安曼云

（云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，云南 昆明 650000）

西藏杓蘭（Cypripedium tibeticumKing ex Rolfe）屬蘭科（Orchidacaea）植物，分布于中國西藏、云南、四川、甘肅、陜西等地。西藏杓蘭具有較高的觀賞及藥用價(jià)值，其原生種群數(shù)量逐年減少，已成為野生瀕危植物［1-3］。由于杓蘭屬植物種子自然萌發(fā)率和幼苗成活率極低，限制了其人工栽培和繁育工作，杓蘭保育研究已迫在眉睫［4］。

研究表明，菌根是自然界中普遍存在的一種共生現(xiàn)象，蘭科植物與土壤中的菌根真菌共生，可形成蘭科菌根［5-6］。杓蘭屬植物是典型的蘭科菌根真菌共生植物，其種子萌發(fā)、生長發(fā)育等各階段都需要與菌根真菌建立共生關(guān)系［7］。目前，對于杓蘭屬植物菌根的研究主要集中在解剖結(jié)構(gòu)特征、真菌多樣性、共生關(guān)系等方面。權(quán)嬌嬌等［8］研究發(fā)現(xiàn)黃花杓蘭（Cypripedium flavumP. F. Hunt et Summerh）菌根真菌類型豐富多樣，涉及6個(gè)菌屬的真菌，膠膜菌屬為優(yōu)勢菌群。高倩等［9］研究發(fā)現(xiàn)4種杓蘭的生長周期中，其菌根真菌的入侵-消解呈現(xiàn)出周期規(guī)律，杓蘭利用真菌菌絲消解后的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行混合營養(yǎng)。徐玲玲等［10］研究了環(huán)境變化對杓蘭屬植物菌根真菌區(qū)系組成的影響，表明在同一棲息地，杓蘭對菌根真菌的偏好性顯著影響其菌根真菌群落結(jié)構(gòu)；此外，隨著海拔的升高，西藏杓蘭菌根真菌多樣性減少。楊前宇等［11］研究表明菌根真菌可以促進(jìn)蘭科植物幼苗的生長。

已有的研究表明菌根真菌與杓蘭屬植物之間具有較強(qiáng)的互作規(guī)律，在不同生長時(shí)期和不同生境條件下真菌種類和多樣性存在差異。然而，西藏杓蘭菌根真菌多樣性水平及其促生作用的研究未見報(bào)道。故本研究采用微生物純培養(yǎng)方法檢測了滇西北4個(gè)不同居群的西藏杓蘭菌根真菌組成及多樣性水平，掌握不同真菌類型對種子和幼苗的共生促生作用，為西藏杓蘭的繁育及保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集地點(diǎn)位于滇西北香格里拉縣天生橋區(qū)域，海拔3 370 m。西藏杓蘭（C. tibeticum）生于林緣，為腐殖質(zhì)土壤生境。4個(gè)居群樣地分布數(shù)量為20 ～ 50 株/100 m2。西藏杓蘭根部樣品采集：2020年6月份，每個(gè)居群隨機(jī)選取20株，每株不同分布方向選取10個(gè)毛根段；種子采集：2020年10月份進(jìn)行蒴果采集，置于4℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌根真菌分離

采用組織塊分離方法進(jìn)行菌根真菌的分離與純化，培養(yǎng)基分別采用馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。根據(jù)形態(tài)特征和ITS擴(kuò)增測序進(jìn)行菌根真菌的種屬確定。按以下公式統(tǒng)計(jì)分離率、分離頻率和相似性指數(shù)。

式中：a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數(shù)量；b為分離樣品組織塊總數(shù)。

式中：a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數(shù)量；b為分離的真菌菌株數(shù)量。

式中：j為兩個(gè)樣地共有種數(shù)；a是一個(gè)樣區(qū)的植物樣本中真菌種數(shù)；b是另一個(gè)樣區(qū)的植物樣本中真菌種數(shù)。

1.2.2 西藏杓蘭種子共生萌發(fā)試驗(yàn)

1.2.2.1 種子活力檢測

采用TTC染色法（Triphenyl tetrazolium chloride）對西藏杓蘭種子進(jìn)行活性檢測，按以下公式統(tǒng)計(jì)種子胚活力。

1.2.2.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

采用無菌水制備西藏杓蘭種子懸浮液，取等量懸浮液種子于Harvais培養(yǎng)基上。將7株（從7個(gè)菌屬中分別選取一株）供試菌塊（0.5 cm × 0.5 cm）分別接種于培養(yǎng)瓶中，以不接菌的6瓶為對照組，每種菌3個(gè)重復(fù)。每7 d進(jìn)行生長情況觀察，20周后進(jìn)行種子萌發(fā)過程檢測。

1.2.3 西藏杓蘭幼苗共生生長試驗(yàn)

