王振芳，王平東，鄧 慶，葉 金，孫秀蘭，紀(jì) 劍，談 婷，趙 皖，肖理文

（1.中央儲(chǔ)備糧德州直屬庫(kù)有限公司，山東 德州 253000； 2.中儲(chǔ)糧江蘇質(zhì)檢中心有限公司，南京 211155；3.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院糧油質(zhì)量安全研究所，北京 102629；4.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；5.南京微測(cè)生物科技有限公司，南京 210031)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），又名嘔吐毒素，是某些鐮刀菌種產(chǎn)生的幾種真菌毒素之一， 化學(xué)上屬于真菌毒素的毛霉烯家族成員，為極性有機(jī)化合物，屬于B 型毛霉烯， 化學(xué)名稱為12,13－環(huán)氧－3α，7α，15－三羥基單端孢霉－9－烯－8－酮。在其分子中含有3個(gè)與其毒性相關(guān)的游離羥基(－OH)[1]。DON 最重要的物理化學(xué)性質(zhì)之一是其超強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。DON 的毒性作用包括嘔吐和厭食，改變腸道和免疫功能， 減少對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及增加對(duì)感染性和慢性疾病的易感性[2]。 GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》 和GB 2715—2005《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了小麥和小麥粉等制品DON 的允許限量≤1 000 μg/kg。 近年來有學(xué)者對(duì)DON 及其衍生物污染情況進(jìn)行調(diào)查，湖北、安徽、江蘇、 河北4 省脫粒小麥?zhǔn)? 種鐮刀菌毒素的污染較為嚴(yán)重且具有顯著的相關(guān)性。尤其是DON 的檢出率高達(dá)90.3%，45.3%樣品DON 的含量超過國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)1 000 μg/kg，污染較為嚴(yán)重[3]。

目前，常見的DON 的準(zhǔn)確檢測(cè)方法有同位素稀釋液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）[4]、高效液相色譜（HPLC）[5]、氣相色譜（GC）、質(zhì)譜（MS）、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫快速檢測(cè)卡[6]、薄層層析（TLC）等技術(shù)，能夠精準(zhǔn)確定毒素的種類和含量。薄層色譜法由于其操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低和特異性差等特點(diǎn)現(xiàn)已很少采用。 色譜化學(xué)技術(shù)由于對(duì)技術(shù)人員專業(yè)要求高，操作繁瑣機(jī)器設(shè)備昂貴，不適合田間作業(yè)以及大量樣本現(xiàn)場(chǎng)篩選。 韓麗等[7]利用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附原理制作了用于測(cè)定飼料中DON 含量的試劑盒( icELISA)，姚晶等[8]采用膠體金快速定量法檢測(cè)不同水平的小麥及其制品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量， 使用了液相色譜法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證性檢測(cè)， 酶聯(lián)免疫法和膠體金法的檢測(cè)結(jié)果都與HPLC 的檢測(cè)結(jié)果相近， 這些方法相較于HPLC 而言更加適合大批量篩檢以及現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定小麥及其制品中的DON 含量。

本研究利用最新的時(shí)間分辨熒光快速定量檢測(cè)技術(shù)采用稀有元素“銪”作為示蹤物，開發(fā)出一種用于檢測(cè)糧食谷物中的DON 含量的高靈敏度嘔吐毒素時(shí)間分辨熒光快速定量檢測(cè)卡， 以期為糧食行業(yè)快速檢測(cè)提供參考方法。

1 材料和儀器

1.1 主要試劑與耗材

時(shí)間分辨熒光微球， 南京微測(cè)生物科技有限公司；嘔吐毒素單抗，實(shí)驗(yàn)室自制；嘔吐毒素抗原，實(shí)驗(yàn)室自制；嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；硝酸纖維素膜（NC 膜），美國(guó)Millipore 公司；樣品墊（玻璃纖維），美國(guó)奧斯龍；吸水紙，上海金標(biāo)生物科技有限公司；PVC 膠板，上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

