仇建南， 汪 鵬， 曹 胤， 王忠夏， 吳俊華， 江春平

1 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院肝膽外科， 南京 210008

2 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 南京 210093

肝細(xì)胞癌（HCC）是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不斷上升。盡管肝部分切除術(shù)和肝移植術(shù)是目前主要的治療手段，但是很多患者確診時(shí)已經(jīng)喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后較差。雖然HCC的治療已經(jīng)取得一些新的進(jìn)展，比如靶向藥物治療、免疫治療等［1-2］。但是HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍然需要進(jìn)一步深入探究。

驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員15（KIF15）具有四聚體紡錘馬達(dá)結(jié)構(gòu)，其馬達(dá)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)以ATP樣構(gòu)型，頸部接頭與催化核心對(duì)接；通過(guò)水解ATP 為多種物質(zhì)的運(yùn)輸提供能量［3-4］。KIF15 在腫瘤中的作用被廣泛報(bào)道，例如KIF15通過(guò)激活Raf/MEK/ERK 通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展［5］；KIF15上調(diào)促進(jìn)泛素特異性蛋白酶15（USP15）介導(dǎo)的DEK 去泛素化導(dǎo)致平滑肌肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［6］；KIF15通過(guò)抑制活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)胃癌進(jìn)展［7］。目前，KIF15 在HCC 中的作用尚不確切，因此本研究旨在探究KIF15在HCC中的潛在作用機(jī)制，為HCC的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 人正常肝細(xì)胞L02，人HCC細(xì)胞株HepG2、LM3、MHCC-97H 和Hep3B（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；KIF15過(guò)表達(dá)慢病毒（LV-KIF15）和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照（vector），KIF15 敲低慢病毒（sh-KIF15）和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照（shNC）及相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑HiTransG A/P（上海吉?jiǎng)P生物有限公司）；Trizol 試劑（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix 檢測(cè)試劑盒與CCK8 試劑（諾唯贊生物科技有限公司）；抑制劑LY294002（MCE 公司）；EDU 試劑盒（銳博生物有限公司）；Western Blot 試劑盒（碧云天有限公司）。本研究中抗體包括KIF15、GAPDH、p-PI3K（Tyr458）、PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；胰蛋白酶（新賽美公司）；青鏈霉素雙抗（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用DMEM（含10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）培養(yǎng)人HCC 細(xì)胞株HepG2、LM3、MHCC-97H、Hep3B 和正常肝細(xì)胞L02，放于37 °C 含5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率超過(guò)85%時(shí)，胰蛋白酶消化后分皿傳代培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 將Hep3B 和HepG2 培養(yǎng)至狀態(tài)良好，按每孔100 萬(wàn)接種于6 孔板中，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。Hep3B 轉(zhuǎn)染針對(duì)KIF15 的干擾慢病毒LV-shKIF15（sh1、sh2 和sh3）以及對(duì)照（sh-NC）；HepG2 轉(zhuǎn)染編碼KIF15 的慢病毒載體（LV-KIF15）以及對(duì)照（vector）。使用吉?jiǎng)P公司助轉(zhuǎn)染試劑提高轉(zhuǎn)染效率。培養(yǎng)2天后用含嘌呤霉素（2.5 μg/mL）的DMEM篩選培養(yǎng)。

