陳小燕， 袁乙富， 杜晟楠， 曹 勤， 蔣元燁

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院消化內(nèi)科， 上海 200062

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）目前已成為一種常見的慢性肝病，被認為是一種以脂質(zhì)儲存和代謝紊亂為特征的疾病。NAFLD與肥胖密切相關(guān)，超過60%的肥胖人群患有NAFLD，而在非肥胖人群中，NAFLD 的患病率則較低。研究［1］表明，肥胖是NAFLD 的獨立危險因素，與正常體質(zhì)量相比，肥胖導(dǎo)致NAFLD 的發(fā)生風(fēng)險增加3.5 倍，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）與NAFLD 風(fēng)險之間存在明顯的劑量依賴關(guān)系。此外，肥胖還會加速NAFLD 的發(fā)展，使其更容易進展為肝纖維化、肝硬化和肝癌等嚴重肝病。肥胖和NAFLD 之間的關(guān)系是相互作用的。肥胖患者往往伴隨胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，這些因素都可以促進NAFLD 的發(fā)展。而NAFLD 患者中，脂肪酸（FA）釋放增加，肝臟中的脂質(zhì)代謝失調(diào)，以上因素也會進一步加重肥胖的發(fā)展［2］。但是，對于單純超重的肥胖患者，其血糖、血壓及血脂等代謝功能早期可能并無明顯異常［3］。因此，超重NAFLD 患者的臨床特征及脂質(zhì)代謝差異需進一步研究與探討。

脂質(zhì)組學(xué)是代謝組學(xué)研究的一個新的分支，是指對生物樣本中脂質(zhì)分子進行系統(tǒng)性和全面性分析的一種技術(shù)。脂質(zhì)不僅是人體中的能量供給和儲存來源，也是構(gòu)成細胞生物膜的成分，參與許多重要的代謝過程，脂質(zhì)代謝途徑的改變在許多疾病的機制研究，以及預(yù)后、診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用。近年來，基于高通量質(zhì)譜技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為研究NAFLD 的一種重要方法，通過定量和定性分析細胞、體液、組織中多種脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，例如FA、甘油三酯（TG）、磷脂、膽固醇等，可以更好地理解超重NAFLD 患者的發(fā)病機制，并尋找新的治療方法［4-6］。

1 資料與方法

1.1 研究對象 依據(jù)亞太地區(qū)的BMI 劃分標(biāo)準(zhǔn)［7］，將BMI＞23 kg/m2定義為超重人群。選取2020 年8 月—2021年4月本院住院部及體檢中心經(jīng)超聲診斷為NAFLD且BMI＞23 kg/m2的患者作為超重NAFLD 組；另選擇同期健康體檢者中BMI＞23 kg/m2人群作為超重對照組。NAFLD 患者均符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018年更新版）》［8］的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲；臨床信息完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有過量飲酒史或飲酒問卷數(shù)據(jù)缺失者；先天性肝臟疾病、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷和酒精性肝病；（2）合并肝外纖維化疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕類疾病、腎衰竭、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、高血壓病、冠心病等；（3）合并心腦血管、泌尿系統(tǒng)、腎臟、造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾?。唬?）合并甲狀腺疾病，包括甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退、亞臨床甲狀腺功能減退、橋本甲狀腺炎；（5）惡性腫瘤、其他嚴重合并癥或精神病；（6）孕婦及哺乳期者。

1.2 臨床資料收集 所有受試者均完成基本資料/病史資料收集、人體參數(shù)測量、血液生化指標(biāo)檢查、肝臟超聲檢查。計算受試者BMI；采集受試者晨間空腹靜脈血樣本，進行血常規(guī)、肝腎功能、空腹血糖、血脂等實驗室生化指標(biāo)檢測，分析儀器為Hitachi 7600d-210 全自動生化分析儀。

1.3 儀器與試劑 UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；Orbitrap Elite 靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；冷凍高速離心機（1730R，德國GENE公司）。甲醇（色譜純，美國Merck公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma 公司）；其余試劑均為分析純。

1.4 血清脂質(zhì)組學(xué)樣本的前處理 采集受試者晨間空腹靜脈血樣本，采血后立即放入4 ℃條件下靜置2 h，于1 000×g（離心半徑7 cm）、4 ℃條件下離心15 min，取上清液分裝后保存于-80 ℃冰箱凍存待測。脂質(zhì)組學(xué)分析前，取冷凍血清60 μL，加入1 000 μL 甲基叔丁基醚、300 μL甲醇和290 μL 超純水，振蕩混勻1 min，于1 000×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清溶液置于新離心管中冷凍干燥；干燥后的樣本中加入100 μL異丙醇-甲醇（體積比1∶1），待樣本復(fù)溶后在10 000×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液80 μL采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）進行分析。

