古麗米熱·阿巴拜克日，帕爾哈提·柔孜，*，劉源，陳艷萍，排則麗耶·阿不都熱依木，圖尼古麗·艾麥提，則拉萊·司瑪依，鄧杰

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

畜禽骨骼作為一種高營(yíng)養(yǎng)的傳統(tǒng)食物，據(jù)傳統(tǒng)中藥學(xué)記載具有強(qiáng)筋壯骨、延年益壽、滋補(bǔ)等作用[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，動(dòng)物骨骼提取物具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、保護(hù)骨健康等功效[2-3]，其可能與動(dòng)物骨骼中的優(yōu)質(zhì)蛋白、礦物質(zhì)和脂肪等活性成分有關(guān)[4]。膠原蛋白獨(dú)特的生物相容性和生物可降解性在食品、美容、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[5]，目前已從羊、豬、牛、牦牛、鹿、驢等禽畜骨中制備了膠原蛋白和膠原肽，開(kāi)發(fā)了骨肽片、骨膠原蛋白肽、骨肽注射液、凍干粉、蛋白膠囊等產(chǎn)品[6-9]，同時(shí)開(kāi)發(fā)了多種骨湯呈味產(chǎn)品[10-11]，骨類資源的開(kāi)發(fā)日益增多。駱駝隨產(chǎn)業(yè)趨勢(shì)逐漸由役用轉(zhuǎn)向食用，但駱駝的可利用部分除了駝奶和肉以外，駱駝骨資源的開(kāi)發(fā)利用較其它骨資源相比未能得到關(guān)注，針對(duì)其骨髓營(yíng)養(yǎng)化學(xué)成分研究更為鮮見(jiàn)。

隨著我國(guó)的畜禽業(yè)規(guī)模和肉類需求越來(lái)越龐大，駱駝養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，2021年全國(guó)存欄數(shù)約有60 萬(wàn)峰左右，新疆已成為養(yǎng)殖駱駝最多的地區(qū)之一，占全國(guó)總量的47.69%[12]。同年，新疆的駱駝存欄數(shù)19.6 萬(wàn)峰，畜產(chǎn)品產(chǎn)量1.32 萬(wàn)t[13]，按動(dòng)物體重比例，骨骼的質(zhì)量約占體重的20%～30%，待開(kāi)發(fā)的骨類蛋白資源較為豐富。目前國(guó)內(nèi)外已有部分關(guān)于動(dòng)物膠原蛋白提取及功能特性的研究，如豬骨中蛋白提取率可達(dá)28.45%，酶解后羥自由基清除能力較強(qiáng)，在pH 值為5，濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，其酶解物具有較高的乳化穩(wěn)定性[14-16]；羊骨的蛋白質(zhì)含量占總質(zhì)量的20.97%，羊骨多肽具有較好的抗氧化活性[17-18]；牛骨膠原蛋白肽提取率為12.45%，且分子量越小抗氧化能力越強(qiáng)[19]，牦牛骨的兩種膠原蛋白肽對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH 和·O2-均有較好的清除活性，可用于抗氧化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[20]。隨著食品加工技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注動(dòng)物骨類蛋白與相關(guān)產(chǎn)品在理化性質(zhì)上的應(yīng)用，烏日古莫樂(lè)[21]發(fā)現(xiàn)牛骨蛋白在pH 值為8 時(shí)，理化性質(zhì)表現(xiàn)最佳；宋樂(lè)[22]前期分析駝?wù)颇z原蛋白的理化性質(zhì)，表明等電點(diǎn)在pH7 附近，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)具有較高的乳化性及乳化穩(wěn)定性，持油性為（6.22±0.44）g/g。

從駱駝骨髓中提取膠原蛋白和評(píng)價(jià)其功能特性及活性是有效利用駱駝骨資源的途徑之一，促進(jìn)解決動(dòng)物肉副產(chǎn)品的有效利用問(wèn)題，同時(shí)也能豐富蛋白資源。

本文以駱駝骨髓為原料，蛋白含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法對(duì)駱駝骨髓蛋白（camel bone marrow protein，CBMP）的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝，并探究其功能特性和抗氧化活性，旨在為動(dòng)物骨髓中蛋白資源的高值化開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

駱駝骨：市售，經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院巴吐?tīng)枴ぐ⒉涣四窘淌阼b定為新疆雙峰駱駝骨，憑證標(biāo)本保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物大分子實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

