張明霞 孟澤民 王衛(wèi)芳 王瑜 羅曉旭

甲型流感病毒是引起季節(jié)性流行性感冒的主要病原體之一，屬于正粘病毒科。其基因組由8 股單負(fù)鏈RNA 組成。甲型流感病毒常引起爆發(fā)或流行，導(dǎo)致本世紀(jì)的四次流感大流行，嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全［1?2］。及時準(zhǔn)確地對可疑感染甲型流感病毒的患者標(biāo)本進(jìn)行檢測，對臨床治療和疫情的控制均具有重要意義［3］。實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real?time PCR，qRT?PCR）是流感病毒確診的主要方法之一［4］，在季節(jié)性流感或流感大流行中都發(fā)揮重要的診斷作用。但病毒核酸提取時可能存在生物安全暴露風(fēng)險，因此檢測前病毒滅活處理尤為重要。目前新型冠狀病毒的檢測在指南［5］中已經(jīng)明確可以使用滅活的采樣管，但是關(guān)于甲型流感病毒無此類檢測指南發(fā)布。中國國家流感中心發(fā)布中國流感流行情況概要，監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示［6］，2023 年第9 周南、北方省份流感病毒檢測陽性率繼續(xù)上升。研究者在新冠疫情期間使用甲型流感病毒為替代病毒，對新冠病毒滅活后核酸檢測進(jìn)行了研究，闡明化學(xué)滅活劑可以應(yīng)用在甲型流感病毒的檢測中。鑒于2023 年1月底以來流感病毒臨床送檢樣本大量增長，而且陽性檢出率高達(dá)73%，因而本研究擬通過大量臨床陽性標(biāo)本驗證滅活型保存液對甲型流感病毒核酸檢測的影響。本研究通過將口咽拭子樣本采集、儲存在病毒滅活采樣管中，采用qRT?PCR 方法進(jìn)行甲型流感病毒的檢測，分析滅活采樣管和非滅活采樣管中甲型流感病毒核酸檢測結(jié)果，為滅活采樣管的臨床使用進(jìn)行初步數(shù)據(jù)積累，報道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集和處理

收集山西白求恩醫(yī)院2022 年2 月1 日至3 月1 日擬診流感的口咽拭子標(biāo)本。2 377 名患者同時采集兩份咽拭子標(biāo)本，一個拭子放在含有滅活型保存液的采集管中，另外一個拭子放在含有非滅活型保存液的采集管中。每個采集管的標(biāo)本分別分裝到3 個EP 管中，1 管即刻（采集后4 小時內(nèi)）進(jìn)行核酸檢測，另外兩管分別保存在2～8℃和-20℃以下，48 小時后對陽性樣本進(jìn)行核酸檢測。采用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT?PCR）方法對其進(jìn)行病毒核酸檢測。結(jié)果不一致時采用第二種核酸檢測試劑進(jìn)行比對檢測。受試對象納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲，擬診流感樣患者定義標(biāo)準(zhǔn)［1］：發(fā)熱（腋下溫度≥38℃），伴有咳嗽或咽痛之一者。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜18 歲；采樣標(biāo)本為痰液或其它下呼吸道標(biāo)本。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（YXLL?2020?02），所有患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器

甲型乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（江蘇碩世生物科技股份有限公司，48 人份/盒，批號：T202210001）；新冠病毒甲型流感病毒乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（湖南圣湘生物科技股份有限公司，20 人份/盒，批號：20230110）；熒光定量PCR儀（美國Thermofisher 公司，型號ABI7500）。

1.3 采樣管、核酸提取和RT?PCR 擴(kuò)增條件

滅活型和非滅活型采樣管均購自天津百康芯公司；采用江蘇碩世生物科技股份有限公司的甲型/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒提取病毒RNA，按試劑盒操作說明進(jìn)行。在ABI7500 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行RT?PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：50℃、30 min →95℃、5 min →95℃、10 s →55℃、40 s（45 個循環(huán)）。采用循環(huán)閾值（Cycling threshold，Ct）進(jìn)行計算。試劑盒采用一步法實時熒光RT?PCR 技術(shù)。每批次實驗均同時檢測陰性質(zhì)控品，弱陽性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。

1.4 檢測結(jié)果判斷

①根據(jù)試劑盒說明書要求，甲型流感病毒陽性結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)為FAM 熒光通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值≤34.7，乙型流感病毒陽性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為VIC 熒光通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值≤34.8；②甲型流感病毒陰性結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)為FAM 檢測通道無擴(kuò)增曲線或FAM 檢測通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值＞34.7，乙型流感病毒陰性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為VIC 檢測通道無擴(kuò)增曲線或FAM 檢測通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值＞34.8。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)的計量資料以（）表示，兩組間比較采用配對t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流感病毒陽性檢出率及滅活和非滅活組的qRT?PCR 結(jié)果比較

