常 凱， 王艷艷， 江忠勇， 孫 巍， 劉晨霞， 那琬琳， 許宏宣， 謝 靜， 劉 媛， 陳 敏，5

1 中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科， 成都 610083

2 成都市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院， 成都 610041

3 四川省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所， 成都 610041

4 成都市實(shí)驗(yàn)外國(guó)語(yǔ)學(xué)校生物教學(xué)與研究組， 成都 611134

5 西南大學(xué)藥學(xué)院/中醫(yī)藥學(xué)院， 重慶 400715

我國(guó)每年肝細(xì)胞癌（HCC）新發(fā)病例數(shù)超全球50%以上，死亡率逐年升高［1］。HCC 的發(fā)生發(fā)展受一系列遺傳和環(huán)境因素共同作用，致病機(jī)制復(fù)雜多樣。手術(shù)切除目前仍是主要治療方法，但術(shù)后的高復(fù)發(fā)率（5 年復(fù)發(fā)率＞60%）使得預(yù)后并不理想［2］。影響肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的因素眾多，如臨床病理學(xué)特征、伴發(fā)的肝病背景、宿主炎癥免疫反應(yīng)狀態(tài)等［3］。近年來(lái)提出，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的破壞及遺傳信息的不穩(wěn)定性是腫瘤復(fù)發(fā)的重要誘因。隨著細(xì)胞生物學(xué)、遺傳與表觀遺傳學(xué)，特別是組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，對(duì)肝癌復(fù)發(fā)的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)也逐漸加深，但仍不明確［4］。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記定量分析技術(shù)對(duì)肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)差異蛋白進(jìn)行檢測(cè)和注釋分析，以期進(jìn)一步對(duì)遺傳信息穩(wěn)定性遺傳機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 來(lái)源于西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2013—2020年凍存的肝癌組織樣本。確診HCC 且行肝切除術(shù)后5 年預(yù)后良好的肝癌組織10 例作為HCC 未復(fù)發(fā)組；確診HCC 且行肝切除術(shù)后2 年內(nèi)復(fù)發(fā)的肝癌組織10 例為HCC 復(fù)發(fā)組。20 例樣本pTNM 分期均為Ⅱb 期，中低分化。排除糖尿病、冠心病、高血脂、高血壓、腎病、遺傳病和自身免疫系統(tǒng)疾病。采用樣本為患者首次肝癌切除術(shù)中所切除的組織，并置于保護(hù)液中液氮保存，備用。

1.2 藥物及試劑 十二烷基硫酸鈉-SDS（中國(guó)索萊寶）、甲酸鈉（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司）；尿素、二硫蘇糖醇、四乙基溴化銨（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Millipore 公司），胰蛋白酶（美國(guó)Promega 公司）；甲酸銨（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；乙腈（美國(guó)Supelco公司）。

1.3 方法

1.3.1 總蛋白提取 將7 mol/L 尿素，1 mg/mL 蛋白酶抑制劑和2% SDS 充分混合配置樣本裂解緩沖液，加入待測(cè)樣本后于冰面上進(jìn)行超聲破碎，5 min 后進(jìn)行冷凍高速離心，15 000 r/min，20 min，吸取上清液待用。

1.3.2 蛋白消化與標(biāo)記 使用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中的總蛋白濃度。將每100 μg 蛋白移至新的試管中，并用8 mol/L 尿素稀釋至100 μL。樣本中加入11 μL二硫蘇糖醇（濃度為1 mol/L），37 ℃孵育1 h。將樣品置于10 K 超濾管，14 000 r/min 離心10 min。取120 μL 碘乙酰胺（濃度為55 mmol/L）加入樣品中，避光孵育20 min，8 mol/L尿素被10 mmol/L三乙基碳酸氫銨替換3次。測(cè)序級(jí)別改良的胰蛋白酶于37 °C 孵育12 h。消化后的樣品13 500 r/min 離心15 min。真空干燥機(jī)干燥后在0.5 mol/L三乙基碳酸氫銨中溶解。取等量蛋白進(jìn)行Trypsin酶切，得到相應(yīng)樣品的多肽；分別用不同的串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT）對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，室溫下放置2 h。標(biāo)記樣本在真空中混合并干燥。