1.5 UPLC-MS/MS 分析 應(yīng)用超高效液相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀。液相分離使用ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）液相色譜柱（美國Waters公司）。流動相A 為體積比60∶40的乙腈-水溶液（含有10 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）；流動相B 為體積比50∶50 的乙腈-異丙醇溶液（含有10 mmol/L 乙酸銨和0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫45 ℃。梯度洗脫程序如下：0 min，30%流動相B；0～2.0 min，30%～43%流動相B；2.0～2.1 min，43%～55%流動相B；2.1～12.0 min，55%～65%流動相B；12.0～18.0 min，65%～85%流動相B；18.0～20.0 min，85%～100%流動相B；20.0～25.0 min，100%流動相B；25.0～25.1 min，100%～30%流動相B；25.1～30.0 min，30%流動相B。

質(zhì)譜條件：離子源采用電噴霧離子源（ESI），質(zhì)量分析器為靜電場軌道阱。分別在ESI正/負離子模式下采集數(shù)據(jù)，掃描范圍為質(zhì)荷比50～1 000。正離子模式下，電噴霧電壓為3.0 kV，毛細管溫度為350 ℃，S-Lens RF Level設(shè)置為30%，鞘氣壓力為45 psi，輔助氣流速為5 L/min，尾氣流速為0.3 L/min。負離子模式下，電噴霧電壓為3.2 kV，毛細管溫度為350 ℃，S-Lens RF Level 設(shè)置為60%，鞘氣壓力為45 psi，輔助氣流速5 L/min，尾氣流速為0.3 L/min。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

用于脂質(zhì)組學(xué)分析的LC-MS原始數(shù)據(jù)，通過Xcalibur軟件進行采集并進行預(yù)處理，包括峰提取、峰對齊、保留時間校正、峰面積校正，隨后采用LipidSearch 軟件鑒定脂質(zhì)代謝產(chǎn)物。將鑒定的脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-P 14.0 軟件進行多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）。通過PCA 可以直觀地表現(xiàn)出兩組之間的差異大小并檢查是否存在異常點。脂質(zhì)成分的組間比較采用GraphPad Prism 9.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 超重NAFLD 組與超重對照組臨床資料及生化指標(biāo)比較 共納入超重NAFLD 患者62 例（超重NAFLD組），超重健康體檢者50 例（超重對照組）。兩組一般資料及血液生化指標(biāo)比較結(jié)果顯示，年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、RBC、Hb、Hct、尿酸、ALP、TP、Glb、GGT、ChE、ALT、AST、LDL、TC、TG、ApoB、Glu 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）（表1）。

表1 超重NAFLD組與超重對照組一般資料及血液生化指標(biāo)比較Table 1 Comparison of general data and blood biochemical indexes between NAFLD group and healthy control group in overweight people

2.2 脂質(zhì)組學(xué)多元統(tǒng)計分析 將超重NAFLD 組和超重對照組的血清脂質(zhì)數(shù)據(jù)進行PCA，得到基于正離子模式和負離子模式下的脂質(zhì)PCA 圖（圖1a、b），結(jié)果顯示兩組之間存在良好的分離，說明超重人群中，NAFLD 患者的脂質(zhì)譜與健康人相比有明顯差異，提示PCA 多元統(tǒng)計擬合模型可靠性良好。

盡管PCA 法可以有效提取主要信息，但兩組間的變量差異仍欠明晰。因此，為了探究超重NAFLD組與超重對照組之間具有差異性的主要代謝物，進一步選用有監(jiān)督模式的OPLS-DA 模型進行擬合。得出的第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）可量化每個化合物貢獻的大小。選擇VIP 值＞1 的變量，并將所選的變量進行Student’st檢驗（P＜0.05），同時滿足P＜0.05且VIP值＞1的變量即為與NAFLD疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物（圖1c、d）。

