陳英 童曉青 余學(xué)高 黃浩 黃彬 陳培松★

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（noninvasive prenatal test?ing，NIPT）是目前用于胎兒非整倍體篩查的重要手段，對羊水穿刺及胎兒染色體核型分析具有重要的指導(dǎo)作用［1?2］。其還被擴(kuò)展到相關(guān)染色體片段位置的微缺失/重復(fù)綜合征（micro deletion/micro duplication syndrome，MMS）［3］116 種等的篩查，即擴(kuò)展性無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（expanded non?invasive prenatal testing，NIPT?plus）。有研究顯示NIPT 用于篩查唐氏綜合征［4］，但對部分染色體微重復(fù)/微缺失的診斷價(jià)值低，常出現(xiàn)漏診，而NIPT?plus 通過加深測序深度、增大檢測范圍，在胎兒染色體非整倍體篩查中具有較高的價(jià)值［5］。本研究通過對中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的單胎妊娠孕婦3 860 例接受無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的檢查結(jié)果進(jìn)行分析，探討NIPT?plus 技術(shù)篩查染色體微缺失/重復(fù)綜合 征（micro deletion/micro duplication syndrome，MMS）早期診斷和預(yù)防中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床醫(yī)生和孕婦選擇NIPT?plus 提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2020 年12 月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受NIPT 篩查的孕婦3 860 例及2022 年CNV 質(zhì)評樣本10 例，其中行侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦有24 例。在生育前均進(jìn)行了B 超檢測，7 例顯示胎兒部分結(jié)構(gòu)異常；20 例進(jìn)行了NT 值檢測，1 例NT 值為2.7 mm，為臨界指標(biāo)，另19 例NT值均小于2.5 mm。孕婦年齡為（24～44）歲，平均年齡為33.58 歲，平均孕周為（15+0.875）周。研究對象排除一年內(nèi)接受過異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療、免疫治療。對比分析兩組對象的NIPT 及NIPT?plus 的胎兒DNA 濃度、測序數(shù)據(jù)量、產(chǎn)前診斷結(jié)果和妊娠結(jié)局等。本研究已通過院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審查，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

DA8600 二代基因測序儀（廣州達(dá)安基因股份有限公司）、油包水PCR 儀（Ion One Touch2）、模板富集儀（Ion One TouchES）、DNA 提取試劑盒（磁珠法，廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司）、測序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體法，廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司）、微陣列分析系統(tǒng)（Affymetrix GeneChip Scanner 3000Dxv.2），包括Thermo Fisher Scientific SNP array 平臺，芯片類型為CytoScan HD或CytoScan 750K 芯片，數(shù)據(jù)分析軟件為Thermo Fisher Scientific ChAS 軟件，人類參考基因組版本為（GRCh37/hg19）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理

①EDTA 抗凝管收集孕婦外周血6 mL，先4℃1 600 g 離心力低速離心10 min，再4℃16 000 g 離心力高速離心10 min，取血漿800 μL于-80℃冰箱保存。

②DNA提取，得濃度＞0.05 ng/μL 的DNA溶液。

③文庫構(gòu)建：1）末端修復(fù)；2）末端加接頭；3）PCR擴(kuò)增DNA片段。NIPT文庫濃度≥0.2 ng/μL，NIPT?plus 用磁珠富集＜160 bp 的DNA 片段，文庫濃度≥1.0 ng/μL，否則重新提取DNA 和建庫。

1.3.2 NIPT 與NIPT?plus 檢測

①Pooling 文庫；②模板制備；③模板富集；④采用ION PROTON DA8600 二代測序儀進(jìn)行測序。運(yùn)用Tmap 比對算法，將測序所得的序列與人類基因組參考序列圖譜進(jìn)行比對。使用廣州達(dá)瑞生物公司的分析系統(tǒng)，采用生物信息學(xué)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算Z 值，利用Z 值來評估胎兒患病風(fēng)險(xiǎn)（cut off：|Z|=3）。Z＞3 代表該染色體可能是三倍體，Z＜?3 代表該染色體可能是單倍體或存在缺失。

