張慶，李國(guó)旗*，車金鳳，趙長(zhǎng)海

（1.寧夏大學(xué) 西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學(xué) 生態(tài)環(huán)境學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

類黃酮和酚酸物質(zhì)是廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，在多種植物中發(fā)揮重要的作用。例如，類黃酮物質(zhì)能夠控制植物花色的形成［1］，提高植物抵御生物和非生物脅迫的能力等［2］。類黃酮和酚酸作為藥用植物的主要活性成分，具有多種生物功能，對(duì)人體健康有益，如類黃酮等多酚具有抗氧化作用，可改善血管內(nèi)皮功能、胰島素分泌，有降血壓作用［3］。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了酚酸物質(zhì)在心血管、癌癥、糖尿病、炎癥等疾病中的保護(hù)作用［4-5］。

羅布麻（Apocynum venetumL.）為多年生宿根草本植物［6］，于1997年被《中華人民共和國(guó)藥典》收錄，有清熱利濕、平肝安神等功效［7］。羅布麻葉提取物中的主要活性成分為類黃酮物質(zhì)，如蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素、槲皮素、山柰酚等［8-9］。類黃酮和酚酸物質(zhì)含量在不同的羅布麻品種之間差異較大［10］，此外，類黃酮含量還受到生長(zhǎng)環(huán)境和采收季節(jié)等外在因素的影響［11-12］。

LC-MS廣泛靶向技術(shù)結(jié)合了非靶向和靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，可定性、定量和高覆蓋地檢測(cè)植物中代謝物的含量［13］，已廣泛應(yīng)用于各種植物的次生代謝物研究，如鐵皮石斛中黃酮代謝機(jī)理［14］，紫外線對(duì)大豆異黃酮含量的影響［15］，不同葡萄品種在成熟過程中黃酮類化合物的差異研究［16］。然而目前對(duì)羅布麻中類黃酮和酚酸2種物質(zhì)的代謝組學(xué)研究較少，鑒于此，本文擬研究羅布麻和大麻狀羅布麻（Apocynum cannabinumA. DC.）［17］中的類黃酮和酚酸代謝物的種類和相對(duì)含量，分析2種羅布麻之間的代謝物質(zhì)差異，以揭示類黃酮和酚酸的合成途徑，為羅布麻的藥用資源開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品種植及采集

2021年4月于羅布麻試驗(yàn)田挖取繁殖根段，將根段每6個(gè)種植于長(zhǎng)40 cm × 寬30 cm × 高40 cm花盆中，盆底部墊2層紗布，覆蓋的土壤質(zhì)地為林下土 ： 營(yíng)養(yǎng)土（1 ： 1），定期澆水施肥除草松土。待植株長(zhǎng)至30 ～ 40 cm，選取長(zhǎng)勢(shì)良好且高度一致的植株中下部成熟葉片混合，每種植物3個(gè)重復(fù)；置于10 mL凍存管中，并迅速放入液氮中冷凍，之后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。

1.2 樣品提取

將樣品置于凍干機(jī)（Scientz-100F）中真空冷凍干燥，隨后用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨至粉末狀；每種樣品稱取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min將樣品渦旋1次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，之后將樣品混合液置于4℃冰箱過夜；將樣品離心后，吸取上清液，用微孔濾膜（孔徑0.22 μm）過濾并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLCMS/MS分析［18］。質(zhì)控樣本（Quality control samples， QC）制備參照吳宇等［19］的方法，將所有樣品提取液混合成QC樣本，用于分析樣本在相同處理方法下的重復(fù)性。在儀器的分析過程中，QC樣本間隔固定的試驗(yàn)樣本共同進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)序，以檢測(cè)分析過程的重復(fù)性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基于邁維生物技術(shù)有限公司MWDB自建庫(kù)和代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性［20-21］。代謝物定量是利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析完成。將過濾處理后獲得的代謝物質(zhì)數(shù)據(jù)提交到R上進(jìn)行主成分分析（Principal components analysis， PCA）；根據(jù)正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLA-DA）模型分析代謝組數(shù)據(jù)?；贠PLA-DA結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLSDA模型的變量重要性投影篩選2個(gè)品種之間的差異代謝物，篩選標(biāo)準(zhǔn)：選取Fold Change ≥ 2和Fold Change ≤ 0.5且VIP ≥ 1的代謝物。將得到的相應(yīng)差異代謝物提交到KEGG網(wǎng)站進(jìn)行相關(guān)通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品質(zhì)控

