鄧?yán)螓悾瑒⑶嗳A，周志春，高 凱，駱定會

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311400；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.浙江省臨海市自然資源和規(guī)劃局，浙江 臨海 317000）

松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus病是20 世紀(jì)80 年代初傳入中國的一種毀滅性森林病害，其傳播速度快，防治難度大，危害中國松林面積超180 萬 hm2，其中，馬尾松Pinusmassoniana最易受感染，松材線蟲病對中國馬尾松林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了極大破壞[1]。馬尾松具有速生、耐旱等優(yōu)良特點(diǎn)，松林面積達(dá)804 萬 hm2，是中國南方荒山造林的先鋒樹種[2]。近40 a 的林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐和研究發(fā)現(xiàn)，松樹種間和種內(nèi)不同個體對松材線蟲病的抗性存在較大差異，且馬尾松群體中存在抗病基因型，因此選育抗性品種是當(dāng)前治理松材線蟲病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一[3]。自2001 年開始，中國開展了馬尾松松材線蟲病抗性育種研究，現(xiàn)已收集保存一批抗松材線蟲病馬尾松種質(zhì)資源[4-6]。種質(zhì)資源是遺傳改良的物質(zhì)基礎(chǔ)，種質(zhì)資源收集保存的越多，其群體遺傳多樣性越高，但收集保存的成本也越高。FRANKEL 等[7]提出核心種質(zhì)的概念，即用最小的遺傳資源數(shù)量和最小的遺傳冗余最大限度地代表整個遺傳資源的多樣性。通過構(gòu)建核心種質(zhì)，能最大限度地去除重復(fù)和遺傳關(guān)系較近的種質(zhì)材料，加強(qiáng)現(xiàn)有抗性馬尾松種質(zhì)資源的有效保護(hù)利用，降低管理成本[8]。分子標(biāo)記法是林木遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價(jià)和核心種質(zhì)庫構(gòu)建常用的方法[9-13]。其中簡單序列重復(fù)(SSR)分子標(biāo)記具有多等位基因、共顯性和高度多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，能夠直觀反映不同種質(zhì)間遺傳信息差異，在遺傳育種中得到廣泛應(yīng)用[14]。Lü等[15]利用 SSR 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)研究了桉樹Eucalyptuscloeziana的遺傳多樣性并構(gòu)建了核心種質(zhì)；唐玉娟等[16]利用12 對 SSR 引物對杧果Mangiferaindica種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析并構(gòu)建了分子身份證；HU 等[17]利用 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對獼猴桃Actinidiachinensis的遺傳多樣性進(jìn)行研究，構(gòu)建了獼猴桃核心種質(zhì)。

本研究利用 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對前期篩選獲得的103 份抗松材線蟲病馬尾松種質(zhì)和安徽省林業(yè)科學(xué)研究院審定的高抗良種進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，并基于M 策略和隨機(jī)取樣策略構(gòu)建核心種質(zhì)，通過分析不同構(gòu)建策略的核心種質(zhì)確定抗性馬尾松核心種質(zhì)的最適取樣比例，為抗性馬尾松種質(zhì)資源的合理開發(fā)和利用以及挖掘優(yōu)異基因提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年，在國家馬尾松種質(zhì)資源庫中依據(jù)松脂和抗性的關(guān)系，從1 207 株樹中選擇120 份候選抗性馬尾松無性系，同年在松材線蟲病重災(zāi)區(qū)嚴(yán)重感染林分中收集健康樹242 份，并將所有無性系嫁接保存于浙江省臨海市林業(yè)技術(shù)推廣和場圃旅游服務(wù)總站(28°88′N，121°01′E)。2018—2020 年連續(xù)3 a 高強(qiáng)度對收集區(qū)內(nèi)的候選抗性馬尾松無性系進(jìn)行人工接種松材線蟲測定，篩選存活健康株系，共獲得103 份抗性馬尾松無性系，另取安徽省林業(yè)科學(xué)研究院審定的抗松材線蟲病良種(為目前中國所有的抗松材線蟲病良種)作為對照。合計(jì)114 份，其中浙江37 份、江西26 份、安徽42 份、福建6 份、貴州1 份、廣西2 份。采集抗性樣株幼嫩針葉，在-80 ℃冰箱中保存，各試驗(yàn)材料編號及來源見表1。

