孫靖宇，張風(fēng)姣，唐彩云，鄭霄，劉金光，曲亞男，陳義倫，劉玉茜

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

米糠是稻谷經(jīng)過礱谷、碾磨等工序后所得的副產(chǎn)物，含有豐富的谷維素、植物甾醇、維生素E 和角鯊烯等生物活性物質(zhì)，對預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)血糖、控制肥胖、預(yù)防腫瘤、抗疲勞等均有顯著的效果[1]。然而大部分米糠被用作飼料及焚燒處理，造成了資源浪費。米糠中蛋白質(zhì)含量豐富，與其他谷物蛋白相比，米糠蛋白的營養(yǎng)價值更高，其生物效價為2.0～2.5，與牛奶中酪蛋白相近，優(yōu)于小麥蛋白、玉米蛋白和大豆蛋白等植物蛋白[2]。米糠蛋白主要由球蛋白、清蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白組成，且米糠球蛋白為生理活性蛋白，由單鏈組成，氨基酸組成更加合理[3]，但米糠球蛋白作為米糠蛋白中的鹽溶性成分，水溶性較差，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。研究表明，蛋白質(zhì)糖基化可以改善蛋白的功能性質(zhì)，且美拉德反應(yīng)是一種典型的常用的非酶糖基化方法，其原理為蛋白質(zhì)、肽或氨基酸側(cè)鏈上的游離氨基與還原糖分子末端的羰基縮合發(fā)生反應(yīng)，形成席夫堿并重排為Amadori 或Heyns 產(chǎn)物，通過增加蛋白質(zhì)表面羥基數(shù)量，改變了蛋白質(zhì)構(gòu)象及組分，改善了蛋白穩(wěn)定性、溶解性等功能性質(zhì)[4-6]，并且美拉德反應(yīng)溫和有效，常被用于蛋白質(zhì)糖基化改性當(dāng)中。通過美拉德反應(yīng)進(jìn)行糖基化改性有干熱法和濕熱法兩種。與濕熱法相比，干熱法反應(yīng)條件較為溫和，溫度適度可控，且糖基化產(chǎn)物顏色較淺，因此在蛋白的糖基化修飾中應(yīng)用較為廣泛[7]。殼寡糖作為殼聚糖的降解產(chǎn)物，具有分子量低、黏度小、水溶性好等特點，有抗菌、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種功能特性，且比殼聚糖更易發(fā)生美拉德反應(yīng)[8]。許多研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖通過美拉德反應(yīng)接枝到蛋白上改善了蛋白質(zhì)的溶解度、熱穩(wěn)定性和乳化性能[9]。因此，殼寡糖因其無毒、可生物降解等特點，在通過美拉德反應(yīng)修飾蛋白方面的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。