1.3.3 高pH 反相分離 配置緩沖液A：20 mmol/L 甲酸銨溶液，使用氫氧化銨滴定至pH 為10.0；配置緩沖液B：20 mmol/L 甲酸鈉，溶劑為80%乙腈，使用氫氧化銨滴定至pH為10.0。使用緩沖液A對(duì)肽混合物進(jìn)行溶解，使用Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)樣本進(jìn)行分離，反向分離柱為美國(guó)Waters 公司C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。高pH分離用線性梯度方式進(jìn)行，緩沖液B 從5%起始至45%，時(shí)長(zhǎng)40 min，柱溫30 ℃，流速1 mL/min。分離12個(gè)餾分用于下一步檢測(cè)。

1.3.4 低pH nano-HPLC-MS/MS 檢測(cè) 肽段分餾組分用溶劑C（含0.1%甲酸的超純水）分別溶解，液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜分析。10 μL樣品上樣過(guò)色譜柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap C18，100 μm×2 cm），流速10 μL/min，3 min。隨后將線性梯度為2%～40%的D 液（含0.1%甲酸的乙腈）分別流經(jīng)分析柱（Acclaim PepMapC18，75 μm×15 cm）70 min，流速300 nL/min，電壓2 kV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 蛋白鑒定與定量 在所有樣本的蛋白中光譜值≥2的樣品定義為特定蛋白并進(jìn)行蛋白定量。蛋白相對(duì)定量是基于報(bào)告離子比率，其反映了肽的相對(duì)豐度。使用medians 對(duì)Mascot 搜索結(jié)果進(jìn)行平均和量化。蛋白的倍比差異＞1.2或＜0.83，且P＜0.05認(rèn)為具有差異表達(dá)［5］。

1.4.2 蛋白功能注釋與富集分析 用GO、KEGG 和COG/KOG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白進(jìn)行注釋，以獲得其功能。在P≤0.05差異表達(dá)蛋白中篩選關(guān)鍵信號(hào)通路［6］。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

20世紀(jì)60年代已經(jīng)開(kāi)始利用近紅外光譜對(duì)谷物的蛋白質(zhì)及其他成分進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)研究人員還采用近紅外光譜技術(shù)對(duì)小麥的蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等多種檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)與分析。近紅外光譜技術(shù)有效地提高了小麥的檢測(cè)，對(duì)小麥的檢測(cè)具有重要意義。近年來(lái)，近紅外光譜技術(shù)在脫氧萎鐮菌醇與小麥優(yōu)良品種篩選檢測(cè)中有了新的發(fā)展。

1.5 差異蛋白驗(yàn)證分析 應(yīng)用差異蛋白ELISA 試劑盒對(duì)差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證分析，ELISA 試劑及抗體購(gòu)于成都元極生物科技有限公司，使用分光光度儀對(duì)熒光值進(jìn)行判讀分析。

2 結(jié)果

2.1 HCC復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組表達(dá)量差異蛋白富集 經(jīng)全蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析后，共鑒定得到唯一肽段數(shù)38 575個(gè)，蛋白14 578 個(gè)，通過(guò)對(duì)信號(hào)通路的分析確定蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，結(jié)果表明排名第一位的為癌癥通路（ko05200），共有476 個(gè)蛋白參與。HCC 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組富集結(jié)果顯示，富集因子排名前5 位分別是：DNA 復(fù)制（0.414）、錯(cuò)配修復(fù)（0.409）、鞘脂信號(hào)通路（0.250）、堿基切除修復(fù)（0.172）、核苷酸切除修復(fù)（0.171）（圖1）。其中DNA 復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)均屬于復(fù)制與修復(fù)層級(jí)，表明在肝癌復(fù)發(fā)的進(jìn)程中，DNA修復(fù)具有重要作用。