表1 材料編號及來源Table 1 Test materials’ number and source

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及SSR 引物信息 馬尾松針葉基因組DNA 采用北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn)的改良CTAB 植物基因組DNA 快速提取試劑盒提取。利用超微量分光光度計(jì)，根據(jù)在260 nm 的吸光度D(260)和D(260)/D(280)確定DNA 樣品的純度和質(zhì)量濃度，經(jīng)檢驗(yàn)合格后的DNA 用TE 溶液或去離子水(滅菌后)稀釋至20～50 mg·L-1，置于-20 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參考董虹妤等[18]和YANG 等[19]使用的馬尾松 SSR 引物，用質(zhì)量濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選條帶清晰且多態(tài)性較高的SSR 引物(圖1)，最終篩選出具有高多態(tài)性引物14 對(表2)，引物序列由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

圖1 引物多態(tài)性檢測圖Figure 1 Primer polymorphism detection diagram

表2 14 對SSR 引物信息Table 2 14 pairs of SSR primer information

1.2.2 SSR-PCR 擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳 利用選取的14 對 SSR 引物對114 份馬尾松DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，設(shè)定本研究的反應(yīng)體系為25.0 μL：2×TaqPlus Master Mix (Nazyme Code：P211-03)12.5 μL，引物F 和R (10 μmol·L-1)各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在Takara PCR Thermal cycler 上進(jìn)行，其程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。所得PCR 產(chǎn)物采用Qsep100 全自動毛細(xì)管電泳核酸分析儀進(jìn)行檢測和基因分型。

1.2.3 遺傳參數(shù)及群體結(jié)構(gòu)分析 利用GenAlex 6.5[20]計(jì)算各位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon’s 多樣性指數(shù)(I)、近交系數(shù)(Fis)、固定指數(shù)(F)和基因流(Nm)，并對收集的抗松材線蟲病馬尾松種質(zhì)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。采用Cervus 2.0[21]獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)。利用Structure 2.3.4[22]對抗性馬尾松種質(zhì)資源進(jìn)行分類，推測最佳聚類組群數(shù)目，確定群體結(jié)構(gòu)，并對各亞群的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)。

1.2.4 核心種質(zhì)構(gòu)建 對抗松材線蟲病馬尾松種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析后，利用Power Core[23]和Core Finder[24]對各亞群基于不同算法構(gòu)建核心種質(zhì)。其中，Power Core 是利用隨機(jī)取樣策略和啟發(fā)式算法，尋找從初始階段到最終階段的最優(yōu)路徑進(jìn)行核心集合選擇；Core Finder 基于NP-完全覆蓋問題，采用拉斯維加斯式(LasVegas-style)隨機(jī)算法的M 策略進(jìn)行樣本選擇。在構(gòu)建核心種質(zhì)過程中，Power Core 和Core Finder 會自動生成合理的取樣比例。最后利用SPSS 26.0 和Excel 中t檢驗(yàn)對原有種質(zhì)與核心種質(zhì)各遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析，同時(shí)運(yùn)用PCoA 和Powermarker[25]對所構(gòu)建的核心種質(zhì)構(gòu)建UPGMA 進(jìn)化樹，確認(rèn)構(gòu)建的核心種質(zhì)的代表性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗松材線蟲病馬尾松種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

由表3 可知：14 對 SSR 引物在114 份抗松材線蟲病馬尾松樣本中共檢測出115 個等位位點(diǎn)，Na為5～11，平均為8.17。所有材料的Ne為3.45～8.05，平均為5.54。Ho和He的分別為0～0.57 和0.51～0.73，He均值(0.64)高于Ho均值(0.06)，F(xiàn)is平均為0.92，綜合表明該抗性馬尾松種質(zhì)中存在雜合子缺失現(xiàn)象。PIC為0.82～0.95，平均為0.9，I為1.15～1.90，平均為1.51，表明所選引物多態(tài)性高。