研究表明，植物多酚可以與蛋白質(zhì)相互作用，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象，如兒茶素與大豆分離蛋白相互作用后，分子無序性增加，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊相對含量下降，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量增加[10]。綠原酸能與重組大豆種子鐵蛋白（rH-2）發(fā)生相互作用，引起鐵蛋白三級/四級結(jié)構(gòu)的變化，而對其一級/二級結(jié)構(gòu)無影響[11]。蛋白與多酚相互作用也能改善蛋白質(zhì)的功能特性。阿魏酸與亞麻籽分離蛋白相互作用后，改善其熱穩(wěn)定性及抗氧化活性[12]。因此蛋白質(zhì)和多酚廣泛運用于食品加工中，并且它們之間的相互作用是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和多酚抗氧化活性主要因素。在相互作用過程中，共價結(jié)合和非共價結(jié)合是相互作用的兩種主要機制，且非共價相互作用因反應(yīng)條件溫和在食品體系中更為常見，主要包括疏水相互作用、范德華力、氫鍵和靜電吸引力等[10]。通過美拉德反應(yīng)進(jìn)行糖基化或與多酚非共價結(jié)合是改善蛋白質(zhì)性質(zhì)的有效方法。之前的研究報道了更多關(guān)于二元和三元復(fù)合物對蛋白質(zhì)修飾的研究，而對同時與兩種多酚非共價結(jié)合的研究較少，且同時利用糖基化和與兩種多酚非共價結(jié)合對蛋白進(jìn)行修飾的應(yīng)用也鮮有研究。因此，本研究使用殼寡糖通過干法美拉德反應(yīng)對米糠球蛋白進(jìn)行糖基化修飾，并研究糖基化蛋白與兩種多酚（槲皮素、白藜蘆醇）的非共價作用，通過熒光光譜、紅外、粒徑和抗氧化性等進(jìn)行表征和分析，以期為糖基化蛋白-多酚復(fù)合物的制備及擴大米糠蛋白在食品的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠：江西清河油脂有限公司；殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）：陜西鳳棲梧生物科技有限公司；槲皮素（quercetin，QR）、白藜蘆醇（resveratrol，RES）、胃蛋白酶（350 NFU/mg）、胰蛋白酶（250 NFU/mg）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白電泳分子量Marker、甘氨酸（glycine，Gly）、福林酚、溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、2，2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、考馬斯亮藍(lán)R-250：北京索萊寶生物科技有限公司；1-苯胺基萘-8-磺酸（1-aminonaphthalene-8-sulfonic acid，1，8-ANS）：賽默飛世爾生物制品有限公司；2，2-二苯基-1-基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：東京化成工業(yè)株式會社；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL16M 臺式高速冷凍離心機：長沙英泰儀器有限公司；Thermo Scientific Lumina 熒光磷光分光光度計、Nicoletis5 傅立葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技公司；SpectraMax M5 酶標(biāo)儀：上海美谷分子儀器；JY300 垂直電泳槽：上海天能科技有限公司；200PC 差示掃描量熱儀：德國耐馳儀器制造有限公司；Zetasizer-Nano-ZS 激光納米粒度分析儀：英國Malvern 公司；Universal Hood lll 凝膠成像儀：美國Bio-Rad 公司；JEM-1200EX 掃描電子顯微鏡：日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米糠球蛋白制備及表征

采用Osborne 分級提取蛋白質(zhì)的方法提取米糠球蛋白[3]，向脫脂米糠中加入10 倍體積的2% 氯化鈉溶液，室溫條件下攪拌8 h 后，在4 ℃條件下6 000 r/min離心15 min 取上清液，調(diào)節(jié)等電點至4.0。離心15 min（4 ℃，6 000 r/min）后取沉淀，并用蒸餾水洗滌3 次，所得的沉淀即為米糠球蛋白。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）表征所提取的米糠球蛋白[13]。將凍干的蛋白樣品溶于1 mg/mL磷酸鹽緩沖液中（0.05 mol/L，pH7）。電泳的濃縮膠和分離膠凝膠濃度分別為5%和15%。上樣緩沖液與樣品以1∶1（體積比）稀釋，充分混勻后沸水浴5 min，冷卻后上樣。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Marker 作為參照，以120 V恒壓進(jìn)行電泳試驗。待電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色，并用蛋白質(zhì)凝膠成像儀進(jìn)行拍照。

1.3.2 米糠球蛋白-殼寡糖糖基化蛋白的制備及表征

按照文獻(xiàn)[7]的方法，將一定質(zhì)量的米糠球蛋白溶解于0.05 mol/L、pH7 的磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebuffered saline，PBS）中，微調(diào)蛋白溶液至pH7，配制得到10 mg/mL 的蛋白液。將米糠球蛋白溶液與殼寡糖以質(zhì)量比2∶1 混合，磁力攪拌20 min 使其充分混勻，倒入培養(yǎng)皿中置于-80 ℃預(yù)凍。將預(yù)凍好的米糠球蛋白-殼寡糖混合液放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥，制備好的樣品放入干燥器中恢復(fù)至室溫。取制備好的米糠球蛋白-殼寡糖混合物置于密閉容器中，將干燥好的樣品放置在康威皿（用飽和KBr 溶液維持容器中相對濕度79% 左右）中，在45 ℃的條件下反應(yīng)2 h 得到米糠球蛋白-殼寡糖糖基化蛋白。最后將制備好的糖基化蛋白粉末置于-20 ℃中備用。