1.2.3 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) 將相應(yīng)的HCC 細(xì)胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好后收集，采用Trizol 試劑提取細(xì)胞的總RNA，然后合成cDNA的反應(yīng)混合物為20 μL/孔，由1 μg總RNA和4 μL 5×HiScript ⅡqRT SuperMix 及無(wú)RNase 的ddH2O 組成。qRT-PCR 的反應(yīng)體系為：1 μL cDNA、5 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix、0.2 μL 上游引物、0.2 μL 下游引物和3.6 μL DEPC 水。設(shè)定程序：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s， 60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，40 個(gè)循環(huán)。KIF15 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量按2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCC 細(xì)胞種在96 孔板（500個(gè)細(xì)胞/孔）中，分別于第1、2、3、4、5天相同時(shí)間，在每個(gè)孔加入CCK-8 溶液（10 μL/孔），在培養(yǎng)箱中孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔在450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)的相應(yīng)的HCC細(xì)胞按每孔500 個(gè)/2 mL 培養(yǎng)基密度接種于6 孔板中，連續(xù)培養(yǎng)14 天，棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，棄掉多聚甲醛后每個(gè)孔加入2 mL 結(jié)晶紫染液，避光染色30 min 后，PBS 洗滌，等待自然干燥后，肉眼計(jì)數(shù)克隆形成的數(shù)目。

1.2.6 EdU 實(shí)驗(yàn) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株接種于96 孔板（2×104個(gè)細(xì)胞/孔）中，用DMEM 培養(yǎng)1天。然后，在37 ℃下用50 μmol/L 的EdU 孵育2 h。再用4%的甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，然后用0.5%的TritonX-100 滲透細(xì)胞株10 min。加入400 μL 1×ApolloR 反應(yīng)物，再加入400 μL Hoechest33342，PBS 沖洗3 次后觀察EdU 陽(yáng)性細(xì)胞。最后通過(guò)顯微鏡拍攝細(xì)胞的圖像。

1.2.7 Western Blot實(shí)驗(yàn) 收集Hep3B和HepG2細(xì)胞，加入包含PMSF和磷酸酶蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞30 min。收集蛋白樣品并檢測(cè)其濃度。取30 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE（10%）凝膠電泳75 min，繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。使用Western Blot 快速封閉液室溫孵育30 min。將條帶置于相應(yīng)一抗（1∶1 000）中4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。第二天用TBST洗膜3次，每次10 min。然后將條帶置于特異性二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h后，再次TBST洗膜3次，每次10 min。天能凝膠成像儀顯影蛋白條帶。Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.2.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的sh-NC/sh3 Hep3B 細(xì)胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好，按1×106個(gè)細(xì)胞/100 μL PBS 的密度重懸，接種于4 周齡雌性BALB/c 裸鼠的皮下，每組3 只裸鼠，皮下注射腫瘤細(xì)胞。28 天后摘下皮下瘤，計(jì)算腫瘤體積與腫瘤重量。將瘤塊石蠟包埋、切片和脫蠟，分別進(jìn)行Ki67 和TUNEL 染色。實(shí)驗(yàn)鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2022-0009，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2022-0034。

1.2.9 生物信息學(xué)分析 使用TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集分析KIF15 在HCC 中的表達(dá)情況以及表達(dá)高低對(duì)臨床預(yù)后的影響。GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析KIF15 在HCC 中與腫瘤分期的關(guān)系以及對(duì)預(yù)后的影響。

1.2.10 GSEA分析 為了在TCGA-HCC數(shù)據(jù)集中研究與KIF15相關(guān)的潛在信號(hào)途徑，故進(jìn)行GSEA分析。首先，基于與KIF15 表達(dá)的相關(guān)性，生成TCGA-HCC 的FPKM 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中所有基因的有序列表。然后選擇參考基因集“h.all.v6.2.entrez.Gmt”進(jìn)行分析，最后使用GSEA 軟件（v2.10.1）分析KIF15高、低表達(dá)組之間的基因富集情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIF15 在HCC 中的相對(duì)表達(dá)情況和對(duì)生存率的影響 通過(guò)分析TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集中KIF15的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在HCC 癌組織中KIF15 的表達(dá)量顯著高于正常肝組織（P＜0.05）（圖1a、b）；GEPIA 數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，KIF15 與HCC 病理學(xué)分期呈正相關(guān)（P＜0.05）（圖1c）；qRT-PCR和Western Blot 分析發(fā)現(xiàn)KIF15 在HCC 細(xì)胞株中表達(dá)增高，同時(shí)選取表達(dá)量最高Hep3B 細(xì)胞株和較低的HepG2細(xì)胞株做后續(xù)探究（P＜0.05）（圖1d、e，表1）。

