劉書彤，吳 磊，劉兆昱，朱振元

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

羊肚菌（Morchella esculenta）作為一種可食用、可藥用、鮮嫩可口的野生真菌，主要生長于潮濕的闊葉林地上，由于其形態(tài)酷似羊肚而得名[1]?！侗静菥V目》 中對于羊肚菌有這樣的記載：“甘寒無毒，益腸胃，化痰利氣，補(bǔ)腦提神”[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究表明，其含有的活性成分，能夠調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)[3]，具有抗疲勞[4]、抗氧化[5]、抗菌[6]、保肝、護(hù)肝[7]等功效。

目前，野生羊肚菌的生長條件對氣候、溫度、濕度、土壤等多種外界環(huán)境條件要求高，產(chǎn)量較低，致使羊肚菌在市場上供不應(yīng)求、造成價(jià)格居高不下的局面。供應(yīng)到市場上的羊肚菌需要滿足地方等級規(guī)格和出口外銷的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要以全剪柄精品（pileus of Morchella esculenta，PME）為主，需要將3～5 cm 長的菌柄裁剪[8]，致使我國每年會產(chǎn)生數(shù)以萬噸的羊肚菌下腳料，造成資源浪費(fèi)。有研究表明，羊肚菌菌柄富含多糖[9]、礦物質(zhì)元素[10]、不飽和脂肪酸[11]、氨基酸[12]、維生素[13]、多酚[14]等多種活性成分，但羊肚菌菌柄的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)緊密，由果膠、幾丁質(zhì)、纖維素等多種成分組成，一般的物理方法難以破壞細(xì)胞組織。通常采用熱水浸提法，稀酸、稀堿提取法等，張景等人[15]采用傳統(tǒng)水提醇沉方法羊肚菌子實(shí)體多糖得率為6.69%，雖然簡單易操作，但是提取溫度高易造成能源浪費(fèi)；稀酸、稀堿提取法測得羊肚菌多糖得率分別為10.74%，5.04%，但存在容易破壞其活性成分結(jié)構(gòu)等問題[16]。酶法提取多糖具有反應(yīng)條件溫和、安全無毒且能夠減少原料和試劑的消耗等優(yōu)點(diǎn)，從而降低成本；果膠酶能夠破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)活性成分流出溶解從而提高得率[17]。

以裁剪掉的羊肚菌菌柄為原料，使用酶法對羊肚菌菌柄進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，以提高多糖得率，探究在何種條件下多糖的得率最優(yōu)，對羊肚菌下腳料進(jìn)行高值化開發(fā)，以期為羊肚菌菌柄在食品、保健品、藥品等領(lǐng)域的深加工提供理論依據(jù)，為鄉(xiāng)村振興提供綠色動力。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌菌柄，貴州省榕江盤正農(nóng)業(yè)有限公司提供；果膠酶（50 kU/g）、纖維素酶（20 kU/g）、木瓜蛋白酶（200 kU/g），綿陽鑫奧科生物科技有限公司提供；標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.1 mg/L），上海源葉生物科技有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速粉碎機(jī)，永康市圣象電器有限公司產(chǎn)品；分析天平，愛來寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pH 計(jì)，德國Sartorius 公司產(chǎn)品；加熱攪拌水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)，上海縱科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將購得的羊肚菌菌柄在40 ℃條件下烘干6 h 后粉碎，過100 目篩，即得羊肚菌菌柄粉末，加入酶進(jìn)行酶解后，于95 ℃條件下滅酶，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，取上清液加入4 倍體積無水乙醇，低溫靜置過夜，然后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min，棄上清液，加入蒸餾水溶解沉淀，凍干即得羊肚菌菌柄粗多糖[18]。

1.3.2 不同酶的選取

稱取4 份羊肚菌菌柄粉末0.50 g，1 組不添加酶作為空白對照，其余3 組分別加入果膠酶0.05 g，纖維素酶0.05 g，木瓜蛋白酶0.05 g；調(diào)節(jié)pH 值4.0，于45 ℃條件下酶解2 h，試驗(yàn)5 次，比較不同酶對羊肚菌菌柄多糖得率的影響。

1.3.3 羊肚菌菌柄多糖得率測定

結(jié)合硫酸-苯酚法[19]測定初始提取物中羊肚菌菌柄多糖的含量。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取質(zhì)量濃度0.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 置于試管中，加蒸餾水補(bǔ)至1 mL，再分別向每個(gè)試管中加入6%的苯酚溶液溶液1.0 mL 和濃硫酸溶液5.0 mL，并充分混勻，靜置10 min，放入30 ℃水浴鍋中水浴20 min，冷卻至室溫后，于波長490 nm 處測定吸光度。最后，以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=10.991 4X+0.012 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）多糖得率的測定。提取的多糖按照上述方法測定吸光度，按下式計(jì)算得率[20]：

式中：W——羊肚菌菌柄多糖的得率，%；

C——測得羊肚菌菌柄多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——定容體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——稱取的樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 羊肚菌菌柄多糖酶解條件工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。①酶添加量對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。稱取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶解時(shí)間1 h，酶解溫度45 ℃，酶解pH 值4.0，考查不同酶添加量（0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%）對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。②酶解時(shí)間對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。稱取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解溫度45 ℃，酶解pH 值4.0，考查不同酶解時(shí)間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h）對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。③酶解溫度對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。稱取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解時(shí)間1 h，酶解pH 值4.0，考查不同酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。④酶解pH 值對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。稱取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解時(shí)間1 h，酶解溫度45 ℃，考查不同酶解pH 值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5）對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)?；趩我蛩卦囼?yàn)的結(jié)果，采取Box-behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 分析數(shù)據(jù)，Origin Pro 2019 作圖，SPSS 27 進(jìn)行顯著性分析，利用Design Expert 13 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶種類對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