SDS-PAGE 表征方法同1.3.1。

1.3.3 掃描電鏡

將凍干的米糠球蛋白及糖基化蛋白粘貼在掃描電鏡觀察臺上，并用離子濺射鍍膜儀對蛋白進(jìn)行噴金處理。采用加速電壓為20 kV，放大1 500 倍的掃描電子顯微鏡放大觀察米糠球蛋白和糖基化蛋白的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)[13]。

1.3.4 抗消化性

模擬胃液的制備：用5 mL 鹽酸溶液（pH2.0）溶解16 mg 胃蛋白酶，得到模擬胃液。然后分別將40 μL 的2 mg/mL 米糠球蛋白和糖基化蛋白樣品與200 μL 模擬胃液混合，在37 ℃下反應(yīng)2 h，模擬胃消化。反應(yīng)結(jié)束后，加入60 μL 的0.001 mol/L 氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)。同時模擬腸道消化，向5 mL 的PBS 緩沖液（0.05 mol/L，pH7.0）中加入50 mg 胰蛋白酶制備得到模擬腸液。然后將40 μL 蛋白質(zhì)樣品和200 μL 模擬腸液混合，在37 ℃水浴下孵育2 h，沸水浴中加熱5 min 終止反應(yīng)。最后，通過SDS-PAGE 分析研究蛋白質(zhì)對胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的穩(wěn)定性。以未進(jìn)行消化的米糠球蛋白作為對照樣品進(jìn)行分析[14]。

1.3.5 熒光光譜分析

將米糠球蛋白、米糠球蛋白+殼寡糖混合物及糖基化蛋白稀釋到相同的蛋白質(zhì)濃度，使用熒光磷光分光光度計測量熒光強度，激發(fā)波長設(shè)置為290 nm，在激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm 的情況下，在300～500 nm處測量熒光強度。

1.3.6 糖基化蛋白與槲皮素、白藜蘆醇的非共價作用

參照Zheng 等[15]的方法，用熒光磷光分光光度計檢測由槲皮素和白藜蘆醇引起的糖基化蛋白的熒光強度變化。向3 mL 的糖基化蛋白溶液（溶于0.05 mol/L，pH7.0 PBS 中，蛋白濃度1 mg/mL）中分別添加槲皮素（5 mg/mL）和白藜蘆醇（5 mg/mL）及同時添加槲皮素白藜蘆醇（5 mg/mL 槲皮素與白藜蘆醇，質(zhì)量比為1∶1）[蛋白質(zhì)與槲皮素（或與白藜蘆醇，或與槲皮素白藜蘆醇）=1∶0.005、1∶0.01、1∶0.02、1∶0.03、1∶0.04、1∶0.05，質(zhì)量比]反應(yīng)10 min 后測定熒光強度。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。激發(fā)波長為290 nm，在300～500 nm范圍內(nèi)掃描。將數(shù)據(jù)根據(jù)以下方程式進(jìn)行擬合，獲得化學(xué)計量位點數(shù)n和結(jié)合常數(shù)K。

式中：n為結(jié)合位點數(shù)；K 為結(jié)合常數(shù)；[P]0為蛋白濃度；[PN]0為多酚濃度；I0和I∞分別為蛋白獨立結(jié)合位點完全飽和時無多酚和有多酚存在時的相對熒光強度。

1.3.7 傅立葉紅外光譜分析

參照Zhao 等[6]的測定方法，將樣品（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）進(jìn)行凍干處理。處理后的樣品采用KBr 法壓片進(jìn)行傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）掃描，測定波數(shù)為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4 cm-1，以KBr作為空白參照。

1.3.8 熱穩(wěn)定性分析

參照Zhao 等[6]的測定方法，取5 mg 樣品（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）放入鋁制品盒中，用空鋁制樣品盒作為空白參比，加蓋壓緊后置于樣品池中，樣品掃描溫度為30～150 ℃，加熱升溫速率為5 ℃/min，控制氮氣流速為10 mL/min，用差示掃描熱量儀測定其變性溫度及熱焓值變化。

