張廣發(fā)， 蔡穎瑩， 林 龍， 付 蕾， 姚 凡， 王 萌， 張榮臻， 陳月橋， 黃良江， 王 涵， 蘇 運(yùn)，藍(lán)艷梅， 樂(lè)瀅玉， 毛德文， 姚 春

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院， 南寧 530200

2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院科研部， 南寧 530011

3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a. 肝病科， b. 脾胃科， c. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， d. 腫瘤科， 南寧 530023

肝性腦?。╤epatic encephalopathy，HE）是急慢性肝功能障礙的常見(jiàn)并發(fā)癥，以代謝紊亂和神經(jīng)精神異常為主要特征。其主要機(jī)制以氨中毒學(xué)說(shuō)為主導(dǎo)，與炎癥反應(yīng)損傷協(xié)同促進(jìn)HE 的發(fā)生發(fā)展。研究［1］表明，輕微型肝性腦?。╩inimal hepatic encephalopathy，MHE）的發(fā)病機(jī)制與HE 的發(fā)病機(jī)制無(wú)明顯差異，只是程度不同。炎癥中的炎性細(xì)胞因子和氨等有毒物質(zhì)破壞血腦屏障進(jìn)入腦組織，導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)改變及腦功能障礙［2］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通過(guò)經(jīng)活化后的蛋白激酶B（AKT）激活底物哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），起到調(diào)控下游細(xì)胞增殖和炎癥靶基因表達(dá)的作用［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)途徑，能夠抑制腦損傷后的神經(jīng)炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，發(fā)揮一定的腦組織保護(hù)作用。

大黃煎劑是中醫(yī)藥治療MHE 的經(jīng)驗(yàn)處方，臨床與科研應(yīng)用十余年，卓有成效。本團(tuán)隊(duì)研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，大黃煎劑保留灌腸后，可以顯著改善HE 患者的臨床癥狀，降低內(nèi)毒素水平，減少腸道細(xì)菌過(guò)度增長(zhǎng)，調(diào)整腸道菌群失衡，發(fā)揮顯著的保肝護(hù)腦的療效。近期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究［7］亦證實(shí)，PI3K/AKT 信號(hào)通路可能是大黃煎劑治療MHE 的作用靶點(diǎn)通路之一。綜上，本研究旨在探討大黃煎劑對(duì)MHE 大鼠模型學(xué)習(xí)認(rèn)知能力的影響及其“通腑開竅”理論的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)、雄性成年SD大鼠60只，6～8 周齡，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SYXK（湘）2019-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（桂）2019-0001。

按照完全隨機(jī)方法取6只大鼠作為空白組（CON組），剩余54只大鼠構(gòu)建慢性肝硬化模型，經(jīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試符合MHE癥狀大鼠40只，造模成功率為76.9%。將40 只大鼠采用完全隨機(jī)方法分為模型組（MOD 組）、乳果糖組（LT 組）、大黃煎劑低劑量組（RD1 組）、大黃煎劑中劑量組（RD2 組）及大黃煎劑高劑量組（RD3 組），每組8只。

1.2 主要藥品與試劑 大黃煎劑：醋大黃30 g，烏梅30 g（天江藥業(yè)有限公司提供，機(jī)配免煎顆粒），CCl4（麥克林，C13385752），ELISA試劑盒（武漢華美），ALT（X22039295）、AST（X23039296）、IL-1β（Z19031282）、IL-6（Z20031283）、TNF-α（X21039294）、ZOL（200 mL）RNA 提取通用（德國(guó)MACHEREY-NAGEL，740404），PI3K、AKT、mTOR mRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RIPA高效裂解液（索萊寶科技，HY-K0022），BCA 蛋白定量試劑盒（博士德生物，14J29C46），三鷹生物技術(shù)：PI3K（60225-1-Ig）、mTOR（66888-1-Ig），AKT（Cell Signaling，C67E7）。

