崔雅璇 陳旭 劉倩 孫佳樂

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種由冠狀動脈急性血栓引起的心肌缺血性疾病，其發(fā)病機制復雜，與冠狀動脈粥樣硬化、血液高凝狀態(tài)、炎性反應有關［1］。早期準確診斷及血運重建是修復心肌損傷及改善患者預后的重要環(huán)節(jié)。生長停滯特異性蛋白6（growth arrest?specific gene 6，Gas6）是分泌型維生素K 依賴蛋白，參與細胞增殖、分化、穩(wěn)態(tài)維持及免疫炎性調節(jié)反應。李迪等［2］研究指出血清Gas6 水平與AMI發(fā)生呈正相關，可指導AMI 的早期診斷。微小RNA（micro RNA，miRNA）作為一種內源性的非編碼RNA 廣泛存在于真核細胞中，其可靶向結合mRNA，阻斷蛋白基因表達。越來越多的證據顯示miRNA 在多種心血管疾病中失調［3］。微小RNA?195（miR?195）屬于miR?15/16/195/497 家族，人miR?195位于第17p染色體上，鄰近抑癌基因p53，可調控細胞凋亡、侵襲及轉移［4］。微小RNA?379（miR?379）是從人14q32.31 上MIR379 位點轉錄而來的一種miRNA，其被證明參與多種惡性腫瘤的進展［5］。目前臨床關于血漿miR?379、miR?195、Gas6 水平對AMI 的早期診斷作用還需更多資料支持，本研究將通過分析血漿miR?379、miR?195、Gas6水平早期檢測在AMI患者中的應用價值，以期為臨床探索AMI的新的治療靶點提供參考根據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2021 年5 至2022 年7 月于首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院心內科住院治療的265 例患者，其中127 例AMI 患者（包括ST 段抬高及非ST段抬高的AMI）設為AMI 組；剩余138 例非AMI患者（包括心律失常、心肌炎、穩(wěn)定性心絞痛、高血壓）設為非AMI 組；選取同期120 名健康體檢者，設為對照組。納入標準：①AMI 組患者符合《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》［6］中診斷標準，首發(fā)AMI，發(fā)病時間＜24 h；②對照組受試者無心腦血管疾??；③所有受試者自愿參加本研究，簽署知情同意書者。排除標準：①接受溶栓治療、冠狀動脈經皮介入治療者；②哺乳或妊娠期婦女；③合并精神異常、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、肝腎功能不全及惡性腫瘤者；④入院前1 個月服用抗炎藥物或合并急慢性感染性疾病者。本研究符合赫爾辛基人體試驗準則，經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集

采用橫斷面研究，收集AMI 組、非AMI 組入院后基線資料對照組基線資料，包括性別、年齡、身體質量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙史、飲酒史、合并糖尿病例數(shù)、合并高血壓例數(shù)及白細胞計數(shù)（white blood cell count，WBC）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low?density lipoprotein cholesterol，LDL?C）、高密度脂蛋白膽固醇（high?density lipoprotein cholester?ol，HDL?C）、左心室射血分數(shù)（left ventricular ejec?tion fraction，LVEF）水平。

1.2.2 血液樣本的采集及相關指標水平測定

非AMI 組及AMI 組患者留取入組后空腹靜脈血5 mL，對照組受試者留取體檢當日清晨外周靜脈血5 mL，置于EDTA?2Na 抗凝管，4℃下3 500 r/min 離心5 min，離心半徑10 cm，分離血漿，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用mini?VIDAS 全自動免疫熒光酶標儀以ELISA 法檢測血漿Gas6 水平，相關試劑盒購自默克生物，檢測過程嚴格按照試劑盒操作流程。