1.3.3 侵入性產(chǎn)前診斷

根據(jù)NIPT 檢測結(jié)果選擇進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷，抽取羊水10 mL。CMA 分析：提取DNA，應(yīng)用芯片對全基因組已知的拷貝數(shù)變異進(jìn)行分析，對檢測結(jié)果進(jìn)行公共數(shù)據(jù)庫查詢，包括DECIPHER數(shù)據(jù)庫（https：//decipher.sanger.ac.uk/index）、DGV（https//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、ClinGen（https：//dosage.clinicalgen/ome.org）、CNV Pathogenicity Calculator（http：// cnvcalc.clinicalgenome.org/ cnv?calc）、OMIM（https：//omim.org）等。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)量

24 例孕婦及10 例質(zhì)評樣本NIPT 和NIPT?plus檢測cffDNA 濃度均達(dá)到分析要求（cffDNA≥5%）。見圖1、3。孕婦血漿NIPT 和NIPT?plus 檢測總測序數(shù)據(jù)量和有效測序數(shù)據(jù)量均值分別為6.74 Mb，4.90 Mb；9.37 Mb，5.86 Mb。見 圖2。10 例質(zhì)評樣本NIPT 和NIPT?plus 檢測總測序數(shù)據(jù)量和有效測序數(shù)據(jù)量均值分別為6.61 Mb，4.63 Mb；10.47 Mb，6.21 Mb。見圖4。

圖1 24 例樣本cffDNA 濃度Figure 1 cffDNA concentration of 24 samples

圖2 24 例樣本總測序數(shù)據(jù)量和有效測序數(shù)據(jù)量Figure 2 Total Sequencing Data Amount and Effective Sequencing Data Amount of 24 Samples

圖3 10 例質(zhì)評樣本cffDNA 濃度Figure 3 cffDNA concentration of 10 quality assessment samples

圖4 10 例質(zhì)評樣本總測序數(shù)據(jù)量和有效測序數(shù)據(jù)量Figure 4 Total Sequencing Data and Effective Sequencing Data of 10 Quality Evaluation Samples

2.2 染色體異常胎兒生育情況及相關(guān)檢測結(jié)果

24 例孕婦均接受羊水穿刺，22 例診斷為MMS，另有2 例重復(fù)程度接近三體。見表1。通過本院病歷系統(tǒng)查知：2 例提示三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦均放棄胎兒；1 例生育情況不明；剩下21 例均產(chǎn)下新生兒。其中9 例有不同程度缺陷，如先天性唇裂、β 地中海貧血、α 地中海貧血等，其余12 例均體健。NIPT?plus 提示1 例18?三體，1 例21?三體，2 例MMS；NIPT 提示1 例18?三體，1 例21?三體。10 例質(zhì)評樣本NIPT?plus 提示9 例MMS。見表2。主要有del22、dup20、del5、del1。見圖5～9。同時(shí)第9 號樣本存在MMS 的情況下亦提示SCAs；NIPT 僅提示第9 號樣本為SCAs。24 例臨床樣本和10 例質(zhì)評樣本NIPT?plus 篩查MMS，結(jié)果提示其敏感度可達(dá)35.5%。見表3。

表1 24 例臨床樣本相關(guān)結(jié)果Table 1 Relevant results of 24 clinical samples

表2 10 例質(zhì)量評價(jià)樣本相關(guān)結(jié)果Table 2 relevant results of 10 quality evaluation samples

表3 24 例臨床樣本和10 例質(zhì)評樣本NIPT?plus 結(jié)果及產(chǎn)前診斷Table 3 NIPT plus results and prenatal diagnosis of 24 clinical samples and 10 quality evaluation samples