即刻檢測時兩組甲型流感病毒的陽性檢出率相同，均為74.5%（1 771/2 377），非滅活組平均循環(huán)閾值（Ct）值為（29.60±3.99），滅活組為（31.30±2.67），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.35，P=0.73）。未檢出乙型流感病毒核酸。

2.2 甲型流感病毒陽性標(biāo)本2～8℃和-20℃分別保存48 小時后的qRT?PCR 結(jié)果比較

2～8°及-20℃保存48 小時后兩組甲型流感病毒的陽性檢出率均無變化，非滅活組的平均Ct 值與滅活組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 兩組陽性標(biāo)本在不同保存溫度下的qRT?PCR 結(jié)果比較（）Table 1 Comparison of qRT?PCR results of positive samples in two groups at different storage temperatures（）

表1 兩組陽性標(biāo)本在不同保存溫度下的qRT?PCR 結(jié)果比較（）Table 1 Comparison of qRT?PCR results of positive samples in two groups at different storage temperatures（）

注：Ct 值為擴(kuò)增循環(huán)閾值。

3 討論

滅活型采樣管在新冠病毒核酸檢測中被廣泛應(yīng)用，姜蕾等［7］用熱滅活和化學(xué)滅活兩種不同方法分別處理咽拭子標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)56 ℃條件下作用30 min 和胍鹽保存液滅活標(biāo)本對新冠病毒核酸實時熒光qRT?PCR 結(jié)果無影響。在臨床檢驗方面，為減少實驗室操作人員感染傳染性及致病性較強的病原體的風(fēng)險，更多研究關(guān)注將標(biāo)本滅活對核酸檢測的影響［8?9］。陳培松等［10］研究發(fā)現(xiàn)75%乙醇滅活處理后和未滅活處理的新冠病毒標(biāo)本進(jìn)行qRT?PCR 檢測比較，結(jié)果一致性良好。

滅活型采樣管的方法操作簡單、經(jīng)濟(jì)，同時不引入其它儀器設(shè)備，對樣本進(jìn)行化學(xué)滅活病毒的前處理可以降低PCR 檢測實驗室人員的感染風(fēng)險。對于化學(xué)滅活病毒后是否影響核酸檢測效率存在不同意見［11］，而關(guān)于甲型流感病毒這方面的研究資料較少，因此滅活型保存液滅活手段對甲流病毒核酸檢測影響的評估尤為迫切和重要，因為此工作的完成有利于加強PCR 實驗室對高生物安全風(fēng)險樣本的處置管理，同時能更好地滿足甲流感染的臨床診斷和鑒別診斷的客觀需要。

2023 年1 月29 日以來，研究者所在的實驗室甲型流感病毒陽性檢出率大為增加，為本次研究提供了較好較多的臨床樣本。關(guān)于甲型流感病毒滅活后進(jìn)行核酸檢測的研究不多，而且臨床標(biāo)本數(shù)量較少［12］，用大量臨床陽性標(biāo)本驗證滅火病毒采樣管的研究不多見，因而研究者開展了本項研究。本實驗室對滅活型采樣管采集的標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測的大樣本研究中發(fā)現(xiàn)，對口咽拭子標(biāo)本采用加胍鹽化學(xué)滅活后再進(jìn)行流感病毒的qRT?PCR 檢測，對結(jié)果無明顯影響；而且在2～8℃或者-20℃以下的條件下，至少可以穩(wěn)定保存48 小時，對于無法立即進(jìn)行檢測的標(biāo)本，提供了保存條件的選擇。但本研究亦存在不足之處：①由于檢驗科條件限制，不能進(jìn)行滅活后病毒培養(yǎng)工作，從而無法評估此條件下的病毒滅活效率；②對于甲型流感病毒的陽性標(biāo)本，由于受樣本量的限制，未分裝標(biāo)本進(jìn)行評估常溫條件下的保存時間，以及2～8℃或者-20℃以下更長的保存時間對檢測結(jié)果的影響。根據(jù)本研究結(jié)果提示，盡管差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義的程度，但是在冷藏條件的保存48小時，核酸檢測結(jié)果的Ct值有增大的趨勢。

病毒核酸檢測具有窗口期短，靈敏度高，特異性強的優(yōu)點，但在臨床實驗室操作過程中可能會因職業(yè)暴露而對醫(yī)務(wù)人員造成感染。滅活型采樣管的使用可也在很大程度上降低感染風(fēng)險，因此研究者希望滅活型采樣管在病毒檢測方面的應(yīng)用越來越廣泛，并且采樣管既能有效滅活病毒，又不對其擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生影響，為當(dāng)下以及以后可能的病毒感染檢測做好準(zhǔn)備。