在富集蛋白數(shù)量中，18個(gè)蛋白富集在DNA復(fù)制、17個(gè)蛋白富集在錯(cuò)配修復(fù)、6 個(gè)蛋白富集在堿基切除修復(fù)、9個(gè)蛋白富集在核苷酸切除修復(fù)。結(jié)合差異蛋白數(shù)量和Q值繪制評(píng)分前10 位通路富集氣泡圖（圖2），DNA 修復(fù)相關(guān)的4 個(gè)通路在蛋白數(shù)量、相關(guān)性和富集因子三個(gè)參數(shù)中均位居前列。

圖2 京都基因和基因組百科全書(shū)的本體論（KO）富集氣泡圖Figure 2 Bubble maps of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ontology

2.2 肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程中復(fù)制復(fù)合體調(diào)控通路的蛋白表達(dá)本研究在真核生物復(fù)制復(fù)合體通路中共檢出13 個(gè)蛋白（圖3）：小染色體維持復(fù)雜組件2～7（minichromosome maintenance complex component，MCM2～7）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、復(fù)制因子C 亞基1（replication factor C subunit 1，RFC1）、復(fù)制因子C 亞基4（replication factor C subunit 4，RFC4）、復(fù)制因子C 亞基5（replication factor C subunit 5，RFC5）、皮瓣結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶1（flap structure-specific endonuclease1，F(xiàn)EN1）、DNA連接酶1（DNA ligase 1，LIG1）、復(fù)制蛋白A3（replication protein A3，RPA3）。其中10 個(gè)蛋白在肝癌復(fù)發(fā)組織中顯著減少，分別是MCM2（P=0.018）、MCM3（P=0.047）、MCM4（P=0.014）、MCM5（P=0.008）、MCM6（P=0.006）、MCM7（P=0.007）、PCNA（P=0.019）、RFC4（P=0.002）、RFC5（P＜0.001）、LIG1（P=0.042）。

圖3 復(fù)制復(fù)合體（真核生物）富集通路蛋白表達(dá)差異Figure 3 Differential protein expression of replication complex （eukaryotic） enriched pathways

2.3 肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程中核苷酸切除修復(fù)通路的蛋白表達(dá)核苷酸切除修復(fù)通路中共檢出6個(gè)蛋白。其中PCNA（P=0.019）、RFC4（P=0.002）、RFC5（P＜0.001）、LIG1（P=0.042）共4 個(gè)蛋白表達(dá)水平顯著減少。DNA 聚合酶δ（DNA polymerase delta，POLD）和RFC1 在該研究中檢出，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 核苷酸切除修復(fù)富集通路蛋白表達(dá)差異Figure 4 Differential protein expression of nucleotide excision repair-enriched pathway proteins

2.4 肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程中堿基切除修復(fù)通路的蛋白表達(dá)全蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析共檢出7個(gè)蛋白富集在堿基切除修復(fù)通路中，分別是PCNA、FEN1、LIG1、DNA 聚合酶β（DNA polymerase beta，POLB）、無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶內(nèi)脫氧核糖核酸酶（apurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease，APEX）、聚（ADP- 核糖）聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］、POLD。其中PCNA（P=0.019）和LIG1（P=0.042）在HCC 復(fù)發(fā)組中顯著降低。FEN1、POLB、APEX、PARP和POLD在該研究中有檢出，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

圖5 堿基切除修復(fù)富集通路蛋白表達(dá)差異Figure 5 Differential protein expression of base excision repair-enriched pathways

2.5 肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程中錯(cuò)配修復(fù)富集通路的蛋白表達(dá)該研究中，在錯(cuò)配修復(fù)富集通路中共檢出9 個(gè)蛋白：MSH2、MSH6、RFC1、RFC4、RFC5、PCNA、PRA、POLD、LIG1。其中6 個(gè)蛋白在肝癌復(fù)發(fā)組織中顯著減少，分別是MSH2（P=0.026）、MSH6（P=0.006）、RFC4（P=0.002）、RFC5（P＜0.001）、PCNA（P=0.019）、LIG1（P=0.042），其他蛋白（RFC1、RPA、POLD）的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖6 錯(cuò)配修復(fù)富集通路蛋白表達(dá)差異Figure 6 Differential protein expression of mismatch repairenriched pathways