通過改良的培養(yǎng)基進(jìn)行西藏杓蘭無菌幼苗的培養(yǎng)，選取大小一致的無菌幼苗并準(zhǔn)確稱量后移入到培養(yǎng)瓶中（采用Harvais培養(yǎng)基），每瓶6株。分別接入7株供試菌株的菌塊（1 cm × 1 cm）。以不接菌的6瓶做對照組，每種菌做3個(gè)重復(fù)。每10 d進(jìn)行生長情況觀察，60 d后進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)測定。全氮含量采用H2SO4-H2O2-蒸餾法測定；全磷含量采用H2SO4-H2O2-消煮-鉬銻抗比色法測定；全鉀含量采用H2SO4-H2O2-消煮-火焰光度計(jì)法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0、EXCEL 2010和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，不同小寫字母表示差異顯著（P＜ 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏杓蘭菌根真菌菌群的組成

從西藏杓蘭4個(gè)居群的800塊毛根中共分離獲得366株菌根真菌，涉及7個(gè)菌屬（表1）：膠膜菌屬（Tulasnella）、絲核菌屬（Rhizoctoia）、層孔菌屬（Fomes）、毛殼菌屬（Chaetomium）、角擔(dān)菌屬（Ceratobasidium）、伏革菌屬（Corticium）和瘤菌根菌屬（Epulorhiza）。在屬分類水平上，優(yōu)勢菌群為膠膜菌屬，分離率（15.88%）和分離頻率（34.70%）最高，其次是絲核菌屬，最少的為瘤菌根菌屬（分離率1.38%）。說明西藏杓蘭菌根系統(tǒng)中存在豐富多樣的菌根真菌種群。

表1 西藏杓蘭菌根真菌菌群組成Tab. 1 Composition of mycorrhizal fungi from C. tibeticum

2.2 不同居群西藏杓蘭菌根真菌的組成及分離頻率

西藏杓蘭不同居群的菌根真菌組成、優(yōu)勢菌群和分離頻率存在差異（表2）。其中，居群1的菌群組成涉及5個(gè)屬，優(yōu)勢菌群為膠膜菌屬（14.75%）；居群2的菌群組成涉及4個(gè)屬，優(yōu)勢菌群為膠膜菌屬（8.74%）；居群3的菌群組成涉及4個(gè)屬，優(yōu)勢菌群為層孔菌屬（7.38%）；居群4的菌群組成涉及5個(gè)屬，優(yōu)勢菌群為絲核菌屬（8.74%）。說明不同的生境特性對西藏杓蘭菌根真菌菌群的組成影響極大。

表2 西藏杓蘭不同居群菌根真菌的組成及分離頻率Tab. 2 Composition and isolation frequency of mycorrhizal fungi from different C. tibeticum populations

2.3 西藏杓蘭菌根真菌的菌群相似性系數(shù)

從表3可知，在4個(gè)居群中，居群1和居群2的菌群相似性系數(shù)最高（0.70），居群3和居群4的菌群相似性系數(shù)最低（0.44）。說明西藏杓蘭在不同分布地點(diǎn)的菌根真菌菌群表現(xiàn)出一定的相似性，其中膠膜菌屬、絲核菌屬和層孔菌屬為西藏杓蘭菌根真菌的共有真菌。

表3 西藏杓蘭菌根真菌菌群相似性系數(shù)Tab.3 Similarity coefficients of mycorrhizal fungi from C.tibeticum population

2.4 菌根真菌對西藏杓蘭種子萌發(fā)的影響

首先，對西藏杓蘭種子有胚率和活力進(jìn)行了測定，西藏杓蘭種子有胚率為83.85%。經(jīng)過TTC染色法（Triphenyl tetrazolium chloride）檢測，西藏杓蘭種子胚活力為61.37%。進(jìn)一步研究了菌根真菌對西藏杓蘭種子萌發(fā)的影響，結(jié)果圖1所示。7株供試菌株中，5株菌能促進(jìn)西藏杓蘭種子萌發(fā)，表現(xiàn)出不同的促進(jìn)萌發(fā)效果。其中，CT-1-64在10周時(shí)，可促使種子葉原基出現(xiàn)，在15周時(shí)促使第一片葉子出現(xiàn)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的共生萌發(fā)效果。

圖1 菌根真菌對西藏杓蘭種子萌發(fā)的影響Fig. 1 Effect of mycorrhizal fungi on seed germination of C.tibeticum

2.5 菌根真菌對西藏幼苗的促生效果分析

經(jīng)過回接培養(yǎng)后，7株供試菌株均能與幼苗形成共生體系，且在西藏杓蘭根內(nèi)檢測到相應(yīng)的菌株。從圖2可知，菌根真菌均不同程度的促進(jìn)了幼苗的生長。其中，5株菌（CT-1-64、CT-1-28、CT-3-13、CT-4-87和CT-2-06）能顯著促進(jìn)幼苗的鮮重率（P＜ 0.05），而且都能顯著促進(jìn)幼苗對N、P、K元素的吸收（P＜ 0.05）。從7株供試菌株中篩選得到一株高效促生菌株CT-1-64，與其它處理組相比，均顯著提高了西藏杓蘭幼苗的鮮重率和營養(yǎng)元素含量（P＜ 0.05）。