1.3.9 粒徑分析

參考Zhao 等[6]的測定方法，采用激光納米粒度分析儀測定樣品的粒徑分布。將樣品（0.2 mg/mL 米糠球蛋白溶液、0.2 mg/mL 糖基化蛋白溶液中，分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時添加槲皮素白藜蘆醇，質(zhì)量比均為1∶0.02，溶于0.05 mol/L，pH7.0 PBS 溶液中）過0.45 μm 微孔濾膜，于室溫條件下測量。

1.3.10 體外抗氧化性表征

1.3.10.1 ABTS+·清除能力測定

將ABTS 溶于蒸餾水配成0.007 mol/L 溶液并和濃度為0.002 45 mol/L 的過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，制成ABTS+·溶液，避光放置12～16 h 后用蒸餾水稀釋至A734=0.70±0.02，避光備用。

精確量取500 μL 濃度為2 mg/mL 的樣品溶液（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）于試管中，加入3.5 mL ABTS+·溶液混勻，室溫避光保存30 min 后測定734 nm處吸光值A(chǔ)；以500 μL 蒸餾水作為空白溶液與3.5 mL ABTS+·溶液混合室溫避光靜置30 min，734 nm 下測定吸光值A(chǔ)0。ABTS+·清除能力用清除率（X，%）表示，按照下式計算[6]。

1.3.10.2 DPPH·清除能力測定

精確量取2 mL 濃度為2 mg/mL 的樣品溶液（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）于試管中，加入2 mL 的0.000 1 mol/L DPPH 乙醇溶液混勻，室溫避光保存30 min 后測定517 nm 處吸光值A(chǔ)；以2 mL 樣品與2 mL 乙醇混合溶液作為樣品對照組測得吸光值A(chǔ)x0；以2 mL 蒸餾水與2 mL 的0.000 1 mol/L DPPH 乙醇混合溶液作為空白溶液測得517 nm 吸光值A(chǔ)0。DPPH·清除能力用清除率（Y，%）表示，按照下式計算[6]。

1.3.10.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

精確量取1 mL 樣品溶液（2 mg/mL）（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）于試管中，加入3 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，pH8.2）混勻，放入水浴鍋25 ℃恒溫反應(yīng)20 min 后加入3 mL 焦性沒食子酸溶液（0.007 mol/L，25 ℃），反應(yīng)時間為5 min，最后加入1 mL 濃鹽酸終止反應(yīng)，于325 nm 處測定吸光值A(chǔ)。以樣品溶液不加焦性沒食子酸于325 nm 處測定吸光值A(chǔ)x0；用蒸餾水代替樣品溶液于325 nm 測定吸光值A(chǔ)0。超氧陰離子自由基清除能力用清除率（P，%）表示，按照下式計算[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

所有檢測均進(jìn)行3 次平行試驗，所得結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素分析法分析組間顯著性差異，數(shù)據(jù)處理軟件為SPSS 19.0 和Origin 8.0，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳表征

2.1.1 米糠球蛋白的電泳表征

米糠球蛋白電泳見圖1。

圖1 米糠球蛋白電泳Fig.1 Electrophoretogram of rice bran globulin

如圖1所示，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比，所提取的米糠球蛋（條帶1）白亞基分別在57、53、35 kDa 左右，與已有研究結(jié)果一致[18]，說明米糠蛋白的制備提取成功。提取的蛋白質(zhì)中雜質(zhì)條帶較少，提取的球蛋白純度符合后續(xù)試驗要求。

2.1.2 糖基化蛋白的SDS-PAGE 表征

米糠球蛋白及糖基化蛋白電泳見圖2。

圖2 米糠球蛋白及糖基化蛋白電泳Fig.2 Electrophoretogram of rice bran globulin and glycosylated protein