FD－600 型熒光定量快速檢測(cè)儀和FD－2200 型檢測(cè)卡恒溫孵育器， 上海飛測(cè)生物科技有限公司；XYZ 3060 劃膜儀，美國(guó)Biodot；峰航劃膜噴金儀和HGS201 可編程切條機(jī)， 杭州峰航科技有限公司；GL－21M 高速冷凍離心機(jī)， 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DHG－9620A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 優(yōu)化C 線劃膜位置

定義硝酸纖維素140 膜（ 140NC 膜）靠近吸水紙端為上端，分別設(shè)置140NC 膜距離上端8 mm、12 mm、16 mm 處依次為C、T1、T2 線。 聯(lián)動(dòng)工藝的C 線位于16 mm 處， 獨(dú)立工藝的C 線位于NC 膜上8 mm 位置處，C 線劃膜液的濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，保持T 線劃膜液濃度0.3 mg/mL 不變，檢測(cè)DON 的定量值濃度點(diǎn)250 μg/kg 的濃度點(diǎn)5 個(gè)平行樣，將檢測(cè)濃度的精密度，即標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比值（CV）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比這兩種工藝對(duì)檢測(cè)卡整體性能的影響。

2.2 噴膜稀釋液的篩選

交聯(lián)劑碳二亞胺（EDC）使用量10 μL/mL，抗體量15 μg/mL，T1 線劃膜液濃度為0.2 mg/mL，T2 線劃膜液濃度為0.1 mg/mL，劃膜稀釋液使用檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液（12 mmol/L，pH 6.4） ，其余各項(xiàng)參數(shù)均保持一致， 甘氨酸–氫氧化鈉緩沖液（12mM，pH 7.35）、Tris－HCl 緩沖液（12 mmol/L，pH 8.02）、硼酸－硼砂緩沖液 （12 mmol/L，pH 7.27）、HEPESNaOH 緩沖溶液（12 mmol/L，pH 8.06）。 用這四種噴膜稀釋液進(jìn)行噴膜并制作成檢測(cè)卡用來檢測(cè)帶值樣本，DON 的含量范圍為600～5 000 μg/kg。 對(duì)比這4種噴膜稀釋液體系所制作的檢測(cè)卡的梯度、 均一性以及準(zhǔn)確度。 篩選出最適合的噴膜稀釋液進(jìn)行EDC使用量、抗體量及T1 線和T2 線劃膜濃度的優(yōu)化。

2.3 劃膜稀釋液的篩選

EDC 使用量10 μL/mL，抗體量15 μg/mL，T1 線劃膜液濃度為0.2 mg/mL，T2 線劃膜液濃度為0.1 mg/mL，噴膜稀釋液使用篩選出來性能較好的硼酸－硼砂緩沖液 （12 mmol/L，pH 7.27），C 線劃膜液為HEPES－NaOH 緩沖液（15 mmol/L，pH 7.4）包含2%蔗糖、1%NaCl 以及0.05%P300 。 T 線劃膜液為以下五種緩沖液且每種緩沖液中包含1%蔗糖、0.15%NaCl 以及0.05%P300。 5 種緩沖液包括MES－NaOH緩沖液 （10 mmol/L，pH 6.5）、Tris－HCl 緩沖液（10mmol/L，pH 7.0）、醋酸－醋酸銨緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0）、HEPES－NaOH 緩沖液 （10 mmol/L，pH 7.4）、硼酸－硼砂緩沖液（10 mmol/L，pH 8.0），對(duì)比這5 種T 線劃膜液制作的檢測(cè)卡的抑制率范圍以及效價(jià)（即：陰性樣本檢測(cè)的熒光值）、靈敏度，選出最適合的劃膜稀釋液進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與因素選擇