圖2 菌根真菌對西藏杓蘭幼苗鮮重增長率及營養(yǎng)元素的影響Fig.2 Effects of mycorrhizal fungi on the growth rate of fresh weight and the content of nutrients in seedlings of C. tibeticum

3 討論

3.1 杓蘭菌根真菌多樣性水平

西藏杓蘭是典型的蘭科菌根植物，本研究采用組織塊分離法研究了西藏杓蘭菌根真菌在不同居群環(huán)境中的變化，結(jié)果表明西藏杓蘭存在豐富多樣的菌根真菌類型，涉及7個(gè)菌屬的真菌：膠膜菌屬、絲核菌屬、層孔菌屬、毛殼菌屬、角擔(dān)菌屬、伏革菌屬和瘤菌根菌屬。目前研究已知，與蘭科植物共生的菌根真菌主要有擔(dān)子菌門13個(gè)屬（膠膜菌屬、臘殼耳屬、密環(huán)菌屬、伏革菌屬、角擔(dān)菌屬、層孔菌屬等）、子囊菌門的3個(gè)屬（毛殼菌屬、青霉菌屬和微囊菌屬）和半知菌門14個(gè)屬（瘤菌根菌屬、絲核菌屬、念珠菌根菌屬、角菌根菌屬等）［12-13］。本研究獲得的7個(gè)菌屬在蘭科其它植物菌根中已報(bào)道，其中，膠膜菌屬、絲核菌屬和層孔菌屬為西藏杓蘭的優(yōu)勢菌群，且在4個(gè)不同居群中均出現(xiàn)，說明其對西藏杓蘭具有寄主專一性。翟虹宇［14］從西藏構(gòu)蘭、黃花杓蘭和無苞杓蘭（C. bardolphianmW. W. Smith et Farrer）3種杓蘭根部分離得到10個(gè)屬的真菌，其中以膠膜菌屬最多，占總體分離種類的33.3%。付亞娟等［15］研究發(fā)現(xiàn)大花杓蘭（C. macranthumSw.）菌根真菌主要為膠膜菌屬和絲核菌屬。

3.2 杓蘭菌根真菌促進(jìn)種子萌發(fā)

杓蘭屬植物種子萌發(fā)和生長過程中，必須借助于菌根真菌為其提供營養(yǎng)。研究表明，在蘭科種子非共生萌發(fā)時(shí)，在培養(yǎng)基中添加一些營養(yǎng)物質(zhì)可促進(jìn)其萌發(fā)，但萌發(fā)進(jìn)程緩慢［16-17］?；亟泳婢赏ㄟ^把種子胚和基質(zhì)連接起來顯著縮短蘭科種子的萌發(fā)過程，菌絲為胚發(fā)育提供水分、碳水化合物、養(yǎng)分、維生素等物質(zhì)［18］。杓蘭屬植物的種子萌發(fā)對菌根真菌具有較強(qiáng)的依賴性，回接膠膜菌屬菌株可顯著縮短種子的萌發(fā)過程［19］。在本研究中，7株供試菌株中能促進(jìn)西藏杓蘭種子萌發(fā)的有5株，并對其促進(jìn)萌發(fā)效果不同。其中，膠膜菌屬（CT-1-64）表現(xiàn)出較強(qiáng)的共生萌發(fā)效果，能縮短種子萌發(fā)進(jìn)程。

3.3 杓蘭菌根真菌促進(jìn)幼苗生長

蘭科植物一般為肉質(zhì)根，由于較少的側(cè)根和根毛限制了其對土壤中礦質(zhì)元素的吸收，而菌根真菌的菌絲可以吸收礦質(zhì)元素供給宿主植物［20］。菌根真菌可以顯著增加大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）、春蘭［C. goeringii（Rchb. f.） Rchb. F.］等蘭科植物的莖葉干重，且能促進(jìn)其對N、P、K等元素的吸收，兩者間建立一種互惠互利的共生關(guān)系［21-22］。本研究的7株供試菌株均能與西藏杓蘭幼苗形成共生體系，不同程度的促進(jìn)了幼苗的生長。其中，5株菌能顯著促進(jìn)幼苗的鮮重率和其對營養(yǎng)元素（N、P、K）的吸收。西藏杓蘭種子共生萌發(fā)和幼苗生長階段，可與多種真菌建立共生關(guān)系，表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性。此外，在供試的7株菌根真菌中，CT-1-64表現(xiàn)出了較強(qiáng)的共生萌發(fā)及幼苗促生效果，有希望成為杓蘭屬植物繁育中的高效促生菌，其促生機(jī)理有待進(jìn)一步研究。