朱國霞 羅家勝 張霞婧 吳永翔

(1.西安市人民醫(yī)院·西安市第四醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710004;2.西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院,陜西 西安 710004; 3.新疆軍區(qū)總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,新疆 烏魯木齊 830099)

Bmi1是一種Polycomb group(PcG)蛋白,其參與H2A泛素化相關(guān)轉(zhuǎn)錄沉默[1],且在很多種腫瘤中異常增高[2]。Bmi1(-/-)小鼠食管癌的輻射敏感性增加,以及細(xì)胞活力顯著抑制,這可能導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞比例增加,并通過抑制PI3K/Akt信號通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。在鼻咽癌CNE2細(xì)胞株中通過轉(zhuǎn)染慢病毒重組載體來敲低Bmi1表達(dá)可提高細(xì)胞的放射敏感性[4]。研究發(fā)現(xiàn)Bmi1在同源重組(HR)修復(fù)DNA雙鏈斷裂中的作用中促進(jìn)DNA末端切除;機制上,Bmi1通過促進(jìn)CtIP的募集介導(dǎo)DNA末端切除,從而使RPA和RAD51在DNA損傷部位積累[5]。Bmi1在耳蝸的生理和病理情況也有相關(guān)研究。Bmi1通過Wnt信號通路啟動新生小鼠耳蝸支持細(xì)胞(Supporting cells,SCs)和lgr5陽性祖細(xì)胞的增殖程序[6]。在耳蝸螺旋韌帶纖維細(xì)胞中,D-半乳糖可能是通過降低Bmi1的表達(dá),使Bmi1抑制p16INK4a表達(dá)的作用減弱,從而促進(jìn)纖維細(xì)胞的衰老[7]。另外,Bmi1(-/-)小鼠體內(nèi)體外耳毒藥物誘導(dǎo)的毛細(xì)胞(Hair cells, HCs)損失顯著增加,以及HCs的自由基和線粒體ROS水平明顯升高,乙酰半胱氨酸(Acetylcysteine,NAC)可以減輕上述藥物所致的損傷[8]。以及在噪聲暴露前予低頻聲預(yù)處理可以提高機體內(nèi)源性抗氧化水平,可一定程度減輕噪聲暴露所致的氧化損傷,且Bmi1-SOD參與了這一過程[9]。那么Bmi1在體外耳蝸器官培養(yǎng)SGNs中起到如何的作用,目前尚少相關(guān)研究。為此本研究使用Bmi1的特異性抑制劑PTC-209誘發(fā)SGNs損傷,進(jìn)而探討其可能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 80只P3新生SD 仔鼠,均購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。動物的領(lǐng)取和使用受到學(xué)校實驗動物倫理委員會的監(jiān)督和管理。

1.2 主要試劑 PTC-209(A specific inhibitor of Bmi1)購自美國Selleckchem公司;谷胱甘肽(glutathione, GSH)購自美國Sigma-Aldrich公司;β-Tubulin購自德國Millipore 公司、美國Abcam公司;二抗驢抗鼠IgG H&L購自美國Life technology公司、美國Abcam公司;MitoSOXTMRed mitochondrial superoxide indicator購自美國ThermoFisher Scientific公司;Hoechst 33258 trihydrochloride 購自美國MCE公司。

1.3 耳蝸器官培養(yǎng)方法

1.3.1 制備鼠尾膠 將90 μL 0.02N CH3COOH、(50×) Collagen gel溶液、10 μL 10× Basal Medium Eagle溶液以及10 μL 2% NaHCO3分別加入無菌離心管。在每個培養(yǎng)皿皿底正中滴入混勻的鼠尾膠,靜置30 min,待膠凝固后,于鼠尾膠周圍加入1 mL無血漿培養(yǎng)基。

1.3.2 SFM培養(yǎng)液制備 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin) 2 g;Serum-free Supplement 2 mL;20%葡萄糖4.8 mL;青霉素G 0.2 g;200 mmol/L 谷氨酰胺2 mL;碳酸氫鈉0.2 g;1X BME190.8 mL。

