甘建玲 朱藝藝 劉旺 丁芳騏

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（motor neuron survival gene 1，SMN1）缺陷導(dǎo)致的一種罕見神經(jīng)肌肉疾病，主要特征是脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化，患者主要癥狀為進(jìn)行性肌無力和肌萎縮，主要累及軀干和近端肢體（大臂、上臂），并由此產(chǎn)生全身多系統(tǒng)功能受損。SMA 為常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率為1/10 000～1/6 000［1］，攜帶者頻率為1/50～1/40，在兒童致死性常染色體遺傳疾病中位于第二位［2］，具有發(fā)病年齡早，進(jìn)展快，死亡率高的特點(diǎn)。

指南表示88%～95%的中國(guó)SMA 患者是由攜帶SMN1基因第7 外顯子純合缺失導(dǎo)致，其中大部分同時(shí)合并第8 外顯子的缺失，極少部分為SMN1第7外顯子雜合缺失合并SMN1基因雜合性點(diǎn)突變或其他變異導(dǎo)致［3］，因此在SMA 攜帶者篩查中首選檢測(cè)SMN1基因E7 缺失情況，但也有文獻(xiàn)報(bào)道少量SMA 患者僅存在SMN1基因E8 純合缺失［4-6］，為此本研究對(duì)SMN1基因E7、E8 缺失情況進(jìn)行檢測(cè)，完善檢測(cè)機(jī)制。SMA 患兒的出生給家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和精神壓力，但SMA 致病基因明確，攜帶率高，可以通過產(chǎn)前篩查的方式來預(yù)防SMA 患兒的出生，減輕家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)，因此，本研究對(duì)萍鄉(xiāng)地區(qū)1 241 例孕婦進(jìn)行SMN1基因篩查，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供參考證據(jù)，并對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行介入性產(chǎn)前基因診斷，有效避免SMA 患兒的出生。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2022 年3 月至2023 年2 月在萍鄉(xiāng)市婦幼保健院醫(yī)學(xué)優(yōu)生門診就診的孕婦為研究對(duì)象，進(jìn)行SMA 攜帶者篩查，共1 241 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡16～47 歲，孕周＜22 周，均無SMA 表型生育史和家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：有過SMA 生育史及家族史的孕婦。本研究經(jīng)受檢者和醫(yī)院倫理委員會(huì)同意和批準(zhǔn)（L20220507）。

1.2 方法

1.2.1 攜帶者篩查流程

依據(jù)產(chǎn)前檢查孕婦意愿對(duì)孕婦進(jìn)行SMN1基因E7、E8 外顯子進(jìn)行檢測(cè)，若為攜帶者，則對(duì)其配偶進(jìn)行SMN1基因檢測(cè)，若雙方都為攜帶者，胎兒依據(jù)夫妻雙方意愿進(jìn)行胎兒SMA 產(chǎn)前診斷，篩查僅限于SMN1基因E7、E8 外顯子的缺失情況。

1.2.2 樣本采集

對(duì)接受攜帶者篩查的孕婦采集外周靜脈血2～3 mL，收集于EDTA 抗凝管；對(duì)進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦抽取羊水10 mL 同時(shí)采集母體外周血。

1.2.3 DNA 提取

外周血采用西安天隆科技有限公司的全血提取試劑（SMA?磁珠法）及GeneRotex 96 全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.4 基因檢測(cè)方法

1.2.4.1 孕婦攜帶者篩查 采用PCR?熔解法對(duì)SMN1基因E7、E8 外顯子的拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)，該方法基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)合了競(jìng)爭(zhēng)性PCR、飽和熒光染料、熔解曲線分析技術(shù)，具有高特異性，高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)［7］。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照西安天隆科技有限公司人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4.2 高風(fēng)險(xiǎn)胎兒產(chǎn)前診斷 在知情同意選擇和遺傳咨詢的基礎(chǔ)上，行羊水穿刺，進(jìn)行SMN1產(chǎn)前檢測(cè)。產(chǎn)前診斷羊水與母體外周血樣本進(jìn)行QF?PCR 分析短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）位點(diǎn)比對(duì)，排除母源污染之后，用多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation?dependent probe am?plification，MLPA）方法檢測(cè)SMN1基因，由湖南家輝遺傳專科醫(yī)院完成，實(shí)驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)［8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