2.3 NAFLD 患者的血清脂質(zhì)變化 基于高分辨質(zhì)譜的血清脂質(zhì)檢測與多元統(tǒng)計分析，共鑒定出兩組之間的差異脂質(zhì)有493個（P＜0.05），可被歸納為12種類別；其中在超重NAFLD 組中顯著上調(diào)的脂質(zhì)有143 個，顯著下調(diào)的有350 個。這些差異脂質(zhì)中，兩組間差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.5的脂質(zhì)有412個，主要包括：PC 49個、TG 111個、SM 19個、LPC 11個、DG 7個（圖2）。圖3展示了所有鑒定到的脂質(zhì)在兩組之間的差異倍數(shù)及P值情況。

圖2 兩組中各類脂質(zhì)含量的比較Figure 2 Comparison of the contents of lipids between the two groups

圖3 超重NAFLD組與超重對照組差異脂質(zhì)的火山圖Figure 3 Volcanic diagram of lipids in overweight NAFLD group and overweight control group

為了比較兩組之間血清脂質(zhì)類別的差異情況，本研究對脂質(zhì)組學(xué)鑒定到的這12 類差異脂質(zhì)總體含量進行了分析。結(jié)果顯示，超重NAFLD 組的總體Cer、PC、PE、PG、PI、PS、LPC、LPE、SM、FA 和DG 類脂質(zhì)與超重對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01），而總體TG含量在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。此12類脂質(zhì)中，F(xiàn)A、LPE 和SM 的總量在超重NAFLD 組上調(diào)，其中超重NAFLD 組的平均FA 總量是超重對照組的3.6倍。

圖4 超重NAFLD組與超重對照組血清脂質(zhì)類別的比較Figure 4 Comparison of serum lipids between overweight NAFLD group and overweight control group

TG以飽和鍵數(shù)3為界，＞3為多不飽和型。比較兩組間血清中不同不飽和鍵數(shù)的TG 含量，結(jié)果顯示，與超重對照組相比，超重NAFLD 組不飽和鍵數(shù)＞3 的TG 含量降低，而不飽和鍵數(shù)≤3的TG含量增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.001）（圖5）。

圖5 超重NAFLD組與超重對照組血清TG水平比較Figure 5 Comparison of serum triglycerides between overweight NAFLD group and overweight control group

3 討論

NAFLD 與肥胖密切相關(guān)。肥胖是NAFLD 最常見的危險因素之一，脂肪組織作為胰島素的靶組織之一，可直接或間接影響胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，肥胖人群的脂肪組織通過分泌多種脂肪因子、促炎因子以及招募促炎免疫細胞的浸潤等多種途徑介導(dǎo)代謝性炎癥的發(fā)生，從而引起β細胞損傷及胰島素抵抗，同時，高胰島素血癥也會促進肝臟中FA的新生合成。這些FA和膳食中的游離脂肪酸會被β-氧化或甘油酯化形成TG，然后被儲存在肝細胞中形成脂質(zhì)滴或被包裝成極低密度脂蛋白輸出。因此，飲食過量和胰島素抵抗被認為是導(dǎo)致NAFLD肝脂肪積累的主要原因。

本研究中，雖然NAFLD患者與健康參與者均屬于超重人群（BMI＞23 kg/m2），但NAFLD 組的BMI 仍高于超重對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，NAFLD組患者的ALT、AST 水平較超重對照組顯著升高，提示NAFLD 患者有不同程度的肝損傷。原因是當(dāng)脂肪在肝內(nèi)堆積過多時，會損害肝細胞功能，導(dǎo)致肝細胞內(nèi)的ALT、AST 溢出細胞外，使外周血液中ALT、AST 水平升高。此外，超重NAFLD 組的RBC、Hb、Hct 顯著升高，而較高的RBC、Hb、Hct 被認為與胰島素抵抗及代謝綜合征相關(guān)，有研究［9-11］顯示RBC、Hb、Hct 水平與NAFLD 呈正相關(guān)。

此外，與超重對照組相比，NAFLD 患者的尿酸水平顯著升高。研究［12］表明，NAFLD 患者的尿酸水平通常較高，尤其是在肥胖、高血壓、糖尿病等代謝綜合征患者中更為明顯。這可能是由于NAFLD 導(dǎo)致肝功能異常，使得尿酸代謝能力下降，從而造成尿酸水平升高。還有研究［13］指出，在肥胖的NAFLD 患者中，合并高尿酸血癥者發(fā)生嚴重肝脂肪變性的概率較高，而在非肥胖人群中卻沒有相似現(xiàn)象。高尿酸也可導(dǎo)致胰島素抵抗，激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，加劇線粒體氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致NAFLD 的發(fā)生。Glu 升高與胰島素抵抗直接相關(guān)，TC、TG、LDL 增高與肝脂肪沉積有關(guān)，也增加了肝臟的胰島素抵抗［14］。本研究中，超重NAFLD 組Glu、TC、TG、LDL顯著高于超重對照組，同樣提示了胰島素抵抗可能是超重NAFLD患者與超重健康人群之間的重要差異。