1.3.3 耳蝸基底膜和螺旋神經(jīng)節(jié)的顯微解剖 將P3仔鼠用酒精消毒、處死,快速取出耳蝸。無菌生理鹽水沖洗后,放置于預(yù)冷的Hank′s液中,在解剖顯微鏡下保留耳蝸基底膜,并于耳蝸底轉(zhuǎn),從 hook region延耳蝸螺旋方向輕柔分離基底膜和螺旋神經(jīng)節(jié),并將分離出的耳蝸基底膜和螺旋神經(jīng)節(jié)組織平鋪于凝固的膠上。將其放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后加入1 mL無血漿培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)過夜。次日在倒置顯微鏡下觀察耳蝸器官有無漂浮或者形態(tài)變化,選擇形態(tài)完整以及貼附良好的作為實驗組。該培養(yǎng)方法技術(shù)成熟,具體步驟據(jù)文獻(xiàn)[10-11]的研究內(nèi)容。

1.4 PTC-209誘導(dǎo)體外培養(yǎng)耳蝸器官損傷模型的建立 PTC-209的儲存濃度為5 mM,用無血清培養(yǎng)液(Serum-free medium,SFM)分別稀釋至10、20、50 μM。取P3仔鼠耳蝸器官,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,每組分別加入對應(yīng)濃度的PTC-209,分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每個時間段均分為四組,第一組:Ctrl組(培養(yǎng)液僅添加SFM);第二組:10 μM PTC-209組;第三組:20 μM PTC-209組;第四組:50 μM PTC-209組。

1.5 GSH預(yù)處理對PTC-209誘導(dǎo)體外培養(yǎng)耳蝸器官損傷的保護(hù)模型的建立 經(jīng)前期的實驗驗證,PTC-209的最終工作濃度為10 μM,作用時間為48 h。此外,在GSH對PTC-209誘導(dǎo)體外培養(yǎng)耳蝸器官損傷的保護(hù)模型,其工作濃度為5 mM。取P3仔鼠耳蝸器官,待耳蝸器官培養(yǎng)穩(wěn)定后,加入GSH在培養(yǎng)箱中先培養(yǎng)1～24 h不等,再經(jīng)PTC-209處理后48 h結(jié)束培養(yǎng)。實驗共分為PTC-209 10 μM組、Pre1 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre1h)組、Pre2 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre2 h)組、Pre4 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre4 h)組、Pre6 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre6 h)組、Pre8 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre8 h)組、Pre12 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre12 h)組、Pre24 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre24 h)組8組。

1.6 機制研究實驗分組 根據(jù)前期的預(yù)實驗,確定損傷模型(PTC-209組),即10μM PTC-209與耳蝸器官共培養(yǎng)48 h;最佳保護(hù)模型(GSH+PTC-209組),即Pre6 h 5 mM GSH對10 μM PTC-209培養(yǎng)48 h。故將實驗分為Ctrl組、GSH組、PTC-209組及GSH+PTC-209組4組,其中Ctrl組耳蝸器官僅使用培養(yǎng)液SFM,GSH組使用SFM稀釋的GSH作為培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。PTC-209組、GSH+PTC-209組培養(yǎng)方法同上。培養(yǎng)結(jié)束后予MitoSOXRed 進(jìn)行組織染色,激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 免疫熒光染色 吸棄培養(yǎng)皿上清,MitoSOX Red mitochondrial superoxide indicator 著染耳蝸活體組織,孵育30 min,0.01 M PBS清洗3次(5 min/次),4%多聚甲醛固定20 min,PBS清洗3次;隨后0.5% Triton X-100,37 ℃打孔10 min,PBS清洗3次。爾后5% BSA封閉液室溫封閉1 h,遂后滴加合適濃度的一抗β-Tubulin(1:200),置于濕盒內(nèi)4 ℃過夜。取片后PBS清洗4次。避光加入稀釋好的二抗驢抗小鼠IgG H&L(1:200),并將切片置于濕暗盒內(nèi)4 ℃過夜。次日PBS清洗4次后,避光加入Hoechst 33258(1:1000)室溫10 min,PBS清洗4次,甘油封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

2 結(jié)果

2.1 PTC-209誘導(dǎo)耳蝸螺旋神經(jīng)元(Spiral ganglion neuronl,SGNs)損傷隨濃度增高和時間延長而加重 用標(biāo)記SGNs和聽覺神經(jīng)纖維(Anditory nervs fibers,ANFs)的β-Tubulin進(jìn)行免疫熒光檢測,結(jié)果提示:PTC-209對SGNs和ANFs的損傷作用呈時間和濃度依賴性,當(dāng)PTC-209低濃度時,如低于20 μM,時間的影響因素對損傷的作用更為顯著;當(dāng)提高PTC-209濃度時,如50 μM,濃度依賴性的作用因素則更為明確。為此,損傷模型(PTC-209)確定為10 μM PTC-209與耳蝸器官共培養(yǎng)48 h。見圖1。