牛血清蛋白E-BC-K318-M：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）：上海麥克林生化科技公司；十二烷基硫酸鈉：生工生物工程（上海）股份有限公司；花生油：益海嘉里金龍魚(yú)糧油食品股份有限公司；石油醚、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器

電子天平（FA1004）：常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：上海興創(chuàng)科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；冷藏冷凍箱（BCD-208JDE）：浙江星星冷鏈集成股份有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6 新世紀(jì)）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52）：上海亞榮生化儀器有限公司；離心機(jī)（SF-TDL-40D）：上海菲恰爾分析儀器股份有限公司；高速分散器（XHF-DY）：寧波新芝生物有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品預(yù)處理

取出冷凍的駱駝骨，將骨髓與骨質(zhì)分開(kāi)，初步洗凈，除去骨髓中的殘留碎片和多余的肉渣并洗去血跡，將所得的駱駝骨髓冷凍至-20 ℃下硬化，再放置于搗藥罐中按照1∶6（g/mL）的固液比加入液氮進(jìn)行冷凍粉碎，保存在-40 ℃冰箱，備用。

1.4.2 CBMP 的提取

參照文獻(xiàn)[23]并略作修改，取30 g 駱駝骨髓粉末，按1∶20（g/mL）固液比加入蒸餾水，攪拌，充分混合，45 ℃下磁力攪拌回流提取2 h，重復(fù)3 次，用分液漏斗分離油水層，收集并混合下層提取液，用石油醚萃取脫脂，濾過(guò)，再適當(dāng)濃縮，透析（截留量為3 000 Da）48 h，真空冷凍干燥，得到CBMP 粉末。根據(jù)公式（1）計(jì)算CBMP 提取率。

式中：C為CBMP 提取率，%；M為水提蛋白粉末質(zhì)量，g；m為駱駝骨髓粉末質(zhì)量，g；n為駱駝骨髓粉末油含量，%。

1.4.3 蛋白含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[24]：將1 mL 不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）牛血清蛋白質(zhì)溶液分別加入到3 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，避光靜置反應(yīng)5 min。在595 nm 處測(cè)吸光度，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=1.010 8X+0.694 2（R2=0.999 7）。取濃度為1 mg/mL 的蛋白提取液，按照上述步驟測(cè)定其蛋白含量。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

以蛋白含量為指標(biāo)，分別以提取溫度、料液比、時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察各因素對(duì)CBMP 含量的影響，從而得到合適的自變量水平，進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，單因素試驗(yàn)水平見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)水平Table 1 Factor levels in single factor experiments

1.4.5 Box-Behnken 法優(yōu)化CBMP 提取工藝

利用Design-Expert 設(shè)定四因素三水平試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸性分析，擬合響應(yīng)值與各因素的數(shù)學(xué)回歸模型。因素及水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)水平Table 2 Factors and levels of response surface design

1.4.6 CBMP 功能特性的測(cè)定

1.4.6.1 蛋白溶解性

準(zhǔn)確稱取CBMP 樣品10 mg 于離心管中，加入鹽酸（0.5 mol/L）或氫氧化鈉（0.5 mol/L）分別配制pH 值為2、4、6、8、10 的10 mL 溶液，漩渦混合6 min，3 500 r/min 離心25 min，測(cè)定其蛋白含量[25]，按公式（2）計(jì)算蛋白溶解性。

式中：S為CBMP 溶解性，%；M1為懸浮液中加入的蛋白含量，%；M2為離心后上清液蛋白含量，%。

1.4.6.2 蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性

參照文獻(xiàn)[26]測(cè)定CBMP 的乳化性（emulsification，EAI）與乳化穩(wěn)定性（emulsion stability，ESI），準(zhǔn)確稱取CBMP 樣品10 mg 于燒杯中，加入鹽酸（0.5 mol/L）或氫氧化鈉（0.5 mol/L）分別配制pH 值為2、4、6、8、10 的10 mL 溶液，再加5 mL 花生油，10 000 r/min 高速均質(zhì)2 min。分別在0 min（A0）和靜置10 min（A10）時(shí)從燒杯低部取50 μL 乳濁液與5 mL 十二烷基硫酸鈉（1%）溶液混合均勻，在500 nm 處測(cè)定吸光度。用以下公式計(jì)算乳化性（A，m2/g）和乳化穩(wěn)定性（S，%）。

式中：W為樣品稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；Φ為光程，設(shè)定為0.01；θ為乳狀液的油體積分?jǐn)?shù)，0.25。

