閆 波，潘 穎，田平平

（安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，合肥 230601）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種持續(xù)或間歇發(fā)作，以腹痛、腹脹、排便習(xí)慣和（或）大便性狀改變?yōu)榕R床表現(xiàn)，而缺乏胃腸道結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)異常改變的腸道功能紊亂性疾病。其中感染后腸易激綜合征（post-infection irritable bowel syndrome，PI-IBS）占IBS的10%〔1〕。目前IBS病因尚不明確，研究〔2〕發(fā)現(xiàn)IBS 與內(nèi)臟高敏感性、胃腸道動力異常、腸道低度炎癥刺激、腸道菌群失調(diào)等有關(guān)。其中內(nèi)臟高敏感性是IBS 的主要病理生理機(jī)制之一，也是IBS患者胃腸功能紊亂、腹痛及癥狀多樣化的最主要病理生理基礎(chǔ)，是IBS的生物學(xué)標(biāo)志〔3-4〕。

腸道菌群在維持腸道內(nèi)環(huán)境、腸道疾病的發(fā)生和自穩(wěn)過程中起關(guān)鍵作用，腸道微生態(tài)的改變是引發(fā)和加重IBS 內(nèi)臟高敏感反應(yīng)狀態(tài)、影響胃腸道動力的關(guān)鍵病理生理環(huán)節(jié)。腸道微生物代謝產(chǎn)生維生素、脂肪酸、膽汁酸等產(chǎn)物，短鏈脂肪酸多為厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)物，如乙酸、丙酸、丁酸等對胃腸道功能產(chǎn)生影響〔5〕。本研究采用血清代謝組學(xué)分析和16S rDNA 測序分別檢測血清代謝物和腸道微生物變化，探索PI-IBS 小鼠中腸道菌群和代謝的相關(guān)性，進(jìn)一步明確腸道菌群及其代謝物在PI-IBS 發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料SPF 級雄性NIH 小鼠，體質(zhì)量20~25 g，購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)、自由飲食，12 h 光照、黑暗交替節(jié)律。所有小鼠實驗前在同一環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d〔2〕。

1.2 方法

1.2.1 PI-IBS 模型制備與分組 采用含400~500條旋毛蟲幼蟲的0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液灌胃NIH小鼠，構(gòu)建PI-IBS 模型〔6〕。將所有小鼠隨機(jī)分為對照組和PI-IBS 組，每組9 只。PI-IBS 組給予旋毛蟲灌胃，對照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，直至感染8 周后評估內(nèi)臟敏感性，判斷造模是否成功。

1.2.2 腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR） 利用AWR 評分進(jìn)行各組小鼠內(nèi)臟敏感性測定。將小鼠放在透明盒上，使之能自由活動，但不能轉(zhuǎn)身、掉頭。給予不同體積水進(jìn)行結(jié)直腸擴(kuò)張（0.25、0.35、0.50、0.65 mL）〔7〕，觀察小鼠對不同程度擴(kuò)張壓力的行為反應(yīng)。操作者和觀察者采取雙盲的方法根據(jù)小鼠對刺激的反應(yīng)進(jìn)行AWR 評分〔2，8〕，取3次評定的平均值作為結(jié)果。

1.2.3 樣本采集 小鼠糞便樣本置于無菌管中用于16S rDNA 測序。小鼠眼球取血置于EP 管中，靜置2 h后，3 000 r∕min 離心15 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 16S rDNA 測序與分析 采用CTAB 法提取樣本的基因組DNA，檢測DNA 的純度和濃度。根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物和高保真DNA 聚合酶對選定的V3~V4 可變區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。參照電泳初步定量結(jié)果，對PCR 擴(kuò)增回收產(chǎn)物定量檢測，按照每個樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit 建庫試劑盒構(gòu)建文庫。構(gòu)建好的文庫通過Agilent Bioanalyzer 2100 生物分析儀和Qubit 熒光分光光度計質(zhì)檢，文庫質(zhì)檢合格后上機(jī)測序。

所有樣品的有效數(shù)據(jù)用Uparse 軟件完成聚類分析，其中有97%相似度的序列聚類成為運(yùn)算分類單元（operational taxonomic unit，OTU），然后注釋OTU 代表序列的物種。用greengene 數(shù)據(jù)庫注釋。利用Mothur 軟件計算α 多樣性（Chao1 指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)），β多樣性分析計算Weighted Unifrac距離。

用t檢驗和STAMP 分析方法檢驗2 組樣本的物種組成和群落之間是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析顯示關(guān)鍵細(xì)菌的改變，并設(shè)置線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）評分的篩選值為2。

