胡典綸，余 佶，劉圓圓，麻成金

（吉首大學(xué) 食藥兩用資源研究與高值化利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首 416000）

椪柑（Citrus reticulata 'Ponkan'），蕓香科柑橘屬木本植物果實(shí)，原產(chǎn)浙江、湖南等省，現(xiàn)廣泛分布于我國(guó)南方地區(qū)[1]。我國(guó)椪柑資源十分豐富[2]，椪柑果實(shí)出汁率高，富含維C、胡蘿卜素、膳食纖維、礦物質(zhì)等多種成分，具有抗衰老、預(yù)防心血管疾病、健脾胃等功效[3]，通常用來鮮食，部分經(jīng)加工成果汁、果醋及果酒等產(chǎn)品形式[4-5]。然而，由于椪柑產(chǎn)業(yè)化加工技術(shù)研究不夠，使得椪柑資源難以得到高值化利用而造成浪費(fèi)。

白蘭地是指將葡萄或其他水果，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、陳釀及調(diào)配而成的蒸餾酒；目前，白蘭地原料呈現(xiàn)多元化[6]，但暫時(shí)沒有以椪柑為原料。研究利用椪柑汁進(jìn)行酒精發(fā)酵，采用響應(yīng)面法優(yōu)化椪柑白蘭地原料酒的發(fā)酵工藝條件，制備椪柑白蘭地原料酒，為椪柑白蘭地精深加工提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椪柑鮮果，吉首市優(yōu)質(zhì)椪柑基地提供；果酒專用酵母（RW）、生香活性干酵母；果膠酶（20 000 U/g）、橙皮苷酶、柚苷酶；碳酸氫鈉（AR）；蔗糖、檸檬酸，均為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Y966 型多功能榨汁機(jī)，上海九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；TDL-40B 型臺(tái)式離心機(jī)，上海安享科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；JA-5103N 型高精度電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-25 數(shù)字式pH 計(jì)，上海雷磁儀廠產(chǎn)品；WYT-J 型手持糖度計(jì)，成都光學(xué)廠產(chǎn)品；DK-S28 型電熱恒溫水浴鍋，上海精其儀器有限公司產(chǎn)品；10-20 型精密酒精計(jì)，上海醫(yī)用儀表廠產(chǎn)品；BSP-250 型生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程[7]

椪柑鮮果→分選清洗→去皮→榨汁→酶解→離心分離→調(diào)節(jié)糖酸度→接種酵母→酒精發(fā)酵→過濾→椪柑白蘭地原酒→蒸餾→橡木桶貯藏陳釀→椪柑白蘭地。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）原料篩選與預(yù)處理。選用成熟優(yōu)質(zhì)椪柑鮮果，清洗后去皮，果肉進(jìn)行榨汁，制備果漿。

（2）酶解。添加果膠酶40 mg/L，橙皮苷酶0.3 g/L，柚苷酶0.5 g/L，攪拌均勻，于40 ℃水浴中酶解120 min。將酶解后果漿以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，150 目濾布過濾，果汁備用。

（3）調(diào)節(jié)糖酸度。使用化學(xué)法降酸，向果汁中加入碳酸鈉，通過添加蔗糖的方式進(jìn)行初始含糖量的調(diào)節(jié)，調(diào)整糖度為12%～26%，調(diào)整果汁pH 值為3.5～5.5。

（4）接種酵母。將一定量的果酒酵母、生香活性干酵母（質(zhì)量比2∶1）用10 倍質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%葡萄糖水溶液進(jìn)行溶解，于35 ℃條件下復(fù)水活化40 min，倒入椪柑果汁中混勻，將接種完成后的果汁轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)。

（5）酒精發(fā)酵。將接種后的椪柑果汁在恒溫和密封的條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵，定時(shí)測(cè)定糖度、酒精度，觀察發(fā)酵液表面變化情況，以保證發(fā)酵正常進(jìn)行，當(dāng)發(fā)酵液殘?zhí)切∮? g/L 時(shí)可結(jié)束發(fā)酵，進(jìn)入椪柑白蘭地加工的陳釀和蒸餾工序。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1）初始糖度。選取酵母添加量0.2%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵液pH 值4.0，探討初始糖度（12%，14%，16%，18%，20%，22%，24%，26%，28%）對(duì)酒精發(fā)酵效果的影響。

（2）酵母添加量。選取初始糖度20%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵液pH 值4.0，探討酵母添加量（0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%，0.35%，0.40%）對(duì)酒精發(fā)酵效果的影響。

（3）發(fā)酵時(shí)間。選取初始糖度20%，酵母添加量0.2%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵液pH 值4.0，探討發(fā)酵時(shí)間（4，5，6，7，8，9，10 d）對(duì)酒精發(fā)酵效果的影響。