對(duì)不同QC質(zhì)譜檢測(cè)分析的總離子流圖（TIC圖）進(jìn)行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測(cè)的重復(fù)性，即技術(shù)重復(fù)。如圖1所示，TIC圖曲線重疊性高，質(zhì)譜峰保留時(shí)間和強(qiáng)度一致，說明儀器穩(wěn)定性較好，檢測(cè)結(jié)果可靠。

圖1 TIC重疊圖Fig.1 TIC overlay diagram

將所獲得的代謝物高分辨二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，在羅布麻和大麻狀羅布麻中共檢測(cè)到194種酚酸物質(zhì)和275種類黃酮物質(zhì)。進(jìn)一步將檢出的類黃酮進(jìn)行分類，包括黃酮醇、黃酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、花青素、黃酮碳糖苷、查耳酮、黃烷醇類、二氫異黃酮10類。

2.2 代謝物多元統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)所有樣本進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖2所示。第一主成分值為56.43%，第二主成分值為14.80%；僅觀察橫坐標(biāo)時(shí)，羅布麻樣品均位于PC1負(fù)半軸，大麻狀羅布麻樣品均位于PC1正半軸。大麻狀羅布麻樣品3與大麻狀羅布麻樣品1、2間存在輕微的分散，而羅布麻的3個(gè)樣品生物學(xué)重復(fù)間的差異較小?？傮w可見，2種羅布麻的代謝物能夠得到區(qū)分，組間差異大于組內(nèi)差異。PCA分析是一種無監(jiān)督的分析方法，缺點(diǎn)是不能忽略組內(nèi)誤差。為排除與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的某些因素引起的代謝變化，應(yīng)用有監(jiān)督的OPLS-DA模型進(jìn)行進(jìn)一步分析［21］。

圖2 2種樣品的PCA得分圖Fig.2 PCA scores plot of two samples

對(duì)2種羅布麻的代謝物進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果如圖3所示。羅布麻和大麻狀羅布麻樣品主要分布置性區(qū)間的右側(cè)和左側(cè)，說明該模型能夠?qū)?種羅布麻樣品進(jìn)行有效區(qū)分。Q2代表模型的預(yù)測(cè)能力，Q2＞ 0.9表明模型具有很好的預(yù)測(cè)能力和可靠性。通過對(duì)2種羅布麻葉片代謝物進(jìn)行OPLS-DA分析可得R2X= 0.582，R2Y= 0.991，Q2= 0.954，說明OPLS-DA模型效果相較于PCA更穩(wěn)定可靠。

圖3 2種樣品的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA scores plot of two samples

2.3 代謝物分析

2.3.1 類黃酮物質(zhì)分析

在2種羅布麻中共檢測(cè)到275種類黃酮物質(zhì)，包括121種黃酮醇類、49種黃酮類、30種二氫黃酮類、16種二氫黃酮醇類、13種異黃酮類、13種花青素、12種黃酮碳糖苷、11種查耳酮、9種黃烷醇類和1種二氫異黃酮類物質(zhì)。羅布麻和大麻狀羅布麻的主要類黃酮代謝產(chǎn)物（每種羅布麻類黃酮物質(zhì)含量前30）如表1 ～ 2所示。對(duì)2種羅布麻中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行歸一化處理，如圖4A所示。羅布麻和大麻狀羅布麻的類黃酮物質(zhì)含量明顯被區(qū)分為兩類，說明類黃酮物質(zhì)含量在2種羅布麻中有明顯差異。