圖1 PTC-209在體外對SGNs和ANFs的損傷作用(n=6)Figure 1 The damaging effect induced by PTC-209 on SGNs and ANFs in vitro注:A.耳蝸SGNs和ANFs數(shù)量隨著PTC-209濃度增加和培養(yǎng)時間延長而逐步減少(比例尺=50 μm); B.PTC-209對耳蝸損傷作用的統(tǒng)計分析。50 μM PTC-209 24 h組與Ctrl組24 h比較,①P<0.05;10、20、50 μM PTC-209 48 h組與Ctrl組48 h比較, ②P<0.01; 10、20、50 μM PTC-209 72 h組與Ctrl組72 h比較, ③P<0.05。

2.2 不同時間預(yù)處理GSH對PTC-209誘導(dǎo)耳蝸SGNs損傷存在差異保護(hù)作用 前期實驗證實10 μM PTC-209 在作用48 h后SGNs有明確損傷,同時在預(yù)實驗中使用5 mM GSH 預(yù)處理體外培養(yǎng)耳蝸器官,發(fā)現(xiàn)不同時間預(yù)處理GSH對10 μM PTC-209誘導(dǎo)SGNs損傷有不同的保護(hù)作用。實驗將8組的ANFs進(jìn)行統(tǒng)計分析,以明確最佳預(yù)處理GSH時間。結(jié)果提示,Pre 6 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM組與其余各組ANFs差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示Pre 6 h 5 mM GSH對10μM PTC-209培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)SGNs和ANFs的損傷有顯著保護(hù)作用。見圖2。

圖2 GSH對10μM PTC-209誘導(dǎo)SGNs和ANFs的損傷有保護(hù)作用(n=6)Figure 2 Pretreatment with GSH had protective effect on SGNs and ANFs induced by 10μM PTC-209注:A.提前6 h預(yù)處理GSH對10 μM PTC-209誘導(dǎo)的損傷呈最佳的保護(hù)作用(標(biāo)尺=100 μm); B.GSH對10 μM PTC-209誘導(dǎo)的損傷保護(hù)作用的統(tǒng)計分析。Pre6 h組與其余各組比較,①P<0.01。

2.3 GSH預(yù)處理和PTC-209誘導(dǎo)耳蝸SGNs ROS的影響 收集四組耳蝸器官行MitoSOXTMRed染色,其中綠色熒光β-Tubulin標(biāo)記SGNs和ANFs,藍(lán)色熒光Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核。結(jié)果提示,Ctrl組、GSH組以及GSH+PTC-209組均未見紅色熒光標(biāo)記的ROS在SGNs和SCs蓄積。PTC-209組紅色熒光標(biāo)記的ROS在該處有大量蓄積。同時對各組ROS的紅色熒光光密度值測定并行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)PTC-209組和Ctrl組、GSH+PTC-209組ROS的紅色熒光光密度值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q=343.5/349.3,P<0.01)。見圖3。

圖3 GSH預(yù)處理和PTC-209對SGNs和ANFs ROS的影響(n=6)Figure 3 Effects of GSH pretreatment and PTC-209 on ROS in SGNs and ANFs注:A.PTC-209誘導(dǎo)ROS在SGNs和ANFs蓄積,而GSH預(yù)處理可明顯減輕ROS蓄積(比例尺=50μm); B.各組耳蝸SGNs ROS熒光光密度值測定及分析。PTC-209組與Ctrl組比較, ①P<0.01; PTC-209組與GSH+PTC-209組比較, ②P<0.01。

3 討論

GSH作為一種廣譜抗氧化劑,其生化結(jié)構(gòu)決定其生物學(xué)特點。GSH分子結(jié)構(gòu)中半胱氨酸側(cè)基團(tuán)上巰基可保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白巰基不被氧化,與自由基結(jié)合,加速自由基的清除,減少自由基對機體的氧化損傷,是GSH抗氧化功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12]。研究[13]表明鑒定/發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)激活SIRT3或谷胱甘肽還原酶,或者增加線粒體GSH水平的化合物在通過模擬能量限制在人內(nèi)耳細(xì)胞對預(yù)防老年性聾的發(fā)生。另有研究[14]認(rèn)為乙酰半胱氨酸通過刺激GSH的產(chǎn)生對順鉑誘導(dǎo)的耳蝸損傷有明確保護(hù)作用。這進(jìn)一步表明氧化還原狀態(tài)的失衡導(dǎo)致氧化產(chǎn)物的蓄積以及隨后發(fā)生的生化級聯(lián)反應(yīng)在聽力損失的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)5 mM GSH 在Pre6 h、Pre8 h 預(yù)處理10 μM PTC-209 共培養(yǎng)48 h對SGNs和ANFs有顯著的保護(hù)作用,即預(yù)處理時間越小或越大于6～8 h,GSH的保護(hù)效應(yīng)越弱,尚存的SGNs和ANFs就越少。為此,分析可能原因為GSH在培養(yǎng)液中維持較高濃度時,便可抵消部分由PTC-209誘導(dǎo)SGN和ANF損傷產(chǎn)生的自由基和ROS,從而達(dá)到最大的保護(hù)效應(yīng)。