攜帶率采用SMN1基因E7 雜合缺失突變數(shù)/篩查總數(shù)得出，STR 結(jié)果使用GeneMapper5.0 軟件進(jìn)行分析，MLPA 結(jié)果采用Coffalyser 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 篩查結(jié)果

在1 241 例孕婦中，SMN1基因E7 正常型1 225 例，其中E7、E8 正常型1 218 例，單純E8雜合缺失7 例，檢出SMN1基因E7 雜合缺失突變16 例，其中E7、E8 同時(shí)雜合缺失15 例，單純E7 雜合缺失1 例，攜帶率為1.29%（16/1241）。見表1。

2.2 產(chǎn)前診斷結(jié)果

對(duì)上述16 名攜帶者孕婦配偶進(jìn)行告知并進(jìn)行基因檢測(cè)，同意做基因檢測(cè)的有14 名，發(fā)現(xiàn)配偶同為SMN1基因E7 雜合缺失突變者1 例，QF?PCR 分析STR 位點(diǎn)比對(duì)結(jié)果顯示所檢測(cè)的樣本無母源細(xì)胞污染。見圖1。最終確認(rèn)該胎兒SMN1基因E7、E8 純合缺失，為SMA 患兒。見圖2。實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)夫妻雙方基因復(fù)檢。見圖3、4。

圖1 胎兒羊水與母體外周血樣本STR 比對(duì)Figure 1 Comparison of STR between fetal amniotic fluid and maternal peripheral blood samples

圖2 胎兒SMN1 基因E7、E8 拷貝數(shù)Figure 2 Copy numbers of E7 and E8 of the SMN1 gene in the fetal

圖3 母親SMN1 基因E7、E8 拷貝數(shù)Figure 3 Copy numbers of E7 and E8 of the SMN1 gene in the mother

圖4 父親SMN1 基因E7、E8 拷貝數(shù)Figure 4 Copy numbers of E7 and E8 of the SMN1 gene in the father

3 討論

SMA 是一種導(dǎo)致嬰幼兒死亡的最常見常染色隱性遺傳疾病之一，人群攜帶率高，致病基因明確，通過產(chǎn)前診斷的方式可以有效避免SMA 患兒的出生，因此具有進(jìn)行攜帶者篩查的可行性。目前臨床上有效治療該病的藥物有限，在中國(guó)上市的藥物僅有諾西那生鈉注射液和利司撲蘭，價(jià)格昂貴且需要終身治療，并且對(duì)于SMA 患兒來說，還需要多學(xué)科的管理以提高生活質(zhì)量，減輕疾病帶來的負(fù)面影響［9］，因此對(duì)孕婦進(jìn)行SMN1基因突變篩查和對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷顯得尤其重要。

研究表明［10］，基于高分辨率熔解曲線實(shí)時(shí)PCR 的方法是一種靈敏、高通量、低成本、低人工的方法，適用于大規(guī)模的SMA 攜帶者篩查。但要注意的是該方法學(xué)存在一定的技術(shù)局限性，基于目前的技術(shù)，只能檢查較常見的“1+0”型攜帶者，對(duì)于少見的“2+0”“1+1d”和“2+1d”型攜帶者無法檢測(cè)出，存在一定的殘余風(fēng)險(xiǎn)，因此在篩查咨詢及產(chǎn)前診斷要全面告知?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)的存在。