根據(jù)高靈敏度嘔吐毒素時(shí)間分辨熒光檢測(cè)試卡在檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本過程中， 確定了EDC 使用量，抗體的使用量，T2 線劃膜濃度以及T1 線劃膜濃度是影響試劑條的效價(jià)和靈敏度的明顯因素， 其中抗體量未完全按照等倍數(shù)選擇， 真菌毒素檢測(cè)中一般抗體量的使用范圍在5～30 μg/mL，為了摸索這一范圍的抗體量對(duì)檢測(cè)卡性能的影響， 故選擇了以下5 個(gè)抗體濃度水平。根據(jù)這4 個(gè)主要因素，EDC 加入量（A）取10、15、20、25、30 μL/mL 這5 個(gè)水平，偶聯(lián)加入的抗體量（B）5、10、15、25、30 μg/mL，T2 線劃膜濃度 （C）0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL 和T1 線劃膜濃度（D）0.01、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL 這五個(gè)水平。 試驗(yàn)因素及水平表如表1 所示。 根據(jù)正交表L25（56）分別進(jìn)行試驗(yàn)。 最后將正交實(shí)驗(yàn)中的五個(gè)水平的最佳選擇組合后制作檢測(cè)卡進(jìn)行性能驗(yàn)證。 以DON 時(shí)間分辨熒光定量檢測(cè)試劑卡的定量值濃度點(diǎn)250 μg/kg 的抑制率作為優(yōu)化目標(biāo)， 篩選出檢出范圍100～3 000 μg/kg 的抑制率為35%～90%、 效價(jià)在20 000 左右的最佳組合。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)

2.5 對(duì)比不同方法檢測(cè)實(shí)際樣本中DON 含量

選取來自國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院、江蘇質(zhì)檢中心以及南京微測(cè)生物科技有限公司的18 個(gè)質(zhì)控樣本，樣本類型覆蓋玉米、小麥以及小麥制品，其中DON 的含量范圍為400～3 000 μg/kg。分別使用高效液相色譜法和高靈敏度嘔吐毒素時(shí)間分辨熒光快速定量檢測(cè)卡檢測(cè)樣本。

3 結(jié)果與討論

3.1 獨(dú)立工藝和聯(lián)動(dòng)工藝的選擇

DON 的定量值250 μg/kg 的濃度點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果的T/C 值如圖1、圖2 所示，獨(dú)立工藝的精密度（CV值）的變動(dòng)范圍為1.79%～5.50%，而聯(lián)動(dòng)工藝的CV值在11.62%～21.84%范圍。 顯然獨(dú)立工藝檢測(cè)效果更佳，此時(shí)C 線的T/C 值CV 最小值為1.8%，C 線的劃膜濃度為0.2 mg/mL。 獨(dú)立工藝的C 值與T1、T2值變動(dòng)是互不影響；聯(lián)動(dòng)工藝的C、T1、T2 值變動(dòng)是相互影響的， 當(dāng)C 值升高時(shí)，T1 和T2 值都是降低的，但是聯(lián)動(dòng)工藝造成它們的變化幅度并不可控。標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的濃度CV 值尚且變化幅度較大， 當(dāng)檢測(cè)實(shí)際樣本時(shí)， 由于基質(zhì)效應(yīng)會(huì)給檢測(cè)結(jié)果造成更大的誤差。 獨(dú)立工藝的C、T1 和T2 值變化趨勢(shì)是同向的，這就使得T/C 值能保持相對(duì)穩(wěn)定。

圖1 獨(dú)立工藝C、T 值及CV 變化

圖2 聯(lián)動(dòng)工藝的C、T 值及T/C 的CV 變化

3.2 噴膜稀釋液的優(yōu)化

用甘氨酸–氫氧化鈉緩沖液 （12 mmol/L，pH 7.35）、Tris－HCl 緩沖液（12 mmol/L，pH 8.02）、硼酸－硼砂緩沖液 （12 mmol/L，pH 7.27）、HEPESNaOH 緩沖溶液（12 mmol/L，pH 8.06）這4 種噴膜稀釋液進(jìn)行噴膜并制作成檢測(cè)卡用來檢測(cè)帶值樣本，DON 的含量范圍為600～5 000 μg/kg。對(duì)比這4 種噴膜稀釋液體系所制作的檢測(cè)卡的梯度、 均一性以及準(zhǔn)確度。 如圖3 所示，4 種噴膜稀釋液對(duì)比結(jié)果顯而易見，其中硼酸－硼砂緩沖液（12 mmol/L，pH 7.27）的噴膜稀釋液體系的帶值樣本T/C 值CV、 濃度CV最小，準(zhǔn)確度達(dá)到95.00%。 因此，優(yōu)選硼酸－硼砂緩沖液（12 mmol/L，pH 7.27）的噴膜稀釋液體系進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同噴膜稀釋液體系的DON 檢測(cè)卡的帶值樣本結(jié)果