脂質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，與超重對照組相比，大多數(shù)鑒定出的脂質(zhì)在超重NAFLD 患者中下調(diào)，但是FA 在NAFLD組顯著增高。有研究［15］表明，NAFLD 與胰島素抵抗有關(guān)，在胰島素抵抗的情況下，脂肪組織對胰島素的抗脂解作用產(chǎn)生抵抗力，F(xiàn)A 的釋放增加。胰島素抵抗伴隨著胰島素水平升高，在脂肪分解增加和/或脂肪攝入增加的情況下，均會促進肝臟TG 合成。亦有研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A水平與BMI呈正相關(guān)，這可能是因為BMI反映了體內(nèi)脂肪組織的含量，而脂肪組織是FA 的主要來源。同時，F(xiàn)A 水平的升高可能加重肝脂肪沉積、氧化應(yīng)激和纖維化，從而促進NAFLD的進展［18］。

TG 是一種脂類物質(zhì)，在基本的細胞生命活動中發(fā)揮重要作用。高水平的血清TG 與代謝紊亂和心血管疾病有關(guān)。有研究［19］指出，NAFLD 在TG ?；溄M成上的差異遵循一種模式，即NAFLD 中短鏈和飽和脂肪酰基含量較高，而含多不飽和脂肪酸的TG 含量較低。另有部分脂質(zhì)組學(xué)研究［20-22］表明，脂肪變性受試者血漿中的TG 和DG 增加。這可能與FA 從脂肪變性的肝臟中自噬釋放增多，或上調(diào)的新生脂肪合成增多有關(guān)，進而導(dǎo)致極低密度脂蛋白分泌增多。

盡管本研究中觀察到超重NAFLD的TG種類有增加的趨勢，但與超重對照組相比并沒有顯著差異，這可能是因為測試了大量的TG種類，導(dǎo)致數(shù)據(jù)冗余而沒有進一步分組劃分研究所致。故本研究進一步將TG 按照不飽和鍵數(shù)＞3 和≤3 劃分，結(jié)果顯示兩組之間有顯著差異，即NAFLD 患者的TG 中飽和脂肪?；枯^高，而含多不飽和脂肪酸的TG 較低。這可能是由于高胰島素水平驅(qū)動從頭脂肪生成，導(dǎo)致產(chǎn)生飽和脂肪酸。細胞將飽和脂肪酸儲存為TG 的能力達到極限，造成了這種血液中TG組成的變化。此外，單不飽和脂肪酸的產(chǎn)生由甾酰輔酶A（CoA）去飽和酶的活性驅(qū)動，該酶依賴于SREBP-1 蛋白。以往有研究［23］表明，由于高胰島素血癥，NAFLD 中的甾醇CoA去飽和酶和SREBP-1激活增加。

綜上所述，本研究納入的超重NAFLD 組患者雖多項臨床生化指標(biāo)處于正常區(qū)間，但是與超重健康人群相比，NAFLD 患者中許多與代謝綜合征、胰島素抵抗及肝功能損傷相關(guān)的生化指標(biāo)仍顯著升高，提示NAFLD 患者除脂肪肝這一病理性表現(xiàn)之外，還有潛在的其他代謝綜合征的風(fēng)險。脂質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示超重NAFLD 患者與超重對照組相比較，血液內(nèi)FA 明顯升高；TG 中的含飽和脂肪鏈的種類顯著升高，而含多不飽和脂肪酸的種類則較低。本研究提示，與健康的超重人群相比，NAFLD患者存在胰島素抵抗的情況。以上結(jié)果不僅有助于進一步認識超重人群中NAFLD 的發(fā)病機制，也為超重人群特異性的預(yù)防、監(jiān)測以及治療NAFLD提供了見解。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2020 年7 月16 日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會審批，批號：PTECA-2020-29-1。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：陳小燕負責(zé)撰寫論文；袁乙富、杜晟楠負責(zé)數(shù)據(jù)收集及處理；曹勤、蔣元燁負責(zé)擬定寫作思路并最后定稿。