2.6 差異蛋白在不同組織間的差異表達(dá) 將HCC 復(fù)發(fā)進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)的DNA 修復(fù)通路差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)組織表達(dá)分析。比較4 個(gè)維度中倍比差異（log2FC），包括：（1）HCC/全部癌旁組織（TCGA數(shù)據(jù)）；（2）HCC/癌旁組織（HCCDB數(shù)據(jù)）；（3）HCC/全部腫瘤（TCGA數(shù)據(jù)）；（4）正常肝組織/其他正常組織（GTEx 和TCGA 數(shù)據(jù)）。HCC/癌旁組織中差異最大的為MCM2（log2FC=1.16），其次為RFC4（log2FC=1.07）；正常肝組織MCM2、MCM3、MCM4、MCM6、MCM7和MSH2明顯低于其他正常組織（圖7）。

2.7 肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程中DNA 修復(fù)通路差異蛋白富集分析在生物體內(nèi)，不同蛋白相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)行為，基于KEGG pathway 分析DNA 修復(fù)相關(guān)表達(dá)差異蛋白在肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程中的生物學(xué)功能。在真核生物復(fù)制復(fù)合體通路中，MCM 復(fù)合體中7 個(gè)組分蛋白表達(dá)減少，致使解旋酶能力下降。PCNA、RCF4 和RCF5 的蛋白表達(dá)減少使DNA 聚合酶復(fù)合體ε 的固定能力減弱。同時(shí)LIG1 減少也使連接酶能力降低。這些都可能降低生物體遺傳復(fù)制能力，并增加突變風(fēng)險(xiǎn)。在肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程中，復(fù)制蛋白A（RPA）復(fù)合體、RNA 酶（HⅠ和HⅡ）和解旋酶Dna2并未發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)變化（圖8a）。

圖8 HCC復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組差異蛋白富集通路圖（差異分析基于KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)）Figure 8 Differential protein enrichment pathway map in the HCC recurrent and unrecurrent groups（Differential analysis was based on the KEGG pathway database）

核苷酸切除修復(fù)主要包括DNA 剪切合成和連接兩個(gè)部分。在肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程中，主要通過(guò)減少PCNA、RCF4 和RCF5 蛋白表達(dá)降低DNA 聚合酶復(fù)合體ε 固定能力，并通過(guò)降低LIG1 影響連接酶功能。RPA、XPA、XPG 和轉(zhuǎn)錄因子TFⅡH 復(fù)合體的蛋白組分不受影響（圖8b）。

堿基剪切修復(fù)通路中影響腫瘤復(fù)發(fā)的作用可能是通過(guò)降低PCNA 和LIG1 蛋白表達(dá)影響長(zhǎng)補(bǔ)丁堿基剪切修復(fù)復(fù)合體（long patch Base excision repair，long patch BER）功能（圖8c）。短補(bǔ)丁堿基剪切修復(fù)復(fù)合體（short patch Base excision repair，short patch BER）功能不受影響。

真核生物錯(cuò)配修復(fù)通路中，肝癌復(fù)發(fā)組織中主要復(fù)合體中的DNA 錯(cuò)配修復(fù)蛋白MSH2 和MSH6 蛋白減少，DNA 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中三大復(fù)合體功能減弱，影響錯(cuò)配DNA 的正確剪切及連接，降低了錯(cuò)配DNA 修復(fù)能力（圖8d）。

2.8 肝癌復(fù)發(fā)進(jìn)程差異蛋白驗(yàn)證分析 結(jié)合log2FC（T/C）值和P值對(duì)上述差異蛋白進(jìn)行綜合分析后，篩選出對(duì)DNA 修復(fù)調(diào)節(jié)存在顯著差異（P＜0.01）的蛋白MCM5、MCM6、MCM7、RCF4、RCF5和MSH6進(jìn)行臨床樣本重新采集驗(yàn)證分析（每組10例）。結(jié)果表明復(fù)發(fā)組中除MCM6表現(xiàn)出下降趨勢(shì)外，MCM5、MCM7、RCF4、RCF5 和MSH6蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P值均＜0.001）（圖9）。