3.3 劃膜稀釋液的篩選

DON 標(biāo)準(zhǔn)品的250 μg/kg、5 000 μg/kg 的抑制率以及效價(jià)如圖4 所示，Tris－HCl （10 mmol/L，pH 7.0） 的劃膜液體系制作的檢測(cè)卡的靈敏度（250μg/kg 的抑制率） 最高，250～5 000 μg/kg 抑制率范圍達(dá)到為35.72%～94.8%，但是它的效價(jià)僅有16 576，是這5 種劃膜液體系中相對(duì)較低的一種。 HEPESNaOH（10 mmol/L，pH 7.4）劃膜液體系的檢測(cè)卡效價(jià)為24439，是5 種中相對(duì)較高的一種，靈敏度相對(duì)較低，抑制率范圍為25.78%～91.73%。 醋酸－醋酸銨（10 mmol/L，pH 7.0）、 硼酸－硼砂 （10 mmol/L，pH 8.0）和MES－NaOH（10 mmol/L，pH 6.5）劃膜液體系的效價(jià)分別為19 417、20 978、21 002；抑制率范圍為33.58～93.03、32.21%～92.70%和26.02%～91.04%。 由于本研究主要以開發(fā)一種高靈敏度的檢測(cè)卡為目的，250 μg/kg 的抑制率是主要關(guān)注點(diǎn)， 且效價(jià)15 000～25 000 都是可接受的效價(jià)范圍，通過其它方面的優(yōu)化，可以一定程度提高效價(jià)，因此考慮靈敏度，優(yōu)選Tris－HCl（10 mmol/L，pH 7.0）的劃膜液體系進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同劃膜稀釋液體系的DON檢測(cè)卡的抑制率范圍和效價(jià)

3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)正交表L25（56）進(jìn)行試驗(yàn)安排，試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。ki為因素的效價(jià)之和的平均值，R 為各因素列的極差，公式為R=kimax－kimin。極差R 值的大小代表了各因素對(duì)效價(jià)的影響關(guān)系，R 值越大，該影響因素越重要。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

鑒于沒有考慮因素間的交互作用及誤差等因素，因此需要對(duì)最優(yōu)方案試驗(yàn)驗(yàn)證。 由于T1 線的不同濃度的劃膜液制作的檢測(cè)卡的抑制率相差不大，而雙T 線主要起到增補(bǔ)的效果，需要結(jié)合效價(jià)以及均一性進(jìn)行選擇， 若劃膜濃度過低而檢測(cè)的樣本中DON 含量過低， 會(huì)導(dǎo)致未結(jié)合的抗體無法完全被NC 膜上的抗原截留，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。 通過正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)方案為A4B2C1D4組合。 由于正交試驗(yàn)中， 得出的是每個(gè)單一因素的最佳結(jié)果，250 μg/kg 的抑制率都較低，都在30%以下，故需將最優(yōu)方案A4B2C1D4組合在一起后制作檢測(cè)卡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為定量值濃度點(diǎn)250 μg/kg 的抑制率為39.54%，驗(yàn)證了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.6 主要工藝參數(shù)對(duì)檢測(cè)卡性能的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理的結(jié)果繪制出EDC 用量、 抗體量、T1 線劃膜濃度、T2 線劃膜濃度與效價(jià)之間的相互關(guān)系曲線，如圖5 所示。

圖5 （A） EDC 量對(duì)試劑條效價(jià)和靈敏度的影響；（B）抗體量對(duì)試劑條效價(jià)和靈敏度的影響；（C）T1 線劃膜濃度試劑條效價(jià)和靈敏度的影響；（D）T2 線劃膜濃度試劑條