1.4.6.3 蛋白持水性

準(zhǔn)確稱取10 mg CBMP 記為m0，將CBMP 放入離心管中記質(zhì)量為m1，加入鹽酸（0.5 mol/L）或氫氧化鈉（0.5 mol/L）分別配制pH 值為2、4、6、8、10 的10 mL 溶液，漩渦混合6 min 并于30 ℃恒溫箱恒溫30 min，4 000 r/min 離心30 min，除去上層清液，稱重記為m2[27]，持水性（W，g/g）計(jì)算公式如下。

1.4.6.4 蛋白持油性

準(zhǔn)確稱取10 mg CBMP 記為m0，將CBMP 放入離心管中記質(zhì)量為m1，加入10 mL 花生油，再漩渦混合5 min，直到樣品被油飽和，靜置30 min，4 000 r/min 離心20 min，將上清液的油去掉，稱離心管質(zhì)量記為m2[28]，持油性（O，g/g）計(jì)算公式如下。

1.4.7 CBMP 抗氧化活性的測(cè)定

1.4.7.1 DPPH·清除能力

將不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）CBMP 溶液各準(zhǔn)確吸取2 mL 于具塞試管中分別加入2 mL 已配制好的DPPH 溶液（0.2 mmol/L）搖勻，37 ℃恒溫30 min，于517 nm 處測(cè)定吸光度?？瞻捉M由等量蒸餾水代替，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照[29]。CBMP 對(duì)DPPH·的清除率按下式計(jì)算。

式中：T1為DPPH·清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為對(duì)照品組吸光度。

1.4.7.2 ·OH 清除能力

將不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）CBMP 溶液各1 mL 于試管中，分別加入各1 mL 配制好的FeSO4·7H2O 溶液（6 mmol/L）、水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L）和H2O2（0.1%）溶液，反應(yīng)30 min，于510 nm 處測(cè)吸光度[30]。CBMP 對(duì)·OH 清除率計(jì)算公式如下。

式中：T2為·OH 清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為對(duì)照品組吸光度。

1.4.7.3 總還原能力

準(zhǔn)確吸取不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）CBMP 溶液0.8 mL 于具塞試管中，分別加入0.2 mol/L 的pH 值為6.6 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）0.4 mL，再加入1%的鐵氰化鉀0.4 mL，在50 ℃水浴20 min，冷卻，加10% 的C2HCl3O2水溶液0.4 mL，再加入蒸餾水1.6 mL 和0.1%的FeCl3水溶液0.4 mL，室溫放置10 min，700 nm 處測(cè)吸光度[31]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品至少重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值，采用SPSS 16.0、Origin 9.0、Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

各因素對(duì)CBMP 含量的影響如圖1所示。

圖1 各因素對(duì)CBMP 含量的影響Fig.1 Effects of various factors on the content of camel bone marrow protein（CBMP）

由圖1A 可知，當(dāng)提取溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，CBMP 含量達(dá)到最高值（P＜0.05），為（34.65±0.23）%。然而，繼續(xù)升高溫度可能導(dǎo)致蛋白的變性，從而導(dǎo)致蛋白含量降低[32-33]。因此，選擇40、45、50 ℃3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面研究。

由圖1B 可知，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，CBMP含量達(dá)到最高值（P＜0.05），為（34.35±0.31）%，進(jìn)一步升高溶劑量，CBMP 含量逐漸減小。當(dāng)溶劑量較少時(shí)，提取溶液的黏度高，分子擴(kuò)散速率較低，影響蛋白的溶出；隨著溶劑的增加，溶液逐漸稀釋，蛋白溶解量增加，蛋白含量升高；然而，溶劑量過(guò)多導(dǎo)致蛋白含量的降低，這可能是由于太多的溶劑使溶液分散太多，使蛋白損失增加，蛋白含量降低[34]。因此，選擇1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面研究。

由圖1C 可知，當(dāng)提取時(shí)間為120 min 時(shí)，CBMP含量達(dá)到最大值（P＜0.05），為（35.13±0.05）%。提取時(shí)間較短，蛋白和其他成分分離程度小，導(dǎo)致蛋白含量降低；然而提取時(shí)間延長(zhǎng)，可能引起蛋白和非蛋白成分的沉淀，從而降低蛋白的含量。因此，選擇90、120、150 min 3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面研究。

由圖1D 可知，當(dāng)提取次數(shù)為2 次時(shí)CBMP 含量達(dá)到最大（P＜0.05），為（35.14±0.18）%。此后，隨著提取次數(shù)的增加，蛋白含量逐步降低，這原因可能是提取次數(shù)過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致非蛋白類雜質(zhì)與蛋白一起溶出，因此蛋白含量降低。因此，選擇1、2、3 次3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面研究。