1.3 儀器 圖像采集軟件Leica Application Suite V4（德國(guó)Leica 公司），Mastercycle Nexus PCR 循環(huán)儀（Eppendoff 公司），LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀（羅氏公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 慢性肝硬化大鼠模型的建立 本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［8］建立慢性肝硬化模型，將CCl4（分析純）、橄欖油按2∶3混合后于大鼠皮下注射（最初8次1.5 mL/kg，而后每次2 mL/kg），每隔3 d 注射1 次，持續(xù)12 周；CON 組注射等量生理鹽水。構(gòu)建慢性肝硬化模型的54 只大鼠在造模期間死亡2 只，余52 只大鼠中隨機(jī)取3 只用以觀察造模后大鼠肝功能和血氨水平是否顯著升高，肝組織是否符合慢性肝硬化病理改變，方法為尾靜脈采血0.25 mL，按照說(shuō)明書操作，離心15 min（2 000 r/min），提取血清，用ELISA 試劑盒檢測(cè)大鼠血清ALT、AST 水平；提取0.2 mL血漿，全自動(dòng)生化檢測(cè)儀快速檢測(cè)大鼠血氨水平；同時(shí)，取大鼠肝組織進(jìn)行HE染色。

1.4.2 MHE 判定 慢性肝硬化造模成功后結(jié)合Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果判定MHE，符合下列3 項(xiàng)條件則可認(rèn)為MHE 模型構(gòu)建成功：（1）慢性肝硬化大鼠模型的Morris水迷宮測(cè)試值大于CON組；（2）在整個(gè)實(shí)驗(yàn)造模過(guò)程中，大鼠未出現(xiàn)顯性肝性腦病癥狀，包括自主活動(dòng)減弱、反應(yīng)遲鈍、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、昏迷等；（3）血氨水平高于CON組。

1.4.3 干預(yù)方法 （1）CON 組和MOD 組：用生理鹽水保留灌腸，2 mL/只，1 次/d，持續(xù)10 d。（2）LT 組：用乳果糖按22.5%劑量保留灌腸，2 mL/只，1 次/d，持續(xù)10 d。（3）RD1 組、RD2 組、RD3 組：分別用大黃煎劑按2.5、5.0、7.5 g/kg 三種劑量保留灌腸，2 mL/只，1 次/d，持續(xù)10 d。

1.4.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.4.1 Morris水迷宮逃避潛伏期 所有大鼠治療10 d后，進(jìn)行Morris 水迷宮測(cè)試，分析大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。將水池分為1、2、3、4 共四個(gè)象限，分別讓大鼠面向缸壁入水，尋找并記錄爬上平臺(tái)時(shí)間（逃避潛伏期），取每一組次的平均值。

1.4.4.2 肝及腦組織HE 染色 肝、腦組織于4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行包埋、切片及染色。

1.4.4.3 ELISA 法檢測(cè)大鼠動(dòng)脈血的肝功能和炎性細(xì)胞因子的表達(dá) 按照說(shuō)明書操作，提取血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清ALT、AST、IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)水平。

1.4.4.4 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)大鼠腦組織PI3K、AKT 及mTOR 的mRNA 表達(dá) 取20～30 mg 腦組織，加入400 μL 裂解液研磨2 min 后，再加入600 μL裂解液。4 ℃冰箱放置15 min，常溫離心機(jī)瞬離10 s，加入200 mL 氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min。離心（4 ℃，12 000×g，15 min），吸取上水相0.45～0.50 mL。加入異丙醇0.5 mL，顛倒混勻，離心后的沉淀物即為RNA。加入1 mL 的75%乙醇溶液，混勻后離心（4 ℃，12 000×g，10 min），得到白色黏附物。加入75%的乙醇980 μL 洗滌3次，晾干加入50 μL無(wú)酶水，混勻后備用。

按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（SYBR Green qPCR法），配置qPCR 反應(yīng)體系，隨后置入LightCycler?480Ⅱ儀器中進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)qPCR 的溶解曲線和擴(kuò)增曲線，進(jìn)行定量、作RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線等。其中，目的基因的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果。以β-actin 作為內(nèi)參，檢測(cè)腦組織PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.4.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)大鼠腦組織PI3K、AKT 及mTOR 的蛋白表達(dá) 取30 mg 腦組織，加入200 μL RIPA高效裂解液提取組織蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。后續(xù)電泳上樣體積為5 μL，蛋白量為30 μg。使用快速凝膠試劑盒配制7.5%電泳凝膠，將樣本轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST洗膜及封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜［抗體稀釋比例：β-actin（1∶800），PI3K（1∶2 000），AKT（1∶1 000），mTOR（1∶4 000）］。TBST洗膜，加入對(duì)應(yīng)的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜，加入ECL 顯影液避光反應(yīng)5 min，顯影后計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Graphpad Prism 7.0 軟件進(jìn)行繪圖。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能和血氨水平比較 與CON 組相比，MOD 組大鼠ALT、AST 和血氨水平均顯著升高（P值均＜0.01）；與MOD 組相比，各治療組大鼠ALT、AST及血氨水平均明顯降低（P值均＜0.01）。此外，RD3組大鼠的AST水平顯著低于RD1組（P＜0.01）（圖1）。