表1 羅布麻中的主要類黃酮物質(zhì)Tab. 1 The main flavonoids in A. venetum

表2 大麻狀羅布麻中的主要類黃酮物質(zhì)Tab. 2 The main flavonoids in A. cannabinum

圖4 代謝物聚類熱圖Fig.4 Cluster heat map of metabolites

2.3.2 酚酸物質(zhì)分析

在羅布麻和大麻狀羅布麻葉片中共檢測(cè)到194種酚酸物質(zhì)，主要的酚酸代謝產(chǎn)物（每種羅布麻酚酸物質(zhì)含量前30）如表3 ～ 4所示。聚類熱圖可以直觀的反應(yīng)2種羅布麻間物質(zhì)含量的差異，對(duì)檢測(cè)到的所有酚酸物質(zhì)進(jìn)行聚類分析，如圖4B所示，酚酸物質(zhì)含量在2種羅布麻中有明顯差異。

表3 羅布麻中的主要酚酸物質(zhì)Tab. 3 The main phenolic acids in A. venetum

表4 大麻狀羅布麻中的主要酚酸物質(zhì)Tab. 4 The main phenolic acids in A. cannabinum

2.4 差異代謝物篩選分析

基于OPLS-DA結(jié)果，根據(jù)差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異代謝物，共得到124種差異顯著代謝物質(zhì)，其中包括類黃酮80種，酚酸44種。在大麻狀羅布麻中，51種類黃酮物質(zhì)含量高于羅布麻，差異最大的為染料木素-8-C-葡萄糖苷；在羅布麻中，29種類黃酮物質(zhì)含量高于大麻狀羅布麻，差異最大的為黃柏環(huán)合苷。在大麻狀羅布麻中，22種酚酸物質(zhì)相對(duì)含量高于羅布麻，差異最大的為4-O-β-D-葡萄糖基-4-香豆酸；在羅布麻中，22種酚酸物質(zhì)含量高于大麻狀羅布麻，差異最大的為1-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖。根據(jù)以上分析結(jié)果，我們認(rèn)為染料木素-8-C-葡萄糖苷、黃柏環(huán)合苷、4-O-β-D-葡萄糖基-4-香豆酸和1-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖可作為鑒別這2種羅布麻品種的關(guān)鍵物質(zhì)。

2.5 代謝通路分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)2個(gè)品種羅布麻間的差異代謝物進(jìn)行注釋，并進(jìn)行功能富集，結(jié)果如圖5所示，富集分析共標(biāo)注到10個(gè)代謝通路中，分別是泛醌和其他萜類奎寧的生物合成、酪氨酸代謝、芪類，二芳基庚烷和姜酚的生物合成、苯丙烷生物合成、代謝途徑、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、次級(jí)代謝物生物合成、輔酶因子生物合成和花青素生物合成。這些差異代謝物參與一個(gè)或多個(gè)代謝途徑，如：忍冬苷、白麻苷和槲皮苷等均參與了黃酮和黃酮醇生物合成；根皮苷查耳酮和黃顏木素等參與了類黃酮生物合成；芥子酰蘋果酸和1-O-芥子酰-D-葡萄糖等參與了苯丙烷生物合成；龍膽酸和紅景天苷等參與了酪氨酸代謝途徑；反式-5-O-對(duì)香豆酰莽草酸和5-O-咖啡酰莽草酸參與了苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成、芪類，二芳基庚烷和姜酚生物合成、代謝途徑和次級(jí)代謝物生物合成；表兒茶素和花旗松素參與了類黃酮合成、代謝途徑和次級(jí)代謝物生物合成。

圖5 差異代謝物KEGG富集通路Fig.5 Enriched KEGG pathways of differentially expressed metabolites

對(duì)差異代謝物KEGG代謝途徑進(jìn)行注釋，結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)大部分代謝物富集到黃酮和黃酮醇生物合成、類黃酮生物合成和苯丙烷生物合成這3條途徑中。大麻狀羅布麻中的木犀草苷、白麻苷、蘆丁、煙花苷、忍冬苷、槲皮素-3-O-桑布雙糖苷、反式-5-O-對(duì)香豆酰莽草酸、5-O-咖啡酰莽草酸和對(duì)香豆醇含量均高于羅布麻，羅布麻中的根皮苷和黃顏木素含量高于大麻狀羅布麻。類黃酮物質(zhì)因具有抗氧化、清除自由基和抑菌等藥用價(jià)值而受到廣泛關(guān)注，一定程度上可認(rèn)為這3條代謝途徑對(duì)于羅布麻的藥用價(jià)值具有重要意義，代謝通路中涉及到的差異代謝物可作為區(qū)分2種羅布麻藥用成分差異的重要依據(jù)。