2.2 響應(yīng)面法提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇了對(duì)CBMP 含量影響顯著的4 個(gè)因素（提取溫度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)）設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface test

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，分別以提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為變量，經(jīng)多元回歸分析，得到CBMP 提取工藝含量（Y）對(duì)4 個(gè)因素（A、B、C、D）的二次回歸模型：Y=35.32+1.01A-0.042B+0.76C+0.66D-0.32AB-0.18AC+0.24AD+0.30BC+0.020BD-0.38CD-7.22A2-6.63B2-2.47C2-3.57D2。

以CBMP 含量為響應(yīng)值對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

回歸模型方差分析表明，A、C、D、A2、B2、C2、D2對(duì)CBMP 含量的線性效應(yīng)極顯著（P＜0.01）；B、AB、AC、AD、BC、BD、CD均不顯著（P＞0.05）；該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），R2=0.992 0，說(shuō)明實(shí)際試驗(yàn)與該模型擬合度良好，證明響應(yīng)面法優(yōu)化CBMP 提取工藝是可行的。F值的大小反映因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)（因變量）的重要程度，結(jié)果為FA＞FC＞FD＞FB。

2.2.2 各因素交互作用對(duì)CBMP 含量的影響

利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)工藝參數(shù)組合進(jìn)行優(yōu)化，等高線的形狀與疏密程度反映因素相互作用的強(qiáng)度，橢圓形且曲線密集對(duì)響應(yīng)值有顯著影響，而圓形和曲線稀疏對(duì)響應(yīng)值沒(méi)有顯著影響。各因素交互作用對(duì)CBMP 含量的影響如圖2～圖5所示。

圖2 提取溫度與料液比的交互作用Fig.2 Interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio

圖3 提取溫度與提取時(shí)間的交互作用Fig.3 Interaction between extraction temperature and extraction time

圖4 提取溫度與提取次數(shù)的交互作用Fig.4 Interaction between extraction temperature and extraction times

圖5 提取時(shí)間與提取次數(shù)的交互作用Fig.5 Interaction between extraction time and extraction times

由圖2～圖5 可知，提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)兩兩交互作用的等高線接近橢圓，說(shuō)明交互作用明顯。

2.2.3 提取工藝條件的確定和驗(yàn)證

優(yōu)化得到的CBMP 提取的最優(yōu)提取條件為提取溫度45.35 ℃、料液比1∶19.99（g/mL），提取時(shí)間124.36 min、提取次數(shù)2.09，最佳CBMP 含量為35.4357%?？紤]到實(shí)際運(yùn)用時(shí)的可操作性，將提取工藝參數(shù)修正為提取溫度45℃、料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間120 min、提取2 次。采用修正參數(shù)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，CBMP 含量為（36.56±0.24）%，提取率為（18.26±1.23）%。

2.3 CBMP 功能特性分析

2.3.1 溶解性

溶解性是蛋白質(zhì)十分重要的功能性質(zhì)，pH 值對(duì)CBMP 溶解性的影響如圖6所示。

圖6 pH 值對(duì)CBMP 溶解性的影響Fig.6 Effect of pH on the solubility of camel bone marrow protein（CBMP）

由圖6 可知，CBMP 在較低或較高的pH 值時(shí)，溶解性較好，當(dāng)pH 值為6 時(shí)溶解性最低（P＜0.05），為（23.29±1.58）%，這是由于等電點(diǎn)處在pH6 左右。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)分子間會(huì)聚集而發(fā)生沉降，導(dǎo)致溶解度降低[35]，這與楊恒[28]研究中雞肺膠原蛋白在等電點(diǎn)附近溶解度最小，偏離等電點(diǎn)溶解度增大的結(jié)果一致。

2.3.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性

pH 值對(duì)CBMP 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響如圖7所示。

圖7 pH 值對(duì)CBMP 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH on the emulsibility and emulsification stability of camel bone marrow protein（CBMP）

CBMP 的乳化性及乳化穩(wěn)定性隨pH 的增加先降后升，pH 值為6 時(shí)最低（P＜0.05），為（0.50±0.03）m2/g、（60.55±0.29）%，和溶解性表現(xiàn)出相似的曲線圖，在等電點(diǎn)附近乳化性及乳化穩(wěn)定性較差。堿性條件下CBMP 的乳化性及乳化穩(wěn)定性表現(xiàn)較佳[36]。