如圖2所示，采用殼寡糖將米糠球蛋白通過美拉德反應(yīng)糖基化后，米糠球蛋白的分離膠頂部形成分子量較高的多分散帶（條帶2），糖基化蛋白的特征條帶變?nèi)酰砻鳉す烟浅晒εc米糠球蛋白共價結(jié)合，形成二元共軛糖基化蛋白，即生成了更大分子量的化合物，證明糖基化修飾成功。

2.1.3 米糠球蛋白和糖基化蛋白的微觀形態(tài)

采用掃描電鏡觀察米糠球蛋白糖基化前后微觀結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 米糠球蛋白和糖基化蛋白的電鏡Fig.3 Electron micrograph of rice bran globulin and glycosylated protein

如圖3所示，米糠球蛋白呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)緊密。當(dāng)米糠球蛋白與殼寡糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，糖基化蛋白表面變得褶皺，不規(guī)則結(jié)構(gòu)增多，表面變得更加松散。這是由于糖分子的引入在一定程度上改變了原蛋白結(jié)構(gòu)，減少了蛋白質(zhì)的聚集，使蛋白肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，分子擴散[19]。

2.1.4 糖基化蛋白的抗消化性表征

蛋白質(zhì)在胃腸道中的降解耐受性反映了蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性，因此對米糠球蛋白及糖基化蛋白在模擬胃腸道消化環(huán)境下的抗消化性進(jìn)行了電泳表征，結(jié)果如圖4所示。

圖4 米糠球蛋白及糖基化蛋白胃消化、腸消化蛋白電泳Fig.4 Electrophoresis of rice bran globulin and glycosylated protein after gastric and intestinal digestion

如圖4所示，在模擬胃消化中，米糠球蛋白（條帶4）及糖基化蛋白（條帶3）在50～60 kDa 之間的特征條帶幾乎都被水解，但糖基化蛋白30 kDa 的條帶仍部分保留，其原因可能是糖基化過后，殼寡糖覆蓋了球蛋白與胃蛋白酶的結(jié)合位點，降低了消化率。在腸消化過程中，米糠球蛋白（條帶6）和糖基化蛋白條帶（條帶5）的變化無明顯差別，可能是在腸道吸收中胰蛋白酶的結(jié)合位點不受殼寡糖影響，證明糖基化蛋白在胃液里具有一定的抗消化特征，在腸道中可被完全消化。

2.1.5 糖基化蛋白的熒光光譜分析

通過測定米糠球蛋白、米糠球蛋白+殼寡糖混合物及米糠球蛋白-殼寡糖糖基化蛋白的熒光光譜來評估蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5 米糠球蛋白、米糠球蛋白+殼寡糖混合物及糖基化蛋白熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of rice bran globulin，mixture of rice bran globulin and chitooligosaccharide，and glycosylated protein

由圖5 可知，米糠球蛋白+殼寡糖混合物及糖基化蛋白均未改變米糠球蛋白所在350 nm 處的最大吸收峰，最大熒光強度為1 712，與米糠球蛋白相比，米糠球蛋白+殼寡糖混合物及糖基化產(chǎn)物的熒光強度均明顯降低，熒光強度分別降至1 495 和1 134，說明殼寡糖的混入或鍵入均未改變蛋白的一、二級結(jié)構(gòu)，但引起了三、四級結(jié)構(gòu)的改變。此外，糖基化蛋白的熒光強度降幅大于混合物，這可能是美拉德反應(yīng)引起的共價相互作用導(dǎo)致蛋白的色氨酸微環(huán)境和蛋白構(gòu)象發(fā)生了改變，殼寡糖中基團的引入遮蔽了蛋白中的部分色氨酸，進(jìn)而導(dǎo)致熒光淬滅。這與之前的文獻(xiàn)報道一致，即美拉德反應(yīng)引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象[15]。

2.2 糖基化蛋白與多酚的相互作用

2.2.1 熒光淬滅現(xiàn)象

糖基化蛋白與多酚結(jié)合情況見圖6。

圖6 糖基化蛋白分別與白藜蘆醇和槲皮素以及同時添加白藜蘆醇和槲皮素的結(jié)合情況Fig.6 Binding of glycosylated protein with resveratrol or quercetin and simultaneous addition of resveratrol and quercetin