圖6 差異代謝物的生物合成途徑Fig.6 Biosynthetic pathways of differential metabolites

3 討論

植物代謝組學(xué)具有覆蓋范圍廣、靈敏度高和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法可揭示不同植物品種的代謝組分差異［23-24］。在本研究中，利用LCMS廣泛靶向代謝組檢測(cè)技術(shù)分析了2個(gè)羅布麻品種中的類黃酮和酚酸代謝物的種類和差異，共檢測(cè)出275種類黃酮和194種酚酸物質(zhì)。檢測(cè)到的代謝物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它檢測(cè)方法［25］，表明LC-MS代謝組測(cè)序技術(shù)更為靈敏，是鑒定藥用植物活性成分的有力工具，為藥用植物研究提供了新思路和新方法。

《中國(guó)藥典》以槲皮素和山柰酚為對(duì)照品，金絲桃苷為測(cè)定指標(biāo)，用薄層色譜法來鑒別供試品［7］。石秋梅等［26］通過比較羅布紅麻和羅布白麻葉中的蘆丁、金絲桃苷及異槲皮苷這3種類黃酮成分含量的差異，評(píng)價(jià)了這2種羅布麻的功效。而在本研究中，2種羅布麻的這3種物質(zhì)含量無顯著差異，用中國(guó)藥典質(zhì)量控制法來鑒別這2種羅布麻存在一定局限性。我們通過LC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)染料木素-8-C-葡萄糖苷、黃柏環(huán)合苷、4-O-β-D-葡萄糖基-4-香豆酸和1-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖的含量在2種羅布麻中差異顯著，因此我們將這4種物質(zhì)作為鑒別羅布麻和大麻狀羅布麻的關(guān)鍵物質(zhì)。

次級(jí)代謝物的積累不僅受環(huán)境因素的影響，如溫度、光線、水和礦物質(zhì)等，還受到基因型的影響，如物種、菌株和品種等［27-29］。本研究對(duì)2種羅布麻中差異顯著的代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大麻狀羅布麻中有51種類黃酮和22種酚酸物質(zhì)含量高于羅布麻，29種類黃酮和22種酚酸物質(zhì)含量低于羅布麻。說明2種羅布麻在代謝成分上相似，但在含量上有一定區(qū)別，這與Chan等［30］發(fā)現(xiàn)羅布麻和白麻2個(gè)品種的黃酮類化合物化學(xué)成分和含量存在差異這一結(jié)果一致。類黃酮類化合物被認(rèn)為是應(yīng)對(duì)各種非生物脅迫的保護(hù)性物質(zhì)，可以防止、抑制和清除活性氧的生成，減輕氧化損傷［31］。秦雯婷等［32］研究了不同耐旱性品種大豆在干旱脅迫下異黃酮含量的變化，發(fā)現(xiàn)耐旱品種中異黃酮含量高于敏感品種。本實(shí)驗(yàn)組前期研究發(fā)現(xiàn)，大麻狀羅布麻較羅布麻抗旱能力更為突出［33］，推測(cè)這可能與類黃酮物質(zhì)含量積累有關(guān)。

羅布麻葉的主要活性成分為類黃酮物質(zhì)，在人機(jī)體中起著重要作用。羅布麻中山柰酚和槲皮素等具有顯著的抗抑郁活性［34］；金絲桃苷、蘆丁和槲皮素的巫山神茶可以預(yù)防小鼠食道癌［35］；含有蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素、楊梅素、槲皮素和山柰酚的羅布麻干葉提取物有心臟保護(hù)作用［36］。在大麻狀羅布麻中檢測(cè)到金絲桃苷、山柰酚、蘆丁、槲皮素和異槲皮素的含量與羅布麻無顯著差異，說明大麻狀羅布麻中的藥用成分含量與羅布麻相似，有作為藥用植物的可能。本研究中，2種羅布麻類黃酮和酚酸物質(zhì)基本相似，可能具有相似的生物活性。后續(xù)可進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，挖掘大麻狀羅布麻的藥用價(jià)值及進(jìn)一步開發(fā)利用羅布麻的藥用資源。