本研究采用PCR?溶解曲線法對(duì)萍鄉(xiāng)地區(qū)1 241例孕婦進(jìn)行SMN1基因篩查，共檢出SMN1基因E7雜合缺失者16 例，顯示攜帶率為1.29%。由于SMA為常染色隱性遺傳性疾病，同為攜帶者夫婦生育SMA 患兒的概率為25%，因此對(duì)16 例攜帶者的配偶進(jìn)行基因檢測(cè)和遺傳咨詢，丈夫同為攜帶者1 例，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒行產(chǎn)前診斷，排除胎兒標(biāo)本中的母體細(xì)胞污染是保證產(chǎn)前診斷結(jié)果準(zhǔn)確性的重要保證［11］，因此檢測(cè)時(shí)首先對(duì)母體外周血樣本和羊水樣本進(jìn)行QF?PCR 分析STR 位點(diǎn)比對(duì)，確定沒有母源細(xì)胞污染后，再用MLPA 的方法對(duì)SMN1E7、E8 進(jìn)行拷貝數(shù)定量，最終發(fā)現(xiàn)該胎兒是SMN1基因E7 純合缺失者，診斷為SMA 患病胎兒，經(jīng)遺傳咨詢建議終止妊娠，該夫婦選擇引產(chǎn)，避免了SMA患兒的出生。

基于目前的指南及專家共識(shí)，臨床診斷以SMN1基因E7 拷貝數(shù)為依據(jù)，其中SMN1基因7 號(hào)外顯子與8 號(hào)外顯子在絕大多數(shù)人群中基因拷貝數(shù)一致，但也有少部分群體二者拷貝數(shù)存在不一致的情況，所以，SMN1基因E8 的檢測(cè)可有效作為E7檢測(cè)結(jié)果的內(nèi)參，提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，若出現(xiàn)不一致的情況，考慮做復(fù)檢進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果準(zhǔn)確性。另外，有少量SMA 患者僅存在第8 外顯子純合缺失的報(bào)道，但樣本數(shù)量太少，目前的研究還未能完全佐證是8 外顯子缺失致病還是存在其他變異情況，所以若出現(xiàn)E7 非0，E8 為0 的情況，要考慮E7 是否存在微小變異，以進(jìn)一步降低患兒發(fā)生概率。因此SMN1基因E8 檢測(cè)有其相對(duì)意義，本研究檢測(cè)了1 241 例孕婦SMN1基因E7、E8 拷貝數(shù)，以確保結(jié)果準(zhǔn)確性及指導(dǎo)是否要做進(jìn)一步檢測(cè)。

綜上，本研究通過對(duì)1 241 例孕婦樣本的篩查，初步確定萍鄉(xiāng)地區(qū)SMA 突變攜帶情況，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供重要的臨床依據(jù)，通過篩查篩選出同為攜帶者的夫婦，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷確定胎兒基因型，做到早診斷、早干預(yù)。對(duì)脊髓性肌萎縮癥進(jìn)行攜帶者篩查有效避免了SMA 患兒的出生，對(duì)降低家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)有重要意義。同時(shí)，我們也要思考，遺傳性疾病防控的完善性。在二級(jí)預(yù)防來說，基于目前的方法學(xué)確實(shí)有漏檢的可能，即使是當(dāng)前公認(rèn)檢測(cè)技術(shù)金標(biāo)準(zhǔn)多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）也僅能給出SMN1與SMN2 的拷貝數(shù)信息，無法對(duì)SMN 基因的單倍型提供更多有價(jià)值的信息，因此，我們考慮補(bǔ)充SMA 三級(jí)預(yù)防，即新生兒篩查，作為對(duì)二級(jí)預(yù)防的補(bǔ)充。目前《脊髓性肌萎縮癥中國(guó)三級(jí)預(yù)防指南》［12］已出臺(tái)，對(duì)于SMA 新生兒篩查流程與相關(guān)問題有了相應(yīng)規(guī)范與指導(dǎo)，因此在二級(jí)預(yù)防的基礎(chǔ)上去進(jìn)行三級(jí)預(yù)防有一定可行性，但也要根據(jù)二級(jí)預(yù)防的覆蓋率去全面考慮這個(gè)問題。目前，在廣東地區(qū)，江蘇地區(qū)，云南地區(qū)等也作了區(qū)域孕婦攜帶者篩查的研究，對(duì)地區(qū)的出生缺陷防控有重要的臨床意義。