往研究〔5-6〕證實(shí)，PRDX2能與Lgals9共同調(diào)節(jié)超重引起的肥胖癥，能減緩冷凍精子活力的下降，與精子DNA 損傷程度相關(guān)，雖然該研究證實(shí)PRDX2 的抗氧化作用與精子活力有一定的相關(guān)性，但缺乏臨床證據(jù)描述PRDX2與超重者之間的相關(guān)性，尤其是弱精子癥合并超重者精子中PRDX2 的表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道，故本研究通過(guò)收集弱精子癥合并超重人群的精液標(biāo)本，分析PRDX2 在其精子中表達(dá)差異，初步探究PRDX2 與弱精子癥合并體質(zhì)量超重之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)：BX53）；PRDX2 抗體（Abcam 公司，批號(hào)：ab109367）；Alexa Flour 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Abcam 公司，批號(hào)：ab6712）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS，實(shí)驗(yàn)室自制）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，Sigma 公司，批號(hào)：V900933-100G）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）熒光染料（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：C1002）。

1.2 研究對(duì)象收集2021年1月至12月大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心精液常規(guī)檢查的101 份精液標(biāo)本進(jìn)行研究。精液樣本的使用經(jīng)大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有實(shí)驗(yàn)根據(jù)相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行，精液提供者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.3 精液標(biāo)本準(zhǔn)備本研究中精液檢查者需滿足以下條件：①禁欲3~7 d；②年齡20~47歲；③無(wú)長(zhǎng)期服藥史，無(wú)高血壓、糖尿病等慢性疾病，無(wú)精索靜脈曲張等先天性生殖系統(tǒng)疾病或后天生殖系統(tǒng)疾病。精液常規(guī)參數(shù)由大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心檢驗(yàn)科提供。弱精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照WHO《人類精液檢驗(yàn)與處理的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5 版）中的標(biāo)準(zhǔn)，將精液標(biāo)本中前向運(yùn)動(dòng)精子百分?jǐn)?shù)（progressive motility，PR）小于<32%者確定為弱精子癥。依據(jù)體重指數(shù)（body mass index，BMI）將受試者分為：正常體重者（18 kg∕m2≤BMI<25 kg∕m2）、超重者（BMI≥25 kg∕m2）和肥胖者（BMI≥30 kg∕m2）。將同時(shí)符合正常體重及正?；盍拥木簶?biāo)本納入正常組（60份），將同時(shí)符合超重或肥胖及弱精子癥的精液標(biāo)本納入弱精超重組（41份）。

1.4 參數(shù)檢測(cè)通過(guò)精液計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)檢測(cè)精液常規(guī)參數(shù)，包括：精子密度、精子活率、PR、直線速率（straight-line（rectilinear）velocity，VSL）、平均軌道速率（average path velocity，VAP）、曲線速率（curvilinear velocity，VCL）、直向（straightness，VSL∕VAP，STR）、擺動(dòng)（wobble，VAP∕VCL，WOB）、線性（linearity，LIN）、頭側(cè)擺幅度（amplitude of lateral head displacement，ALH）、交打頻率（beat-cross frequency，BCF）等。

1.5 免疫熒光檢測(cè)新鮮精液標(biāo)本800g，4 ℃條件下離心10 min，取精子沉淀物用PBS 洗滌3 次制成精子涂片，-80 ℃長(zhǎng)期保存。4%多聚甲醛固定精子涂片30 min，PBS 洗滌3 次，0.1%Triton X-100 打孔10 min，再次PBS 洗滌3 次；5% BSA 室溫封閉1 h，一抗PRDX2（1：200 稀釋），陰性對(duì)照用PBS 取代，4 ℃孵育過(guò)夜；二抗IgG（1：500）室溫避光孵育1 h，PBS 洗滌3 次，每次5 min，使用帶DAPI 的防熒光淬滅劑封片，予以相同曝光時(shí)間及曝光度進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0、Image J 及Prsim 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，組間差異分析使用t檢驗(yàn)；使用Pearson 相關(guān)分析探討PRDX2 表達(dá)量與精液參數(shù)的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組人群一般資料比較與正常組人群比較，弱精超重組患者的BMI 顯著升高，精子密度、精子活率、PR、STR、LIN、VCL、VSL、VAP等參數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；2 組人群年齡，WOB、ALH、BCF 等參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 2組人群一般資料比較（±s）

表1 2組人群一般資料比較（±s）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

項(xiàng)目正常組（n=60）弱精超重組（n=41）項(xiàng)目正常組（n=60）弱精超重組（n=41）年齡∕歲BMI∕（kg∕m2）精子密度∕（107個(gè)∕mL）精子活率∕%PR∕%STR∕%LIN∕%31.90±5.15 21.46±1.68 38.18±31.58 72.46±14.64 57.18±14.28 85.69±5.07 64.90±8.95 33.07±7.71 27.06±2.64**26.55±25.22*31.47±18.98**17.55±9.96**79.21±16.76*59.34±17.17*WOB∕%VCL∕（μm∕s）VSL∕（μm∕s）VAP∕（μm∕s）ALH∕μm BCF∕Hz 73.33±7.48 49.10±11.48 33.01±8.92 37.04±9.25 2.81±1.38 4.96±1.13 69.28±15.91 36.90±14.68**22.49±10.55**25.75±11.04**2.41±5.53 5.26±2.21

2.2 精子中PRDX2 的定位與表達(dá)免疫熒光結(jié)果顯示，PRDX2主要定位于精子的中段線粒體處及部分頭核處，弱精超重組精液中PRDX2的熒光表達(dá)量顯著低于正常組（P<0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 PRDX2在2組精子中的定位與表達(dá)