3.6.1 EDC 用量的影響

如圖5A 所示為EDC 用量和效價(jià)以及定量值濃度點(diǎn)250 μg/kg 的關(guān)系曲線圖。 隨著EDC 含量的增加，檢測(cè)卡的效價(jià)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是關(guān)鍵濃度點(diǎn)的抑制率反而在上升。綜合考慮，宜選用第4 水平下的EDC 添加量為25 μL/mL， 此時(shí)檢測(cè)卡的抑制率能夠達(dá)到27.50%，效價(jià)為17 105。

3.6.2 抗體量的影響

圖5B 所示為抗體量對(duì)檢測(cè)卡的性能的影響，效價(jià)會(huì)隨著抗體量的增加而增加，但抗體量到達(dá)25 mg/mL，效價(jià)基本趨于穩(wěn)定，不再往上升，達(dá)到飽和?？赡苡捎谖⑶虮砻娴聂然鶖?shù)量有限， 即使增加抗體量也無法繼續(xù)與微球上活化后的羧基結(jié)合。 另一方面，可能由于抗體量持續(xù)增加導(dǎo)致空間位阻增大，靈敏度隨著抗體量的增加先增加， 達(dá)到10 mg/mL 后靈敏度會(huì)相應(yīng)地隨之下降。 綜合分析， 選擇抗體量10 mg/mL 對(duì)效價(jià)和靈敏度的性能均能兼顧，此時(shí)定量值濃度點(diǎn)的抑制率為23.10%，效價(jià)為19 471。

3.6.3 T 線濃度對(duì)檢測(cè)卡效價(jià)的影響

如圖5C 所示，T2 線劃膜濃度超過0.15 mg/mL后效價(jià)逐漸趨于穩(wěn)定， 定量值濃度點(diǎn)抑制率隨著劃膜濃度增加而降低，抗原濃度并非越高越好，從節(jié)約成本的角度考慮，T2 線的劃膜濃度為0.05 mg/mL。如圖5D 所示，T1 線的劃膜濃度為0.15 mg/mL，此時(shí)它的效價(jià)為21 878，抑制率為22%。 T1 線的劃膜濃度增加抑制率基本保持不變， 當(dāng)增加到0.2 mg/mL后抑制率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)， 效價(jià)在0.05～0.15 mg/mL的范圍內(nèi)逐漸上升，達(dá)到0.2 mg/mL 反而下降，這可能是由于NC 膜是具有一定比表面積微孔結(jié)構(gòu)的薄膜，抗原通過靜電作用或疏水作用與NC 膜結(jié)合，隨著劃膜濃度的增加，堆疊在NC 膜上的抗原量增加，加樣后在表面活性劑的作用下，抗原又被大量沖走，無法與抗體一一結(jié)合。 其次，劃膜濃度偏低，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)卡整體的均一性較差。 綜合考慮，T1 線劃膜濃度為0.15 mg/mL。

3.7 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

以液相色譜檢測(cè)的結(jié)果作為參考值， 由圖6 可以看出標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線回算檢測(cè)卡檢測(cè)的樣本濃度偏陰的結(jié)果有6 例，偏陽(yáng)的結(jié)果10 例，檢測(cè)值和參考值接近的樣本有2 例。 由于基質(zhì)效應(yīng)需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行調(diào)整。校正曲線后，校正值接近參考值的樣本有10 例。說明采用硼酸－硼砂緩沖液（12 mmol/L，pH 7.27）體系作為噴膜稀釋液，Tris－HCl（10mmol/L，pH 7.0）劃膜液體系、EDC 用量25 μL/mL、抗體量10 μg/mL、T2 線劃膜濃度0.05 mg/mL、T1 線劃膜濃度0.15 mg/mL 制作的高靈敏度嘔吐毒素檢測(cè)卡可大批量、快速、準(zhǔn)確定量被嘔吐毒素污染的糧食谷物。

圖6 檢測(cè)值、校正值與參考值的關(guān)系圖