酶種類對羊肚菌菌柄多糖得率的影響見圖2。

圖2 酶種類對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由圖2 可知，在一定的提取條件下，加入酶后可以相對提高羊肚菌菌柄多糖的得率，果膠酶組多糖得率最高，為6.35%，是由于果膠酶可以有效地將果膠等大分子物質(zhì)分解成小分子，增加活性成分的釋放[21]。因此，試驗(yàn)選用果膠酶進(jìn)行酶解。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶添加量對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

酶添加量對羊肚菌菌柄多糖得率的影響見圖3。

圖3 酶添加量對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由圖3 可知，隨著酶添加量的增加，羊肚菌菌柄的多糖得率先增大后減小。當(dāng)酶添加量達(dá)到1.0%時(shí)，多糖得率為4.53%（p＜0.05）?？赡苁怯捎谠龃竺笣舛瓤梢允姑概c底物更加充分接觸，酶解效果提高，多糖得率增加；當(dāng)酶添加量大于1.0%時(shí)，多糖得率有所下降，可能是由于酶添加量增加部分多糖發(fā)生降解作用，導(dǎo)致多糖得率降低[22]。因此，確定酶添加量為1.0%。

2.2.2 酶解時(shí)間對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

酶解時(shí)間對羊肚菌菌柄多糖得率的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由圖4 可知，當(dāng)酶解時(shí)間低于1.5 h 時(shí)，酶與底物未能充分反應(yīng)完全，1.5 h 時(shí)得率達(dá)到最大為5.39%（p＜0.05），隨酶解時(shí)間的延長，羊肚菌菌柄多糖得率逐漸減小，可能是由于酶解時(shí)間過長會引起多糖炭環(huán)裂解結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，或是其他水溶性成分的溶出干擾了測定，導(dǎo)致多糖含量降低[23]。

2.2.3 酶解溫度對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

酶解溫度對羊肚菌菌柄多糖得率的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由圖5 可知，隨著酶解溫度的升高，羊肚菌菌柄多糖得率先上升后下降，在45 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為6.91%（p＜0.05）。可能是由于酶對溫度變化較敏感，溫度過低時(shí)酶的活性未被激活；溫度升高時(shí)酶變性而失活，降低了酶與底物的反應(yīng)，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物減少[24]。因此，選取45 ℃為最適酶解溫度。

2.2.4 酶解pH 值對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由于不同酶的最適pH 值不同，因此酶的活性也受pH 值的影響[25]。

酶解pH 值對多糖得率的影響見圖6。

圖6 酶解pH 值對多糖得率的影響

由圖6 可知，隨著酶解pH 值的上升，多糖得率先升后降，在酶解pH 值4.0 時(shí)達(dá)到最高值，為5.82%（p＜0.05）；酶解pH 值低于4 時(shí)，酶與底物的反應(yīng)不充分；酶解pH 值高于5 時(shí)，可能酶的空間結(jié)構(gòu)受到破壞，進(jìn)而引起酶的活性和酶構(gòu)象發(fā)生變化[26]。因此，羊肚菌菌柄多糖提取最佳酶解pH 值為4。

2.3 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在影響羊肚菌菌柄多糖得率的4 個(gè)因素中分別選取3 個(gè)水平進(jìn)行編碼（表1）。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析

利用Design Expert 對表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的回歸方程：

回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)見表3。

表3 回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

由表3 可知，該模型顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)p=0.053 1＞0.050 0，不顯著。R2=0.965 1，表明該模型可以較好地反映酶解羊肚菌菌柄提取多糖過程中各影響因素與響應(yīng)值的關(guān)系并預(yù)測最佳條件。4 個(gè)因素對羊肚菌菌柄多糖得率影響的主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即酶解時(shí)間＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解pH 值。

2.4 Box-behnken 響應(yīng)面圖分析

曲線趨勢圖通過將4 個(gè)因素中任意2 個(gè)因素固定為零水平，以反映兩兩交互作用對羊肚菌菌柄多糖得率的影響。

各因素對羊肚菌菌柄多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖7。

由圖7 可知，結(jié)合曲線趨勢圖及等高線圖反映出酶解時(shí)間對羊肚菌菌柄多糖得率的影響更顯著，與方差分析的結(jié)果一致。經(jīng)響應(yīng)面模型分析得到酶提羊肚菌菌柄多糖的最佳條件為酶添加量0.980 2%，酶解時(shí)間1.397 3 h，酶解溫度43.820 8 ℃，酶解pH值3.967 8，此時(shí)羊肚菌菌柄多糖得率為7.133 8%。為方便操作，將羊肚菌菌柄多糖的提取條件修正為酶添加量1%，酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度45 ℃，酶解pH 值4。在此條件下，進(jìn)行5 次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得羊肚菌菌柄多糖的平均得率為7.12%。

3 結(jié)論

以羊肚菌菌柄下腳料為試驗(yàn)原料，在單因素試驗(yàn)篩選基礎(chǔ)上，利用Box-behnken 響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取羊肚菌菌柄多糖的工藝技術(shù)，獲得最佳提取工藝參數(shù)為復(fù)合酶添加量1%（以底物質(zhì)量計(jì)），酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度45 ℃，酶解pH 值4，在此工藝參數(shù)下其得率為7.12%，接近模型預(yù)測的提取值。使用該工藝處理羊肚菌下腳料多糖得率與子實(shí)體接近，提高活性物質(zhì)得率的同時(shí)避免了資源浪費(fèi)。試驗(yàn)驗(yàn)證了果膠酶提取羊肚菌菌柄多糖具有可行性，為進(jìn)一步對羊肚菌菌柄下腳料的綜合利用及高值化開發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)，為鄉(xiāng)村振興提供綠色動力。