2.3 PRDX2 熒光表達(dá)量與精液參數(shù)的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PRDX2熒光表達(dá)量與BMI呈負(fù)相關(guān)（r=-0.857，P=0.002），與PR 呈正相關(guān)（r=0.827，P=0.003），與年齡及其他精液參數(shù)無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表2 PRDX2熒光表達(dá)量與精液參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

全球男性生育率的下降與精子密度減少及其活力下降密切相關(guān)。肥胖、飲食、慢性病、吸煙以及環(huán)境毒素等因素都可能是導(dǎo)致男性不育的主要因素〔7〕。其中，弱精子癥是目前男性不育的主要疾病之一，其病因多種多樣，通常包括泌尿系統(tǒng)感染、免疫反應(yīng)、染色體異常等原因，有時(shí)病因也可能不明確。研究〔8〕表明，肥胖與精子質(zhì)量下降之間存在密切關(guān)聯(lián)。肥胖不僅會(huì)導(dǎo)致雄性激素分泌減少和雌激素轉(zhuǎn)化增加，還可能引起脂肪酸積累和活性氧水平升高，對(duì)精液質(zhì)量和機(jī)體造成氧化應(yīng)激損害。

過(guò)氧化物酶家族最初是在酵母中發(fā)現(xiàn)的，如今已證實(shí)其在哺乳動(dòng)物中有成員存在。這個(gè)家族的成員主要用于清除由H2O2引起的活性氧，以維護(hù)細(xì)胞環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡〔9〕。過(guò)氧化物酶家族包括6 個(gè)成員，分別是PRDX1~PRDX6〔10〕。其中，PRDX2 是典型的2-Cys 成員，其結(jié)構(gòu)與其他成員有所不同。在正常的生理?xiàng)l件下，PRDX2為十聚體和二聚體之間的平衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致其更容易被氧化〔11〕。Li 等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，PRDX2 可以作為活性氧清除劑，通過(guò)MAPK 通路來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。此外，Talwar 等〔13〕的研究證實(shí)，PRDX2 能與轉(zhuǎn)錄因子STAT3形成復(fù)合體，從而對(duì)H2O2進(jìn)行還原。而Duan等〔14〕的研究發(fā)現(xiàn)，PRDX2有助于清除睪丸間質(zhì)細(xì)胞受到的活性氧損傷，維持睪丸激素的分泌，進(jìn)而保持精子的正常發(fā)育。前期研究〔14〕表明，PRDX2與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的氧化平衡密切相關(guān)，能通過(guò)清除H2O2維持細(xì)胞的正常發(fā)育。因此，推測(cè)PRDX2可能在合并肥胖的弱精子癥中發(fā)揮重要作用。

本研究使用精液樣本進(jìn)行了一般資料分析，對(duì)比了正常組和弱精超重組的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，在BMI、精子密度、精子活率以及PR方面，2組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外，弱精超重組的VCL、VSL 和VAP顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。有研究〔12〕發(fā)現(xiàn)VCL、VSL 和VAP 與受精能力呈正相關(guān)。據(jù)報(bào)道〔10〕，精子運(yùn)動(dòng)能力下降的主要原因包括ATP 水平降低和氧化應(yīng)激的增加。上述結(jié)果提示超重弱精子癥患者存在氧化應(yīng)激水平增加的情況。免疫熒光結(jié)果顯示PRDX2 定位于人精子的部分頭核和中間線粒體處，推測(cè)PRDX2 可能參與維護(hù)精子的正常形態(tài)和保護(hù)精子DNA 免受氧化侵害，對(duì)精子后續(xù)的受精能力產(chǎn)生影響。既往研究〔15〕表明，PRDX2能夠在相對(duì)較低的H2O2濃度下進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，有效地維持細(xì)胞的氧化還原平衡。初步免疫熒光檢測(cè)表明，弱精超重組的PRDX2 熒光表達(dá)量明顯降低，與Liu 等〔16〕研究中發(fā)現(xiàn)的PRDX2在弱精子癥中表達(dá)下調(diào)一致，提示PRDX2 的抗氧化能力可能受損。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PRDX2 的熒光表達(dá)量與BMI 呈顯著負(fù)相關(guān)，與PR 呈顯著正相關(guān)，但與精子密度等無(wú)顯著相關(guān)性。再次驗(yàn)證了免疫熒光結(jié)果的可靠性，同時(shí)表明PRDX2的表達(dá)變化與精子細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化有關(guān)。通過(guò)本研究可知，弱精超重組中PRDX2 的表達(dá)降低表明其抗氧化能力下降，提示PRDX2 是存在于人精子中的抗氧化酶，推測(cè)PRDX2 可能損耗自身能力去維持精子的正常活力。此外，PRDX2 的表達(dá)與BMI 呈負(fù)相關(guān)，這提示PRDX2 與肥胖引起的活性氧增加有關(guān)，因此，可以推測(cè)PRDX2 的變化與精子受氧化應(yīng)激而導(dǎo)致精子活力降低有關(guān)。然而，本研究的局限之處在于只是初步探討了PRDX2 在超重合并弱精子癥人群中的表達(dá)情況。另外，對(duì)于PRDX2在此類弱精子癥中如何進(jìn)行調(diào)節(jié)的分子機(jī)制仍需要深入研究。

綜上所述，本研究再次驗(yàn)證了肥胖與弱精子癥之間的相關(guān)性，并首次在超重人群的弱精子癥患者的精子中描述了PRDX2 的表達(dá)情況，提示其PRDX2 的改變與精子活力低下之間可能通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧影響體質(zhì)量來(lái)實(shí)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究超重弱精子癥治療提供基礎(chǔ)。