1.2.5 血清代謝組學(xué)分析 取血清100 μL，加入400 μL 預(yù)冷甲醇∕乙腈（1:1），渦旋混合，-20 ℃靜置30 min，4 ℃16 000 r∕min 離心20 min，取上清液，真空干燥，復(fù)溶，渦旋，離心，取上清液進(jìn)樣質(zhì)譜分析。采用Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統(tǒng)HILIC 色譜柱進(jìn)行分離。流動相A：水+25 mmol∕L乙酸銨+25 mmol∕L 氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0~1 min，85%B；1~12 min，85%~65%B；12~12.1 min，65%~40%B；12.1~15 min，40%B；15~15.1 min，40%~85%B；15.1~20 min，85%B。柱溫25 ℃；流速0.3 mL∕min；進(jìn)樣量2 μL。分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。樣品經(jīng)UHPLC 分離后用Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。ESI 源條件如下：離子源氣體1 為60，離子源氣體2 為60，幕簾氣體為30，源溫度為600 ℃，離子噴霧電壓浮動±5 500 V（正負(fù)2 種模式）；二級質(zhì)譜采用信息依賴性采集獲得，并且采用峰強(qiáng)度值篩選模式，參數(shù)設(shè)置如下：去簇電壓為±60 V，碰撞能量固定在（35±15）eV，動態(tài)排除同位素離子范圍為4 Da，每次掃描獲取碎片圖10個。

用MzXML 文檔處理原始數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行峰對齊、保留時間校正以及用XCMS 提取峰面積。根據(jù)峰值強(qiáng)度將原始數(shù)據(jù)歸一化，處理后的數(shù)據(jù)采用R 軟件包進(jìn)行分析。使用置換測試評估模型穩(wěn)健性。在正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）模型中，計算變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值以證明其對分類的影響。使用SPSS 24.0 軟件通過t檢驗或非參數(shù)檢驗比較2 組間的差異，差異代謝物篩選以VIP>1 和P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)。用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析代謝物的通路。

1.3 統(tǒng)計分析采用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，2 組間的比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過Spearman分析差異代謝物和差異菌群的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 2 組小鼠AWR 評分采用AWR 評分評估PIIBS 內(nèi)臟敏感性變化，與對照組比較，PI-IBS 組小鼠在水體積為0.25、0.35、0.50、0.65 mL時，其結(jié)直腸擴(kuò)張反應(yīng)明顯增強(qiáng)，AWR 評分均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 2組小鼠AWR評分（±s，n=9）

表1 2組小鼠AWR評分（±s，n=9）

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

組別對照組PI-IBS 組擴(kuò)張水體積∕mL 0.25 0.67±0.22 1.85±0.74**0.35 1.22±0.57 2.37±0.87**0.50 2.30±0.48 3.11±0.80*0.65 2.30±0.81 3.07±0.60*

2.2 2組小鼠腸道菌群物種的改變小鼠腸道菌群變化結(jié)果顯示，Chao1指數(shù)、ACE 指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)在對照組和PI-IBS 組小鼠間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1?；赪eighted Unifrac距離的β多樣性組間差異分析的結(jié)果顯示，2 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 2組小鼠腸道菌群的β多樣性比較

16S rDNA分析小鼠糞便菌群變化，共鑒定出10個門，以擬桿菌門Bacteroidetes 和厚壁菌門Phylum Firmicutes 為主。見表2。在屬水平上，與對照組相比，PI-IBS組小鼠糞便中小鼠腸道宏基因組、糞桿菌屬Faecalibacterium、鞘桿菌屬Ileibacterium相對豐度明顯增加，表皮桿菌屬Cutibacterium相對豐度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。采用LEfSe分析比較2組腸道菌群豐度在各物種分類水平上的差異，基于LEfSe 線性判別分析結(jié)果顯示，對照組的特征細(xì)菌是毛螺菌屬的g_Lachnospiraceae_UCG_006，PI-IBS 組的特征細(xì)菌是小鼠腸道宏基因組mouse gut metagenome和另枝菌屬的g_Alistipes。

圖3 2組菌群在屬水平上的差異比較

表2 2組菌群在門水平上主要物種相對豐度

2.3 2 組小鼠血清代謝物的改變和代謝通路分析在正、負(fù)離子模式下，對照組和PI-IBS 組小鼠中共鑒定出1 296 種代謝物。這些代謝物由多種成分組成，主要包括脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)雜環(huán)化合物、含氧有機(jī)化合物等。見表3。在OPLS-DA 模式下，對照組與PI-IBS 組的樣本分布不同，表明2 組代謝具有顯著差異。見圖4。以VIP>1，P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出22種組間差異代謝物，包括L-瓜氨酸、DL-苯丙氨酸、蘋果酸、乙酰肉堿、乙酰膽堿等。見表4?；贙EGG 富集分析篩選的代謝通路，包括氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸生物合成、突觸囊泡循環(huán)等16條代謝通路。見圖5。

圖4 正、負(fù)離子模式下2組間OPLS-DA

圖5 差異代謝物富集通路

表3 代謝物中化學(xué)成分分類占比情況

表4 2組鑒定后的顯著差異代謝物

2.4 2組小鼠差異腸道菌群與差異代謝物的相關(guān)性腸道菌群變化與體內(nèi)代謝物產(chǎn)生有關(guān)，并參與各種疾病的發(fā)生。對PI-IBS組小鼠篩選出的差異菌群和差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析。圖6 直觀展示了差異菌群和差異代謝物之間存在一定的相關(guān)性。其中，mouse gut metagenome與乙酰膽堿呈顯著正相關(guān)。