（4）發(fā)酵溫度。選取初始糖度20%，酵母添加量0.2%，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵液pH 值4.0，探討發(fā)酵溫度（18，20，22，24，26，28，30，32 ℃）對(duì)酒精發(fā)酵效果的影響。

（5）發(fā)酵液pH 值。選取初始糖度20%，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵溫度25 ℃、酵母添加量0.2%，探討發(fā)酵液pH 值（3.5，3.8，4.1，4.4，4.7，5.0，5.3）對(duì)酒精發(fā)酵效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-behnken 中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[8-9]和單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酵母添加量、初始糖度、發(fā)酵溫度為考查因素，酒精度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)，探究各因素及其交互作用對(duì)椪柑白蘭地原料酒發(fā)酵效果的影響，最終進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)并確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 理化指標(biāo)檢測(cè)

酒精度測(cè)定采用酒精計(jì)法；殘?zhí)呛繙y(cè)定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；pH 值測(cè)定采用酸度計(jì)法；糖度測(cè)定采用折光計(jì)檢測(cè)法。重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理采用Design Expert 8.0.6，繪圖采用Origin 2021。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懸妶D1。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

由圖1 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，殘?zhí)呛砍氏认陆岛笊仙内厔?shì)，酒精度呈先上升后稍有下降的趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵溫度為24 ℃時(shí)，殘?zhí)呛窟_(dá)最低值2.18 g/L，酒精度達(dá)最高值11.65%Vol。發(fā)酵溫度高低與酵母菌生長(zhǎng)繁殖關(guān)系密切，過低的溫度會(huì)抑制酵母菌活性，減緩糖降解過程，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時(shí)間延遲且不充分；過高的溫度會(huì)加快酵母菌生長(zhǎng)繁殖，消耗的糖分不能充分轉(zhuǎn)化為酒精，發(fā)酵不充分，殘?zhí)橇科撸⑶医湍赣缮L(zhǎng)對(duì)數(shù)期提前進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵結(jié)束時(shí)間較早，酒精度偏低[10]。為保證原料酒的發(fā)酵效果，選擇發(fā)酵溫度控制范圍22～26 ℃。

2.1.2 初始糖度的影響

初始糖度對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懸妶D2。

圖2 初始糖度對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

由圖2 可知，隨著初始糖度增大，殘?zhí)呛砍掷m(xù)上升，酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)初始糖度≤22%時(shí)，殘?zhí)呛可咂骄?，酒精度大幅度升高；?dāng)初始糖度為22%～26%時(shí)，殘?zhí)呛看蠓壬撸凭冗_(dá)到最大值12.85%Vol，推測(cè)發(fā)酵接近完全；當(dāng)初始糖度＞26%時(shí)，殘?zhí)呛坷^續(xù)升高，酒精度開始降低。原因可能是初始糖度過低，酵母沒有足夠的糖分來轉(zhuǎn)換成酒精，則酒精度低；過高的初始糖度會(huì)增加發(fā)酵液的滲透壓，抑制酵母菌發(fā)酵，導(dǎo)致殘?zhí)橇扛?、酒精度低[11]。此外，較高的糖度容易引發(fā)微生物污染[12]，從而對(duì)原料酒品質(zhì)產(chǎn)生不良影響，故選取初始糖度20%～24%。

2.1.3 酵母添加量的影響

酵母添加量對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懸妶D3。

圖3 酵母添加量對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

由圖3 可知，隨著酵母添加量增大，殘?zhí)呛砍掷m(xù)下降，酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)酵母添加量≥0.20%時(shí)，殘?zhí)呛口呌诜€(wěn)定，酒精度達(dá)到最大值11.6%Vol 后開始緩慢降低。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在一定范圍內(nèi)，酵母添加量越大，發(fā)酵越充分，進(jìn)而殘?zhí)橇吭降汀⒕凭仍礁遊13]；酵母添加量過高會(huì)加快酵母菌自身的呼吸和繁殖，過度消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不利于酒精生成，導(dǎo)致殘?zhí)橇亢途凭冉档蚚14]。綜合考量，酵母添加量為0.15%～0.25%。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懸妶D4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

由圖4 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，殘?zhí)橇肯却蠓认陆?、后平緩下降，酒精度快速上升后趨于平穩(wěn)；發(fā)酵時(shí)間＞7 d 時(shí)，殘?zhí)呛亢途凭茸兓幻黠@；發(fā)酵時(shí)間為8 d 時(shí)，酒精度達(dá)最大值11.54%Vol。若發(fā)酵時(shí)間偏短，酵母菌未充分利用糖分，導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，造成原料酒的殘?zhí)橇扛摺⒕凭鹊?，而?dāng)發(fā)酵徹底時(shí)，酒精度則趨于平穩(wěn)狀態(tài)[15]?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)效率，發(fā)酵時(shí)間選擇7 d。