表1 Western Blot 檢測(cè)KIF15蛋白在HCC細(xì)胞株中的表達(dá)水平Table 1 The protein expression level of KIF15 in HCC cell lines by Western Blot

圖1 KIF15在HCC中的相對(duì)表達(dá)情況和對(duì)生存率的影響Figure 1 The relative expression of KIF15 in hepatocellular carcinoma and its effect on survival rate

通過(guò)分析TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集中KIF15 與HCC 的生存關(guān)系，發(fā)現(xiàn)KIF15高表達(dá)的患者生存率顯著低于KIF15低表達(dá)者（P＜0.05）（圖1f）；分析GEPIA 數(shù)據(jù)集中KIF15與HCC 的生存關(guān)系，亦發(fā)現(xiàn)KIF15 高表達(dá)的患者生存率顯著低于KIF15低表達(dá)者（P＜0.05）（圖1g）。綜上，KIF15在HCC中表達(dá)增高，且高表達(dá)患者生存更差。

2.2 KIF15 對(duì)HCC 增殖能力的影響 通過(guò)轉(zhuǎn)染慢病毒敲低Hep3B 細(xì)胞株中KIF15 的表達(dá)量，qRT-PCR 和Western Blot實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)sh3慢病毒的敲低效率最高，與sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B細(xì)胞的KIF15 mRNA（0.17±0.05 vs 0.99±0.03，P＜0.001）和蛋白水平（P＜0.05）均顯著下降（圖2a，表2），并選擇sh3-Hep3B 細(xì)胞用于后續(xù)研究。其次，對(duì)轉(zhuǎn)染慢病毒過(guò)表達(dá)HepG2 細(xì)胞株中KIF15的表達(dá)量，通過(guò)qRT-PCR 和Western Blot 實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的KIF15 mRNA水平（11.37±1.17 vs 1.00±0.13，P＜0.001）和蛋白水平（6.12±0.23 vs 0.99±0.06，P＜0.001）均升高（圖2b）。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的細(xì)胞活力受到抑制（0.765±0.104 vs 1.560±0.135，P＜0.05）（圖2c）；而與vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2的細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（1.664±0.133 vs 1.056±0.123，P＜0.05）（圖2c）。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)集分析顯示，KIF15在HCC中與增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）（圖2d），提示KIF15 對(duì)于HCC 增殖能力可能存在促進(jìn)作用。

表2 Western Blot 檢測(cè)KIF15蛋白在Hep3B中的表達(dá)水平Table 2 The protein expression level of KIF15 in Hep3B by Western Blot

圖2 KIF15對(duì)HCC增殖能力的影響Figure 2 Effect of KIF15 on proliferation of hepatocellular carcinoma

通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與sh-NC-Hep3B 相比，sh3-Hep3B 的克隆形成數(shù)顯著減少（51.67±6.03 vs 118.33±11.59，P＜0.001）（圖2e）；而與vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的克隆形成數(shù)顯著增多（172.00±7.55 vs 74.67±7.57，P＜0.001）（圖2f）。同時(shí)EdU 染色實(shí)驗(yàn)顯示，與sh-NC-Hep3B 相比，sh3-Hep3B 的EdU 陽(yáng)性率顯著降低［（14.33±2.08）% vs （28.67±2.08）%，P＜0.01］（圖2g）；而與vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的EdU陽(yáng)性率顯著升高［（28.67±1.53）% vs （15.00±1.73）%，P＜0.001］（圖2h）。綜上，KIF15能夠促進(jìn)HCC的增殖能力。