如圖6A、圖6C 和圖6E所示，糖基化蛋白最大吸收峰出現(xiàn)在350 nm 處，其熒光強度隨多酚（槲皮素、白藜蘆醇）質(zhì)量的增加而降低，表明糖基化蛋白與多酚之間存在相互作用，導(dǎo)致靜態(tài)熒光淬滅現(xiàn)象的產(chǎn)生[20]。圖6B、圖6D 和圖6F 分別對單獨添加白藜蘆醇、槲皮素以及同時添加兩種多酚時糖基化蛋白熒光強度變化進(jìn)行了熒光擬合，結(jié)果顯示兩種多酚分別單獨添加時，一個糖基化蛋白分子可結(jié)合0.019 25 個白藜蘆醇分子，結(jié)合常數(shù)為0.001 5（圖6B），且白藜蘆醇的添加使得蛋白的熒光光譜發(fā)生了明顯的紅移（圖6A），表明糖基化蛋白與多元醇白藜蘆醇的非共價結(jié)合使得蛋白質(zhì)的色氨酸殘基暴露于更為極性的環(huán)境中。隨著白藜蘆醇濃度增加，糖基化蛋白紅移越明顯，證實了白藜蘆醇的加入使得糖基化蛋白色氨酸殘基微環(huán)境極性增加[21]。

如圖6D所示，一個糖基化蛋白分子可以結(jié)合0.020 13 個槲皮素分子，結(jié)合常數(shù)為0.004 61。槲皮素對蛋白質(zhì)的結(jié)合較強。同時添加兩種多酚時，其結(jié)合位點數(shù)為0.014 7，結(jié)合常數(shù)為0.002 23。其結(jié)合能力小于單獨的白藜蘆醇和槲皮素分子，這可能與兩種多酚之間的空間位阻有關(guān)。同時與蛋白結(jié)合時兩種多酚之間的相互影響尚且需進(jìn)一步研究。

2.2.2 糖基化蛋白-多酚非共價復(fù)合物的傅立葉-紅外光譜分析

不同復(fù)合物的紅外光譜見圖7。

圖7 不同復(fù)合物的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of different compounds

如圖7所示，與米糠球蛋白相比，糖基化蛋白在—OH 的伸縮振動區(qū)間3 700～3 200 cm-1內(nèi)出現(xiàn)了更寬的吸收峰，糖分子與蛋白共價作用時，殼寡糖引入了更多的羥基接入米糠球蛋白中。此外，糖基化蛋白在糖的特征吸收峰887 cm-1（糖環(huán)中C—H 鍵的彎曲振動）處有新的振動，說明殼寡糖成功鍵合在蛋白上，糖分子與米糠球蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng)[23]。

糖基化蛋白與多酚結(jié)合后酰胺Ⅰ帶峰的位置從1 659 cm-1變成了1 661、1 658 cm-1和1 659 cm-1。可以看出，與多酚結(jié)合之后，蛋白的酰胺Ⅰ帶發(fā)生位移，移動了3～1 cm-1，說明多酚引起了蛋白的構(gòu)象變化[22]。在3 600～3 200 cm-1的范圍內(nèi)出現(xiàn)較強的吸收峰，表明糖基化蛋白與多酚相互作用改變了已有的羥基環(huán)境和氫鍵網(wǎng)絡(luò)，多酚中的羥基可以與氨基酸殘基通過氫鍵作用。進(jìn)一步說明多酚與糖基化蛋白主要是疏水作用及氫鍵等非共價相互作用[15]。