圖9 HCC復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組差異蛋白驗(yàn)證分析Figure 9 Differential protein validation analysis between HCC recurrence and unrecurrence groups

3 討論

HCC 復(fù)發(fā)與DNA 結(jié)構(gòu)/表達(dá)差異關(guān)系密切［7-8］，然而是何種原因?qū)е逻@一現(xiàn)象的發(fā)生卻鮮有報(bào)道。本研究基于TMT標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，就能夠?qū)е律鲜霈F(xiàn)象的調(diào)控通路進(jìn)行宏觀分析，以求精確定位到關(guān)鍵信號(hào)通路進(jìn)行重點(diǎn)剖析。

細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的破壞及遺傳信息的不穩(wěn)定性是腫瘤及腫瘤復(fù)發(fā)的重要誘因，由于其分子機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致缺乏有效的治療靶點(diǎn)和手段［9-10］。DNA 損傷應(yīng)答是保障基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵，能確保將遺傳信息準(zhǔn)確無(wú)誤地傳給子代細(xì)胞［11］。當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)，細(xì)胞啟動(dòng)一系列損傷監(jiān)控和修復(fù)機(jī)制，主要包括損傷信號(hào)激活和傳導(dǎo)［12］、損傷修復(fù)和基因轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過(guò)程［13］。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記定量分析技術(shù)對(duì)HCC 復(fù)發(fā)相關(guān)差異蛋白進(jìn)行檢測(cè)和注釋聚類分析，發(fā)現(xiàn)聚類分值最高且具有重要作用的是DNA 修復(fù)相關(guān)途徑，包括DNA 復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)通路。

該研究共發(fā)現(xiàn)DNA 修復(fù)相關(guān)差異蛋白12 個(gè)，在復(fù)發(fā)組中MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、PCNA、RFC4、RFC5、LIG1、MSH2 和MSH6 的蛋白表達(dá)量顯著降低。對(duì)DNA 修復(fù)相關(guān)蛋白進(jìn)行組織表達(dá)譜分析表明：正常肝細(xì)胞中上述蛋白的基因表達(dá)量均低于其他正常組織；肝癌細(xì)胞中的基因表達(dá)量均高于癌旁組織。Liu等［14］發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MSH 基因是HCC復(fù)發(fā)的高危因素；Marshall 等［15］和Liao 等［16］也證明MCM 基因的高表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。然而在本研究中復(fù)發(fā)組的MSH2等DNA 修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)顯著降低，通過(guò)HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明MCM2 等DNA 修復(fù)相關(guān)基因在腫瘤細(xì)胞中具有較高的基因表達(dá)量，但蛋白的表達(dá)量并不高［17］。說(shuō)明在DNA 修復(fù)相關(guān)基因的翻譯過(guò)程中還可能存在其他因素影響其蛋白翻譯。

分別對(duì)DNA復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)4 條通路進(jìn)行注釋和蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：（1）DNA 復(fù)制通路中主要是MCM 復(fù)合體和夾子裝置主要成分蛋白減少；（2）錯(cuò)配修復(fù)通路中主要是夾子裝置主要成分蛋白減少；（3）堿基切除修復(fù)通路中主要是BER 主要成分蛋白減少；（4）核苷酸切除修復(fù)通路中主要是MutS 同聚物主要蛋白減少。表明DNA 修復(fù)進(jìn)程中功能蛋白的顯著減少或缺失在HCC 復(fù)發(fā)進(jìn)程中具有至關(guān)重要的作用。然而其與HCC 復(fù)發(fā)的因果關(guān)系及其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

倫理學(xué)聲明：本研究方案經(jīng)由西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)為2023xjsxxm-3。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：常凱、王艷艷、劉媛、陳敏負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；江忠勇、孫巍、劉晨霞、那琬琳、許宏宣、謝靜參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；常凱、王艷艷、江忠勇、劉媛、陳敏負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。