2.3 KIF15 對(duì)HCC 體內(nèi)生長(zhǎng)能力的影響 通過(guò)構(gòu)建皮下瘤生長(zhǎng)模型，探究KIF15 對(duì)于HCC 體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Hep3B細(xì)胞株（sh-NC/sh3）按照每100 μL中1×106個(gè)細(xì)胞的數(shù)量，接種于裸鼠皮下，造模后皮下瘤瘤體見(jiàn)圖3a。研究結(jié)果顯示，與sh-NCHep3B 細(xì)胞相比，sh3-Hep3B 細(xì)胞皮下瘤體積［（350.00±100.00）mm3vs （1 046.67±105.03）mm3，P＜0.001］和重量［（366.67±110.15）mg vs （1 166.67±76.38）mg，P＜0.001］均顯著降低（圖3b、c）。對(duì)皮下瘤進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，sh3-Hep3B 細(xì)胞皮下瘤Ki67 的組化評(píng)分顯著低于轉(zhuǎn)染sh-NC-Hep3B 的皮下瘤（2.33±0.58 vs 7.33±1.15，P＜0.01）（圖3d）；而轉(zhuǎn)染sh3-Hep3B 細(xì)胞皮下瘤TUNEL 的組化評(píng)分顯著高于sh-NC-Hep3B 細(xì)胞的皮下瘤（5.33±1.15 vs 1.33±0.58，P＜0.01）（圖3e），提示敲低KIF15 抑制了Hep3B 皮下瘤的增殖能力，而增強(qiáng)了凋亡水平。綜上，敲低KIF15能夠抑制HCC的體內(nèi)生長(zhǎng)能力。

圖3 KIF15對(duì)HCC體內(nèi)生長(zhǎng)能力的影響Figure 3 Effect of KIF15 on the growth capacity of hepatocellular carcinoma in vivo

2.4 KIF15 對(duì)HCC 增殖能力影響的機(jī)制 通過(guò)GSEA分析KIF15 在HCC 中發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)KIF15與PI3K/AKT/mTOR 通路呈正相關(guān)（NES=1.59，P＜0.001）（圖4a）。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與sh-NC-Hep3B細(xì)胞相比，sh3-Hep3B 細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路受到顯著抑制（P值均＜0.001）（圖4b，表3）；而與vector 組相比，過(guò)表達(dá)KIF15 能夠促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路顯著增強(qiáng)（P值均＜0.001）（圖4c，表4）；此外，PI3K 抑制劑LY294002 能夠抑制LV-KIF15-HepG2 細(xì)胞中的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路（圖4d，表5）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路后，LY294002+LV-KIF15-HepG2 細(xì)胞的活力較LV-KIF15-HepG2 細(xì)胞明顯下降（1.084±0.118 vs 1.670±0.102，P＜0.01）（圖4e）。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于LV-KIF15-HepG2 細(xì)胞，LY294002 處理后的LV-KIF15-HepG2 細(xì)胞的克隆形成能力受到顯著抑制（78.33±7.64 vs 161.67±17.56，P＜0.01）（圖4f）。EdU 染色實(shí)驗(yàn)顯示，相較于LVKIF15-HepG2 細(xì)胞，LY294002 處理后的LV-KIF15-HepG2細(xì)胞的EdU陽(yáng)性率顯著降低［（18.61±1.24）% vs （28.54±3.83）%，P＜0.05］（圖4g）。綜上，KIF15 通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)HCC的增殖能力。

表3 Western Blot 檢測(cè)Hep3B細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果Table 3 Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in Hep3B cells

表4 Western Blot 檢測(cè)HepG2細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果Table 4 Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in HepG2 cells

表5 LY294002抑制劑干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 5 The effect of inhibitor LY294002 intervention on the expression of related proteins in HepG2 cells

圖4 KIF15對(duì)HCC增殖能力影響的機(jī)制探究Figure 4 The mechanism of the effect of KIF15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma

3 討論

肝癌發(fā)病率和死亡率位列全球惡性腫瘤第6 位和第4位，預(yù)計(jì)到2040年全球?qū)⒂?40萬(wàn)肝癌患者，且將有130 萬(wàn)人死于肝癌［8］。目前HCC 的主要治療方法是手術(shù)、介入、化療和免疫治療等，但是患者的復(fù)發(fā)率仍然較高，5年生存率僅約20%［9-11］。因此，探究HCC 發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，對(duì)HCC的診治將提供重要的理論基礎(chǔ)。

KIF15，又名kinesin-12，是一種微管相關(guān)蛋白，其功能是微管依賴(lài)轉(zhuǎn)運(yùn)或紡錘體組織的調(diào)節(jié)因子［12-13］。已有大量研究［14-15］揭示了KIF15在多種腫瘤中的作用。在胰腺癌中，KIF15通過(guò)招募USP10和磷酸甘油酸激酶1增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的糖酵解能力，從而增強(qiáng)其惡性程度［16］；敲低KIF15 后，膠質(zhì)瘤的增殖能力受到抑制［17］；此外，KIF15在鼻咽癌組織中高表達(dá)，與鼻咽癌預(yù)后不良相關(guān)，敲低KIF15 將抑制鼻咽癌細(xì)胞株的增殖和傾襲能力［18］。在前列腺癌中，KIF15通過(guò)增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的雄激素受體（AR）信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)恩雜魯胺耐藥；機(jī)制上，KIF15直接結(jié)合AR/AR-v7的N端，通過(guò)增加USP14與AR/AR-v7 的蛋白結(jié)合，阻止AR/AR-v7 蛋白的降解［19］。HCC 作為惡性程度較高的常見(jiàn)腫瘤，KIF15對(duì)HCC的作用尚不明確。

本研究通過(guò)分析TCGA 和GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)KIF15在HCC組織中表達(dá)顯著增高，且KIF15高表達(dá)與HCC不良預(yù)后相關(guān)。通過(guò)qRT-PCR 和Western Blot 評(píng)估KIF15在HCC 細(xì)胞株中的表達(dá)水平，選擇HepG2 過(guò)表達(dá)KIF15以及選擇Hep3B 敲低KIF15，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)和敲低的效率后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的探究。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)KIF15 導(dǎo)致HCC 細(xì)胞株的增殖能力增強(qiáng)，而敲低KIF15 能夠抑制HCC 細(xì)胞株的增殖；并且敲低KIF15 能夠抑制HCC 的體內(nèi)生長(zhǎng)能力。上述結(jié)果表明KIF15 在HCC 中發(fā)揮促進(jìn)增殖的促癌作用。

已有大量研究［20-22］報(bào)道，PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TBK1通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)甲狀腺癌進(jìn)展［23］；UHMK1通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生［24］；STK3通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，降低胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，并且促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡［25］。本研究通過(guò)GSEA 分析發(fā)現(xiàn)KIF15 在HCC 中與PI3K/AKT/mTOR 的激活呈正相關(guān)。通過(guò)Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)KIF15能夠激活HepG2細(xì)胞的PI3K/AKT/mTOR 通路，而敲低KIF15導(dǎo)致Hep3B 細(xì)胞的PI3K/AKT/mTOR 通路受到抑制。通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PI3K 抑制劑LY294002 能夠抑制過(guò)表達(dá)KIF15的HepG2細(xì)胞中的PI3K/AKT/mTOR 通路，并且導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制。

綜上所述，本研究證實(shí)KIF15 通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR通路，發(fā)揮促進(jìn)HCC的增殖能力，為KIF15作為肝癌的診斷標(biāo)志和預(yù)后指標(biāo)提供了理論依據(jù)，但是KIF15在HCC中的精確機(jī)制仍需深入探究。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2016 年5 月7 日經(jīng)由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)與福利委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：2016-057-01，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：仇建南負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作，并撰寫(xiě)論文；汪鵬、曹胤、王忠夏負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和文章潤(rùn)色；江春平、吳俊華提供課題思路，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，審閱最終文稿。