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantita?tive real?time polymerase chain reaction，qRT?PCR）測定血漿miR?379、miR?195的相對表達量：采用miRNeasy Mini kit 試劑盒提取血漿總RNA，以美國NanoDrop2000 超微量分光光度計檢測RNA 濃度和純度，采用反轉錄試劑盒（日本TaKaRa）合成cDNA，配制10 μL PCR 反應體系。采用美國BioRad qRT?PCR 儀行PCR 3 步法擴增，共45 個循環(huán)。上述qRT?PCR 反應酶及相關引物由翌圣生物科技（上海）股份有限公司提供。以U6為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算miR?379、miR?195的mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT?PCR 引物序列表Table 1 RT?PCR primer sequence

1.3 觀察指標

①比較AMI 組、非AMI 組、對照組三組受試者入組時的血漿miR?379、miR?195的表達量及Gas6水平；②分析AMI 患者血漿miR?379、miR?195、Gas6 水平的相關性；③分析AMI 患者入組時的血漿Gas6、miR?379、miR?195水平對早期AMI 的診斷價值。miR?379、miR?195、Gas6 聯(lián)合診斷AMI 標準：當三個指標同時診斷為AMI 陽性時則判定為AMI 陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差檢驗，進一步組間比較采用q檢驗；計數(shù)資料比較以n（%）表示，采用χ2檢驗；采用Pearson 相關性系數(shù)分析AMI 組入組時血漿Gas6 水平與miR?379、miR?195表達量的關系；以敏感度為縱坐標，1?特異度為橫坐標，繪制血漿Gas6 水平與miR?379、miR?195表達量對早期AMI 診斷價值的ROC 曲線，計算曲線下面積（area under curve，AUC）及最佳截斷值（Cut?off值）；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組基線特征比較

AMI 組、非AMI 組及對照組受試者年齡、性別、BMI、飲酒史、吸煙史、TC 水平、HDL?C 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；AMI 組及非AMI組合并糖尿病及高血壓例數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；三組WBC 計數(shù)、LDL?C 水平、LVEF值比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組基線資料比較［n（%），（）］Table 2 Comparison of baseline data among the three groups［n（%），（）］

表2 三組基線資料比較［n（%），（）］Table 2 Comparison of baseline data among the three groups［n（%），（）］

2.2 三組入組時血漿miR?379、miR?195、Gas6 水平比較

AMI 組、非AMI 組及對照組入組時的血漿miR?379、miR?195、Gas6 水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；miR?379水平比較：AMI 組＜非AMI 組＜對照組，miR?195、Gas6 水平比較：AMI 組＞非AMI 組＞對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三組入組時血漿miR?379、miR?195、Gas6水平比較（）Table 3 Comparison of plasma miR?379，miR?195 and Gas6 levels at admission among the three groups（）

表3 三組入組時血漿miR?379、miR?195、Gas6水平比較（）Table 3 Comparison of plasma miR?379，miR?195 and Gas6 levels at admission among the three groups（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與非AMI 組比較，bP＜0.05。

2.3 AMI 組入組時血漿Gas6、miR?379、miR?195水平的關系

Pearson 相關系數(shù)分析顯示，AMI 組患者入組時的血漿Gas6 水平與miR?379水平呈負相關（r=-0.317，P=0.019），與miR?195水平呈正相關（r=0.235，P=0.039）。

2.4 患者入組時血漿Gas6、miR?379、miR?195 水平對早期AMI 的診斷價值

以入組時的血漿miR?379、miR?195、Gas6 水平為檢驗變量，以AMI 患病情況為狀態(tài)變量，取狀態(tài)變量值為1，繪制ROC 曲線，結果顯示血漿miR?379、miR?195、Gas6 水平單獨診斷早期AMI 的效能（AUC=0.808、0.718、0.752）低于三者聯(lián)合診斷（AUC=0.879）。見表4、圖1。

圖1 ROC 曲線圖Figure 1 ROC curves

表4 入組時血漿Gas6、miR?379、miR?195 水平對早期AMI 的診斷價值Table 4 Diagnostic value of plasma Gas6，miR?379 and miR?195 levels at admission on early AMI