2.2.3 糖基化蛋白-多酚非共價復(fù)合物的熱穩(wěn)定性分析

糖基化蛋白-多酚非共價復(fù)合物的熱穩(wěn)定性分析見圖8 及表1。

表1 不同復(fù)合物的熱性質(zhì)分析Table 1 Thermal property analysis of different compounds

圖8 不同復(fù)合物的DSC 圖譜Fig.8 DSC spectra of different compounds

如圖8 及表1所示，米糠球蛋白經(jīng)過糖基化修飾后，糖基化蛋白的變性溫度由原球蛋白的62.36 ℃增加至69.60 ℃，焓變值由11.80 J/g 增加至15.58 J/g，表明米糠球蛋白與殼寡糖共價鍵合提高了米糠球蛋白的熱穩(wěn)定性。這與Liu 等[24]的報道一致，美拉德反應(yīng)提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。當(dāng)加入多酚后，蛋白質(zhì)與多酚相互作用后進(jìn)一步提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[25-26]。具體表現(xiàn)為分別單獨或共同與兩種多酚槲皮素和白藜蘆醇結(jié)合后糖基化蛋白的變性溫度和焓變值顯著升高。其中，與白藜蘆醇單獨結(jié)合后糖基化蛋白熱穩(wěn)定性最好，變性溫度和焓變值分別為137.33 ℃和48.19 J/g。而同時與兩種多酚非共價結(jié)合次之?？赡苁前邹继J醇的加入顯著增加了糖基化蛋白的極性，通過非共價鍵形成了更緊密、熱穩(wěn)定性更高結(jié)構(gòu)。

2.2.4 糖基化蛋白-多酚非共價復(fù)合物的粒徑變化

米糠球蛋白、糖基化蛋白及糖基化蛋白-多酚非共價復(fù)合物的粒徑如圖9所示。

圖9 不同復(fù)合物的粒徑Fig.9 Particle size of different compounds

如圖9所示，平均粒徑由小到大順序為RBG（373 nm）＜RBG-C（416 nm）＜RBG-C-R（459 nm）＜RBGC-Q（503 nm）＜RBG-C-Q-R（521 nm），米糠球蛋白的粒徑小于糖基化蛋白以及糖基化蛋白-多酚非共價復(fù)合物，原因可能是美拉德反應(yīng)主導(dǎo)的糖基化以及蛋白與多酚之間的相互作用力如氫鍵、范德華力等增強了蛋白質(zhì)分子之間的聚集，從而使得粒徑增大[27]。當(dāng)同時與兩種多酚結(jié)合時，粒徑最大，可能是兩種多酚與糖基化蛋白結(jié)合位點的不同導(dǎo)致蛋白分子之間的聚集更強，其機理有待進(jìn)一步研究。

2.2.5 糖基化蛋白-多酚非共價復(fù)合物的體外抗氧化性分析

米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白-多酚非共價復(fù)合物的體外抗氧化能力如圖10所示。

如圖10所示，所有糖基化復(fù)合物自由基清除能力均高于米糠球蛋白，這與之前的研究結(jié)果一致，即糖基化可以提高蛋白的抗氧化活性，這與美拉德反應(yīng)中糖基化蛋白的氫和/或電子貢獻(xiàn)有關(guān)[28]。與多酚結(jié)合后，發(fā)現(xiàn)與白藜蘆醇結(jié)合后抗氧化能力最強，原因可能是白藜蘆醇本身抗氧化性強于槲皮素[29-30]。當(dāng)與兩種多酚結(jié)合時，其抗氧化能力介于糖基化蛋白單獨結(jié)合槲皮素和單獨結(jié)合白藜蘆醇之間。

3 結(jié)論

本研究通過美拉德反應(yīng)對米糠球蛋白進(jìn)行了糖基化修飾，提高了其抗消化性和抗氧化性。糖基化蛋白可同時與兩種多酚發(fā)生非共價結(jié)合，其結(jié)合能力介于糖基化蛋白分別單獨結(jié)合槲皮素和單獨結(jié)合白藜蘆醇之間。糖基化蛋白同時與兩種多酚非共價結(jié)合后其粒徑最大，其熱穩(wěn)定性及抗氧化能力介于糖基化蛋白單獨結(jié)合槲皮素和單獨結(jié)合白藜蘆醇之間。本研究為擴大糖基化蛋白與兩種及以上多酚的非共價復(fù)合物的研究及應(yīng)用提供了一定的理論支持。