2.1.5 發(fā)酵液pH 值的影響

發(fā)酵液pH 值對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懸妶D5。

圖5 發(fā)酵液pH 值對(duì)酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

由圖5 可知，隨著發(fā)酵液pH 值增大，殘?zhí)呛肯认陆岛筅呌谄椒€(wěn)，酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵液pH 值4.1 時(shí)，酒精度達(dá)最大值11.62%Vol。相關(guān)研究表明，較低發(fā)酵液pH 值會(huì)嚴(yán)重抑制酵母菌，使得發(fā)酵減緩，導(dǎo)致殘?zhí)橇扛咔揖凭鹊?，而較大發(fā)酵液pH 值對(duì)于雜菌的抑制效果減弱，造成原料酒的品質(zhì)下降為劣質(zhì)[16]。因此，選擇發(fā)酵液pH 值4.1 左右為宜。

綜上，椪柑白蘭地原料酒的適宜發(fā)酵溫度22～26 ℃，初始糖度20%～24%，酵母添加量0.15%～0.25%，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵液pH 值4.1。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取初始糖度、酵母添加量、發(fā)酵溫度因素進(jìn)行Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酒精度為響應(yīng)值。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.2.2 建立回歸模型和方差分析

方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 方差分析及顯著性檢驗(yàn)

使用Design Expert 對(duì)表2 中的響應(yīng)值進(jìn)行分析，建立回歸方程預(yù)測(cè)模型：

由表3 可知，該回歸模型極顯著（p＜0.000 1），能較好反映椪柑白蘭地原料酒的酒精度與各影響因素之間的線性關(guān)系（R2=0.986 6）；調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.969 4，說明該模型擬合程度較高；失擬項(xiàng)不顯著（p=0.360 4＞0.050 0），表明該模型可適用于對(duì)椪柑白蘭地原料酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的分析預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)A，B，C 和二次項(xiàng)A，B，C 影響均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），說明考查的3 個(gè)因素對(duì)椪柑白蘭地原料酒的酒精度影響較大。交互項(xiàng)AB，BC 對(duì)響應(yīng)值影響顯著（p＜0.05），而AC 項(xiàng)影響不顯著（p＞0.05）。從F 值大小可知，3 個(gè)因素對(duì)椪柑白蘭地原料酒酒精度的影響程度依次為初始糖度＞酵母添加量＞發(fā)酵溫度。

2.2.3 各因素交互作用分析

各因素交互作用的響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

由圖6 可知，隨著各因素水平的升高，酒精度呈先上升后下降的整體趨勢(shì)。曲面坡度越陡，說明其對(duì)響應(yīng)值的影響越大，故各因素對(duì)酒精度的影響由大到小依次是A＞B＞C。同時(shí)，等高線的形狀能反映出各因素交互作用所產(chǎn)生的影響程度，等高線越接近橢圓形，說明交互作用越顯著[17]。據(jù)圖6 分析可得，AB，BC 線較密集且呈橢圓狀，表明初始糖度和酵母添加量、發(fā)酵溫度和酵母添加量交互作用較強(qiáng)，影響顯著（p＜0.05）；AC 線接近圓形，表明初始糖度和發(fā)酵溫度交互項(xiàng)影響不顯著。響應(yīng)面分析與方差分析結(jié)果相一致。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert 分析優(yōu)化，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，椪柑白蘭地原料酒發(fā)酵工藝優(yōu)化條件為酵母添加量0.22%，初始糖度23.55%，發(fā)酵溫度24.93 ℃，此條件下的酒精度為13.072 9%Vol。結(jié)合單因素試驗(yàn)和實(shí)際可操作性，調(diào)整工藝參數(shù)為酵母添加量0.22%，初始糖度24%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵液pH 值4.1，驗(yàn)證試驗(yàn)取3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，酒精度為13.05%Vol，且接近模型理論預(yù)測(cè)值，表明該理論模型與試驗(yàn)實(shí)際結(jié)果的吻合度較高，采用響應(yīng)面法優(yōu)化后的椪柑白蘭地原料酒發(fā)酵工藝條件具有較高參考價(jià)值。

3 結(jié)論

以椪柑果汁為原料，在開展椪柑白蘭地原料酒發(fā)酵的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明酵母用量、初始糖度、發(fā)酵溫度等3 個(gè)因素對(duì)椪柑白蘭地原料酒的發(fā)酵效果影響較大，影響大小依次為初始糖度＞酵母添加量＞發(fā)酵溫度，確定椪柑白蘭地原料酒發(fā)酵工藝優(yōu)化條件為酵母添加量0.22%，初始糖度24%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵液pH 值4.1。在此優(yōu)化條件下，得到椪柑白蘭地原料酒的酒精度為13.05%Vol。綜上，響應(yīng)面法用于椪柑白蘭地原料酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化為可行方法。