圖6 差異菌群和差異代謝物相關(guān)性熱圖

3 討論

內(nèi)臟超敏反應(yīng)和腸道微生物導(dǎo)致的慢性炎癥是PI-IBS 患者的潛在重要致病因素。內(nèi)臟高敏反應(yīng)是PI-IBS 的主要特征之一，在旋毛蟲感染NIH 小鼠后的PI-IBS模型中已經(jīng)被證實〔9〕。

PI-IBS 的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，健康人群和PI-IBS 患者之間微生物群分布存在顯著差異。在PI-IBS 患者中，Bacteroidesssp 顯著增加，Uncultured clostridiales減少〔10〕。研究〔11〕也證實腸道菌群的改變可以明顯改善PI-IBS小鼠的內(nèi)臟超敏反應(yīng)。本研究中，與對照組相比，PI-IBS組小鼠中小鼠腸道宏基因組、類桿菌屬、鞘桿菌屬相對豐度明顯增加，表皮桿菌屬相對豐度明顯降低。通過LEfSe 線性判別分析，發(fā)現(xiàn)IBS小鼠腸道微生物標(biāo)志物g_Alistipes，Alistipes屬的不同菌株被證明具有與不同疾病和病癥相關(guān)的獨(dú)特生理作用〔12〕。Alistipes可產(chǎn)生吲哚，參與色氨酸的代謝〔13〕。由于色氨酸也是血清素的前體，因此增加的Alistipes豐度可能會破壞腸道血清素系統(tǒng)的平衡。本課題組前期的研究中也發(fā)現(xiàn)血清素5-羥色胺在PI-IBS 小鼠中發(fā)生明顯改變〔14〕。在IBS 患者中，較高水平的Alistipes與腹痛的頻率更高有關(guān)，推測Alistipes與腸道炎癥有關(guān)〔15〕。因此，Alistipes可能通過影響色氨酸的代謝影響PI-IBS 的發(fā)生。

PI-IBS 腸道菌群相關(guān)的代謝物會通過腸道屏障入血，作用于相應(yīng)靶器官，影響疾病的發(fā)生。本研究收集PI-IBS 組和對照組小鼠血清進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析。結(jié)果表明，2 組間有22 種代謝物存在顯著差異，這些差異代謝物主要富集于氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸生物合成、突觸囊泡循環(huán)等16條代謝通路。PI-IBS組小鼠L-瓜氨酸明顯增加，并參與氨基酸的生物合成和精氨酸生物合成代謝通路。腸道菌群通過影響L-精氨酸代謝改善結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)〔16〕，瓜氨酸和精氨酸代謝改變與微生物態(tài)失調(diào)有關(guān)〔17〕。研究〔18〕證實瓜氨酸也是小腸吸收功能的潛在敏感生物標(biāo)志物。IBS 存在代謝異常，與L-瓜氨酸參與的氨基酸和精氨酸的生物合成通路有關(guān)。

越來越多的證據(jù)表明，硫氨基酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、代謝、免疫和氧化中起著至關(guān)重要的作用〔19-20〕。小兒克羅恩病患者糞便中的氨基酸半胱氨酸和蛋氨酸均顯著增加〔21〕。多種腸道微生物參與半胱氨酸和蛋氨酸的合成和代謝，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等〔22-23〕。本研究發(fā)現(xiàn)PI-IBS 組小鼠的半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路上調(diào)，參與代謝通路的半胱氨酸硫酸鹽明顯增多，表明腸道菌群可能通過調(diào)節(jié)含硫的半胱氨酸和蛋氨酸代謝影響PI-IBS。

本研究中，PI-IBS 組小鼠血清中的乙酰膽堿較對照組明顯增加，主要富集在突觸囊泡循環(huán)、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控等多條通路。研究〔24〕表明增加乙酰膽堿的攝取可以緩解IBS 鼠的內(nèi)臟敏感性。在一項旋毛蟲制備的PI-IBS 小鼠實驗中，馬來酸曲美布汀通過抑制高乙酰膽堿改善腸道高反應(yīng)性〔25〕。此外，本研究的相關(guān)性分析結(jié)果表明，乙酰膽堿與mouse gut metagenome呈顯著正相關(guān)。因此，乙酰膽堿參與的代謝通路與其相關(guān)腸道微生物可能是PIIBS發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵途徑。

綜上所述，PI-IBS 小鼠不僅存在腸道菌群失調(diào)，血清代謝物也發(fā)生明顯改變，主要涉及氨基酸代謝和乙酰膽堿參與的代謝通路。這些代謝物的改變可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。研究結(jié)果從多組學(xué)角度為進(jìn)一步闡釋PI-IBS 的作用機(jī)制指明了潛在新方向。但深入探討差異代謝物改變與菌群變化的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。