回顧文獻(xiàn)[8-9]發(fā)現(xiàn)Bmi1無論在耳蝸HCs還是在SGNs中,其反應(yīng)氧化還原狀態(tài)以及ROS水平。Bmi1(-/-)小鼠耳蝸HCs在體內(nèi)外對耳毒藥物損傷敏感性顯著增加,并進(jìn)一步證實其HCs的自由基和線粒體ROS水平升高導(dǎo)致氧化還原狀態(tài)失衡,進(jìn)而促進(jìn)凋亡的發(fā)生[8]。

在大鼠噪聲暴露前予低頻聲預(yù)處理可提高SGNs Hsp70、Bmi1、FoXO1以及SOD1/2的表達(dá)水平。當(dāng)在體外培養(yǎng)SGNs中過表達(dá)Hsp70時,可進(jìn)一步提高上述分子表達(dá)水平、降低ROS蓄積,因此初步證實Hsp70/Bmi1-FoxO1-SOD參與聲預(yù)處理提高機體內(nèi)源性抗氧化能力的這一過程[9]。本研究中10 μM PTC-209與體外耳蝸器官共培養(yǎng)48 h后,SGNs和ANFs有明顯損傷作用。隨后研究對各組的耳蝸器官進(jìn)行MitoSOX Red染色,發(fā)現(xiàn)PTC-209組SGNs和SCs可見大量ROS蓄積,GSH+PTC-209組均未見ROS蓄積。因此推測,PTC-209作為Bmi1的特異性抑制劑,可能通過抑制Bmi1的表達(dá),促進(jìn)了耳蝸器官局部的氧化還原狀態(tài)失衡的發(fā)生,進(jìn)而引發(fā)SGNs和ANFs的死亡。

Bmi1作為Polycomb群蛋白之一,是抑制基因表達(dá)的表觀遺傳因子,其因促進(jìn)細(xì)胞增殖和減少凋亡參與多種腫瘤的發(fā)生,在生物網(wǎng)絡(luò)受多種分子和信號通路的調(diào)控,其中與PI3K/Akt關(guān)系密切。研究[15]發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K/Akt信號通路增加噪聲引起的暫時性閾移的敏感性,內(nèi)源性PI3K/Akt信號通路被認(rèn)為是內(nèi)耳內(nèi)在的保護(hù)機制。另外,Bmi1通過PTEN-PI3K/Akt-mTOR 信號通路促進(jìn)缺血性心力衰竭的心肌纖維化[16]。在骨肉瘤細(xì)胞中過表達(dá)Bmi1時可通過增加PI3K/AKT活性來提高其對順鉑的耐藥性[17]。在急性髓系白血病中,缺氧暴露通過激活HIF-1α/BMI-1信號通路調(diào)控白血病干細(xì)胞,進(jìn)而調(diào)控PI3K/Akt信號通路和促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程[18]。MiR-15通過PI3K/Akt信號通路靶向調(diào)控Bmi1進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞進(jìn)展[19]。研究[20]顯示Bmi1通過調(diào)控PHLPP(PH結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白磷酸酶)表達(dá)水平來影響AKT的磷酸化水平,即Bmi1缺失導(dǎo)致PHLPP1和PHLPP2表達(dá)增加,pAKT水平降低。

4 小結(jié)與展望

PTC-209和耳蝸器官共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)SGNs和SCs中自由基和ROS大量蓄積,促進(jìn)SGNs和ANFs死亡的發(fā)生,但是調(diào)控機制尚不明確。在后續(xù)研究中,將進(jìn)一步檢測PI3K/Ak的底物p85α、p-Akt (S473)等表達(dá)水平,以及使用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002,深入探索PI3K/Akt信號通路是否參與調(diào)控這一過程。