圖1 各組大鼠肝功能和血氨水平比較Figure 1 Comparison of liver function and blood ammonia levels among groups of rats

2.2 Morris 水迷宮測(cè)試結(jié)果 與CON 組相比，MOD 組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間顯著增加（P＜0.01）；與MOD 組相比，各治療組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均明顯減少（P值均＜0.01）。此外，LT 組和RD3 組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間顯著少于RD1組（P值均＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠藥物干預(yù)后的逃避潛伏期比較Figure 2 Comparison of escape latency after drug intervention in each group of rats

2.3 肝組織及腦組織病理觀察

2.3.1 肝組織病理 與CON 組相比，MOD 組大鼠肝組織病理?yè)p傷嚴(yán)重，可見(jiàn)多個(gè)完整的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞大面積變性壞死，結(jié)構(gòu)排列紊亂，細(xì)胞核深染，肝索排列不規(guī)整，肝竇擴(kuò)張明顯，伴有出血和大量纖維組織增生，假小葉形成。與MOD 組相比，各治療組大鼠的肝組織病理?yè)p傷得到改善，小部分肝細(xì)胞變性壞死，結(jié)構(gòu)排列紊亂減少，細(xì)胞核染色較淺，肝索排列稍不規(guī)整，肝竇擴(kuò)張及出血癥狀減輕或消失，可見(jiàn)少量纖維組織，其中以LT組和RD3組效果較好（圖3）。

圖3 光鏡下各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果（×200）Figure 3 Light microscopy results of HE staining of rat liver tissue in each group （×200）

2.3.2 腦組織病理 與CON 組相比，MOD 組大鼠腦皮質(zhì)與海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，排列稀疏，形狀、大小不規(guī)則，數(shù)量減少，染色淺，可見(jiàn)較多的神經(jīng)元變性和核固縮，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與MOD 組相比，各治療組大鼠的腦皮質(zhì)與海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)元改變較輕，形態(tài)排列較規(guī)則緊密，細(xì)胞略微腫脹，形狀與大小稍不規(guī)則，數(shù)量較少，染色較深，可見(jiàn)少量的神經(jīng)元變性、核固縮及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以LT組和RD3組效果較好（圖4）。

圖4 光鏡下各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果（×200）Figure 4 Light microscopy results of HE staining of rat brain tissue in each group （×200）

2.4 各組大鼠血清炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 與CON組相比，MOD組大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)均明顯升高（P值均＜0.01）；與MOD 組相比，各治療組大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)均顯著降低（P值均＜0.01）。此外，與RD1 組相比，LT組的TNF-α水平、RD2組的IL-1β水平以及RD3組的IL-1β和IL-6水平均明顯降低（P值均＜0.05）（圖5）。

圖5 各組大鼠相關(guān)炎性細(xì)胞因子水平比較Figure 5 Comparison of levels of relevant inflammatory cytokines among groups of rats

2.5 各組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的mRNA 表達(dá)水平比較 與CON 組相比，MOD 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)量均顯著升高（P值均＜0.01）；與MOD 組相比，各治療組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR的mRNA 表達(dá)量均顯著降低（P值均＜0.05）。此外，LT組、RD2 組和RD3 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的mRNA 表達(dá)量均明顯低于RD1組（P值均＜0.05）；RD3組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)量明顯低于RD2組（P值均＜0.05）（圖6）。

圖6 各組大鼠腦組織中PI3K、AKT、mTOR的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Figure 6 Relative mRNA expression of PI3K， AKT and mTOR in the brain tissue of rats in each group

2.6 各組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 蛋白表達(dá)水平比較 與CON 組相比，MOD 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR的蛋白表達(dá)量均顯著升高（P值均＜0.01）；與MOD組相比，各治療組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表達(dá)量均顯著降低（P值均＜0.01）。此外，LT 組、RD2 組和RD3 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表達(dá)量均明顯低于RD1 組（P值均＜0.01）；LT 組、RD3 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表達(dá)量均顯著低于RD2組（P值均＜0.05）（圖7）。