3 討論

AMI 發(fā)病迅猛，進展快，若救治不及時可引發(fā)休克、心力衰竭及死亡。有研究顯示，不同疾病嚴重程度AMI 患者的預后差異明顯，早識別、早干預可有效提高治療效果［7］。積極探尋可應用AMI 早期診斷的外周血標志物是臨床醫(yī)患共同關注的焦點。Gas6可參與細胞增殖、凋亡、氧化應激以及炎癥反應過程，研究［8］表明，Gas6 與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關，其水平變化可能有助于判斷患者病情。miRNA含有22 個核苷酸，可通過表達基因的抑制及mRNA 的降解發(fā)揮基因沉默作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅可調控心臟發(fā)育及心肌重構，還參與心臟疾病的診斷及預后評估［9］。本研究證明，血漿miR?379、miR?195、Gas6 可指導AMI 的早期診斷。

本研究采取橫斷面調查，將到心內科住院治療的患者分為AMI 組及非AMI 組，另取健康體檢者做對照，結果顯示三組入組時miR?379水平比較：AMI 組＜非AMI 組＜對照組；miR?195、Gas6 水平比較：AMI 組＞非AMI 組＞對照組。提示血漿miR?379、miR?195、Gas6 水平與AMI 發(fā)生發(fā)展有關。Caldentey 等［10］以227 例ST 段抬高型心肌梗死（ST?segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者為受試對象，發(fā)現(xiàn)其術后的血清可溶性AXL（soluble Axl，sAXL）及Gas6 水平明顯升高，指出Gas6?AXL 系統(tǒng)介導STEMI 后左心室重構。崔秀蘭等［11］研究則發(fā)現(xiàn)，AMI 患者及經皮冠狀動脈介入治療術后患者血漿Gas6 水平明顯升高，Gas6 可能通過調節(jié)炎癥反應參與AMI 經皮冠狀動脈介入治療術后的病理過程。有報道稱，miR?379可作為治療MI 的最新靶點，miR?379可通過與腫瘤壞死因子?α?誘導蛋白8（tumor necrosis factor?α induced protein 8，TNFAIP8）結合抑制細胞核因子（nuclear factor kappa?B，NF?κB）信號通路，降低心肌細胞凋亡，以保護心功能［12］。還有學者證明，miR?195可通過上調轉化生長因子?β1（transforming growth factor beta 1，TGF?β1）/Smad 信號通路促進MI 大鼠心肌纖維化［13］，這為本研究提供理論支持。本研究通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，AMI 組患者血漿Gas6與miR?379呈負相關，與miR?195水平呈正相關，進一步表明miR?379、miR?195參與了AMI 發(fā)病過程。ROC 曲線分析顯示，血漿miR?379、miR?195、Gas6 水平單獨診斷早期AMI 具有一定局限性（AUC=0.808、0.718、0.752），三者聯(lián)合診斷的效能最佳（AUC=0.879），表明miR?379、miR?195、Gas6三者聯(lián)合在AMI 的早期診斷中具有一定的應用價值。劉鐵紅等［14］指出，Gas6 升高是AMI 發(fā)生的獨立危險因素，其診斷AMI 的AUC 為0.878。張淑華等［15］發(fā)現(xiàn)，隨著AMI 患者胸痛時間的延長，其血漿miR?195 水平呈升高趨勢，miR?195診斷AMI 的AUC 為0.940。還有研究表明，miR?379與AMI 患者CK?MB、CTn?I 呈負相關，ROC 診斷早期AMI 的AUC 為0.751［16］。上述研究中AUC 值與本研究結論存在一定出入，可能受樣本量波動影響。

綜上所述，與健康對照組及穩(wěn)定性非AMI 組受試者相較，AMI 組患者的血漿miR?195、Gas6 水平異常升高，miR?379水平異常降低，三指標可指導AMI 的早期診斷。