圖5 22q11 缺失綜合征Figure 5 22q11 deletion syndrome

圖6 20p 三體綜合征Figure 6 Trisomy 20p Syndrome

圖7 22q11.2 缺失綜合征Figure 7 22q11.2 deletion syndrome

圖8 貓叫綜合征Figure 8 Cattle howling syndrome

圖9 1p36 缺失綜合征Figure 9 1p36 deletion syndrome

3 討論

MMS 是指染色體上缺失或增加片段較小，一般小于10 Mb，但可引起一系列復(fù)雜多樣且嚴(yán)重的臨床癥狀［6］，包括三百多種已知疾病，常表現(xiàn)為智力障礙、發(fā)育遲緩、內(nèi)臟器官畸形、面部特征、精神行為改變等。據(jù)統(tǒng)計(jì)MMS 占新生兒先天畸形2%左右，是除染色體非整倍體異常外的另一大類新生兒出生缺陷，此外大約12%的原因不明的智力低下，多種畸形和發(fā)育遲緩的病例是由MMS 引起的［7］。孕早期聯(lián)合試驗(yàn)（血清學(xué)和超聲篩查）對染色體非整倍體檢測率雖較高，但在妊娠早期不易檢測到染色體MMS［8］。介入性有創(chuàng)檢測可檢出整個(gè)染色體異?；虼蠓秶旧w變異，診斷準(zhǔn)確率高，然而羊膜穿刺術(shù)有嚴(yán)格的適應(yīng)癥和禁忌癥，有前置胎盤、先兆流產(chǎn)等孕婦不適合羊水產(chǎn)前診斷［9?10］。而NIPT?plus 靈敏度高，不僅對染色體非整倍體有良好的篩查價(jià)值［8，11］，還可增加對MMS 的檢出率，相較于超聲可檢測出MMS，對比有創(chuàng)診斷降低了流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)，與NIPT 比較能夠更有效精準(zhǔn)地篩查胎兒染色體拷貝數(shù)異常。

本研究結(jié)果顯示，：NIPT?plus 的cffDNA 濃度明顯高于NIPT，其測序數(shù)據(jù)量接近NIPT 的1.2～1.6 倍。24 例臨床樣本NIPT?plus 的SEN可達(dá)16.67%（4/24），NIPT 僅8.33%（2/24）；10 例質(zhì)評樣本其SEN 高為100%，NIPT 僅10%?？傮w而言NIPT?plus 對MMS 的SEN 可達(dá)35.5%。根據(jù)產(chǎn)前診斷及室間質(zhì)評結(jié)果可見NIPT?plus 能有效提高染色體病的檢出率，尤其是對MMS 的檢出率。據(jù)多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)［12］，每項(xiàng)NIPT?plus 研究報(bào)告的MMS 檢測陽性預(yù)測值差異顯著，從低（11%～18%）到中等（29%～77%）不等。在Wang 等［13］2018 年1月至2020 年4 月對39 002 名孕婦進(jìn)行NIPT 結(jié)果顯示，對MMS 的PPVs 為49.02%。而在本研究中，NIPT?plus 和NIPT 的總體PPVs 均為100%，該結(jié)果與以上研究資料不符是因本次研究所取的對象多為CMA 陽性標(biāo)本所致。

NIPT 可用于針對研究明確的MMS 進(jìn)行檢測［14］，在相關(guān)研究中，對于致病性MMS 的檢測，NIPT?plus 篩查靈敏度可達(dá)98.25%。在本研究中，10 例質(zhì)評樣本NIPT?plus 能夠提示全部MMS 和SCAs，表明NIPT?plus 在性能上值得推廣借鑒。雖然在本研究中對于已明確意義的CNVs，NIPT?plus 的SEN 較高，但在臨床樣本中SEN 仍低于現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)，假陰性較高，除了因本研究樣本量少有關(guān)外，結(jié)合現(xiàn)有資料，本研究中NIPT?plus 假陰性的原因可能還有胎兒低比例嵌合未被檢出、限制性胎盤嵌合體、及本身技術(shù)缺陷等。因此正確看待NIPT?plus的適用范圍和檢測結(jié)果、提高NIPT?plus 技術(shù)至關(guān)重要。

綜上所述，建議孕婦和臨床醫(yī)生有必要選擇NIPT?plus，以提高常見染色體三體、SCAs、和MMS 檢出率。對于染色體病和其他先天性疾病采用多種產(chǎn)前篩查技術(shù)相互配合，取長補(bǔ)短，提高疾病檢出率，降低出生缺陷發(fā)生率。