圖7 各組大鼠腦組織中PI3K、AKT、mTOR的蛋白免疫印跡結(jié)果及蛋白表達(dá)量比較Figure 7 Comparison of protein expression of PI3K， AKT，and mTOR in brain tissues of rats from various groups

3 討論

有研究［9］通過(guò)正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HE 患者腦部相關(guān)區(qū)域的膠質(zhì)細(xì)胞11C-PK11195和18F-DPA-714 結(jié)合顯著增加，這為HE 存在腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)提供了直接的影像學(xué)證據(jù)。神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)持續(xù)存在誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，影響神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，造成星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫/腦水腫等腦神經(jīng)病理改變，這與HE的臨床特征性癥狀重疊［10］。因此，深入研究腦神經(jīng)炎癥出現(xiàn)的原因及其誘發(fā)MHE 的機(jī)制，將為慢性肝硬化并發(fā)MHE的防治提供新的思路及手段。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)并無(wú)與HE 相對(duì)應(yīng)的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬“肝厥”“神昏”等范疇。此病的核心病機(jī)是腑氣不通，蒙蔽神竅，治法多用通腑開竅，方選大黃煎劑［5］。大黃煎劑由醋大黃和烏梅兩味中藥組成，方中醋大黃善瀉下涼血、清熱解毒，烏梅有澀腸生津止渴之效。二者共奏酸苦涌泄之妙，蕩滌腸胃，逐邪外出，增加腦氧供應(yīng)，以達(dá)到通腑開竅之效［6］。

本研究結(jié)果顯示，大黃煎劑改善MHE 大鼠肝功能主要表現(xiàn)在：與模型組比較，大黃煎劑低、中、高劑量組大鼠肝臟中肝細(xì)胞變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織增生程度均得到不同程度改善，ALT、AST 水平均顯著降低。大黃煎劑改善MHE 大鼠腦功能表現(xiàn)在：與模型組比較，大黃煎劑低、中、高劑量組大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期時(shí)間均明顯縮短，血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，這可能與大黃化學(xué)成分及單體化合物具有顯著的抗神經(jīng)炎癥，穿透血腦屏障發(fā)揮抗炎功能，減輕炎癥反應(yīng)，抑制白三烯B4，減少炎性因子IL-6、TNF-α的釋放，下調(diào)血小板激活因子，抑制白細(xì)胞、促炎因子基因的甲基化等有關(guān)［11-13］。腦組織病理結(jié)果顯示，大黃煎劑低、中、高劑量腦神經(jīng)元形態(tài)排列紊亂、腫脹壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，且腦組織相關(guān)PI3K/AKT/mTOR 炎癥通路的mRNA 與蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型組，以大黃煎劑高劑量組效果最佳。有研究［14-15］表明，多種藥物可激活PI3K/AKT/mTOR 通路以減輕相關(guān)疾病的神經(jīng)炎癥。類似的，本研究結(jié)果表明，大黃煎劑可能激活PI3K/AKT/mTOR 通路，抑制MHE 大鼠腦組織炎癥，有效改善腦組織炎性損傷。

綜上，大黃煎劑可以降低MHE 大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，改善MHE的神經(jīng)精神癥狀，這些保護(hù)作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而減少炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 合成及釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)。大黃煎劑是含有多種有效成分的中藥復(fù)方，未來(lái)筆者團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)探究并篩選出復(fù)方中治療MHE的主要有效成分。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022年4月10日經(jīng)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：DW20220410-133，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張廣發(fā)負(fù)責(zé)擬定寫作思路，撰寫文章；蔡穎瑩、林龍負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架；付蕾、姚凡、王萌負(fù)責(zé)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)技術(shù)；張榮臻、陳月橋負(fù)責(zé)推進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和實(shí)驗(yàn)質(zhì)量；黃良江、王涵、蘇運(yùn)負(fù)責(zé)構(gòu)造動(dòng)物模型；藍(lán)艷梅、樂(lè)瀅玉負(fù)責(zé)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。姚春、毛德文負(fù)責(zé)研究選題，指導(dǎo)文章撰寫和修改。