2.3.3 持水性

pH 值對(duì)CBMP 持水性的影響如圖8所示。

圖8 pH 值對(duì)CBMP 持水性的影響Fig.8 Effect of pH on the water-holding capacity of camel bone marrow protein（CBMP）

當(dāng)pH 值為6 時(shí)CBMP 的持水性最弱（P＜0.05），為（2.78±0.05）g/g，這是由于在等電點(diǎn)附近，蛋白間的相互作用較大，結(jié)合水的能力較小，在pH 值為8～10 時(shí)CBMP 的持水性得到了改善，是因?yàn)殡婋x后蛋白間的相互作用變小，結(jié)合水的能力增大，表現(xiàn)為持水性增強(qiáng)[37]。

2.3.4 持油性

蛋白質(zhì)的吸油性在肉制品、乳制品以及餅干等食品配方及加工中起著非常重要的作用[38]，CBMP 的吸油性為（7.56±0.73）g/g，比駝?wù)频鞍赘?.34 g/g[22]。

2.4 CBMP 抗氧化活性的分析

2.4.1 DPPH·清除能力

DPPH 法普遍應(yīng)用于食品和生物試樣的抗氧化能力，能與氧化劑產(chǎn)生的質(zhì)子結(jié)合在一起，在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度減少[39]。維生素C 與CBMP 對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定結(jié)果如圖9所示。

圖9 CBMP 對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.9 DPPH·scavenging rate of camel bone marrow protein（CBMP）

由圖9 可知，在測(cè)定范圍內(nèi)維生素C 與CBMP 隨著濃度的增加，其清除能力逐漸增強(qiáng)，呈量效關(guān)系。不同濃度的對(duì)照組維生素C 的DPPH·清除率均高于CBMP。在濃度為1 mg/mL 時(shí)，CBMP 的DPPH·清除率最高（P＜0.05），為（53.39±1.09）%，其半抑制濃度IC50是0.75 mg/mL。

2.4.2 ·OH 清除能力

·OH 是體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，能帶給細(xì)胞很大的傷害，因此清除羥自由基是很有必要的[40]，維生素C 與CBMP 對(duì)·OH 清除能力的測(cè)定結(jié)果如圖10所示。

圖10 CBMP 對(duì)·OH 清除率的影響Fig.10 ·OH scavenging rate of camel bone marrow protein(CBMP)

由圖10 可知，維生素C 與CBMP 對(duì)·OH 具有較強(qiáng)的清除能力，且在0～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，清除率均伴隨濃度的升高而逐漸增加，具有濃度依賴性。不同濃度的對(duì)照組維生素C 的·OH 清除率均高于CBMP。在濃度為1 mg/mL 時(shí)，·OH 清除能力最高（P＜0.05），為（40.02±1.17）%，其半抑制濃度IC50是1.46 mg/mL。

2.4.3 總還原能力

蛋白的總還原能力與抗氧化活性之間具有顯著的相關(guān)性[41]，維生素C 與CBMP 對(duì)總還原能力的測(cè)定結(jié)果如圖11所示。

圖11 CBMP 對(duì)總還原能力的影響Fig.11 Total reducing capacity of camel bone marrow protein（CBMP）

由圖11 可知，在濃度0～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)總還原能力強(qiáng)弱與維生素C 和CBMP 的濃度呈劑量關(guān)系，隨著濃度的增加，總還原能力逐漸增強(qiáng)。不同濃度的對(duì)照組維生素C 的總還原能力均高于CBMP。在濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，達(dá)到最大（P＜0.05），為1.11±0.03，表明CBMP 的還原能力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化CBMP 提取工藝，得出提取溫度45 ℃、料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間120 min、提取次數(shù)為2 時(shí)，CBMP 含量達(dá)到（36.56±0.24）%，提取率為（18.26±1.23）%。在最優(yōu)條件下得到的CBMP 具有較好的功能特性及較強(qiáng)的抗氧化活性，pH 值為6 時(shí)溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、持水性最低，分別為（23.29±1.58）%、（0.50±0.03）m2/g、（60.55±0.29）%、（2.78±0.05）g/g，表明等電點(diǎn)在pH6 附近，持油性比駝?wù)频鞍赘?，達(dá)（7.56±0.73）g/g，堿性條件下CBMP 的功能特性較好。CBMP 對(duì)DPPH·、·OH 清除能力IC50值分別為0.75、1.46 mg/mL，濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，總還原能力為1.11±0.03，表明抗氧化活性較強(qiáng)。本研究為CBMP 的綜合利用提供理論基礎(chǔ)，對(duì)動(dòng)物骨新資源產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。