表3 不同SSR 位點(diǎn)的遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)Table 3 Genetic diversity of different SSR microsatellite loci

2.2 抗松材線蟲病馬尾松種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)和主坐標(biāo)分析

Structure 分析得出的結(jié)果經(jīng)Structure Haevester 處理后發(fā)現(xiàn)(圖2A)：lnP(D)(馬爾科夫鏈不作數(shù)迭代后所得的對數(shù)似然值)持續(xù)增大，沒有拐點(diǎn)，可用ΔK[L(K)在連續(xù)K之間變化率的增量]來確定最優(yōu)分組數(shù)(K)。由圖2B 可知：當(dāng)K=4 時(shí)，ΔK取得最大值，表明參試的114 份馬尾松樣本被劃分為4 個亞群。亞群Ⅰ(綠色)包含了12 份種質(zhì)資源，其中2 份來自廣西，1 份來自貴州，3 份來自福建，2 份來自安徽，4 份來自浙江；亞群Ⅱ(黃色)包含24 份種質(zhì)資源，其中8 份來自安徽，7 份來自江西，9 份來自浙江，該亞群有12 份抗性馬尾松種質(zhì)摻雜有來自紅色部分的基因；亞群Ⅲ(紅色)包含了29 份種質(zhì)資源，其中10 份來自安徽(均為皖馬抗良種)，8 份來自江西，11 份來自浙江，共有12 份抗性馬尾松種質(zhì)摻雜有來自黃色部分的基因；亞群Ⅳ(藍(lán)色)包含49 份種質(zhì)資源，其中2 份來自福建，21 份來自安徽(其中1 份為皖馬抗良種)，11 份來自江西，15 份來自浙江(圖3)。由Structure 輸出的分組結(jié)果可知(表4)：篩選獲得的抗性馬尾松種質(zhì)中有75.4%的個體樣本隸屬不同亞群的比例(Q)＞0.8，僅有12.3%的個體Q＜0.6，表明抗性馬尾松種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)較強(qiáng)，不同來源的個體被聚在相同的遺傳結(jié)構(gòu)中表明不同省間的馬尾松存在基因滲入現(xiàn)象。

圖2 lnP(D)和ΔK 隨K 變化的折線圖Figure 2 Line plots of lnP(D) and ΔK as a function of K

圖3 114 份抗性馬尾松樣本的Structure 聚類圖Figure 3 Structure cluster diagram of 114 samples of resistant P.massoniana

表4 各亞群基因型情況Table 4 Number of genotypes in each cluster

基于遺傳距離矩陣對抗性馬尾松材料進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。由圖4 可知：全部馬尾松種質(zhì)資源可大致分為3 組，主坐標(biāo)1 和2 分別解釋了位點(diǎn)信息數(shù)據(jù)中10.45%和6.74%的變異。基于抗性馬尾松114 份樣本主坐標(biāo)分析圖可知：大部分地理來源一致的抗性馬尾松種質(zhì)分布比較集中，但來自安徽、江西、浙江的部分抗性馬尾松種質(zhì)在3 個組中均有分布。結(jié)合群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知：114 份抗性馬尾松種質(zhì)資源的分布情況基本符合群體結(jié)構(gòu)分析。

圖4 抗性馬尾松114 份樣本主坐標(biāo)分析Figure 4 Principal coordinate analysis of 114 samples

2.3 抗松材線蟲病馬尾松各亞群間遺傳多樣性及分子方差分析

由表5 可見：抗性馬尾松種質(zhì)各亞群的遺傳多樣性整體水平較高。亞群Ⅳ的等位基因數(shù)在4 個亞群中最大(13.43)，亞群Ⅰ具有最低的等位基因數(shù)(6.07)?？剐择R尾松4 個亞群所包含的馬尾松個體數(shù)不同，但亞群間遺傳多樣性水平差異不明顯。亞群Ⅳ的Ne最高，為7.14，而最低的是亞群Ⅰ，為4.87。亞群Ⅳ的Ho和He均最高，但與具有最小值的亞群Ⅲ差異不顯著，分別高0.03 和0.15。

表5 馬尾松各亞群遺傳多樣性水平Table 5 Genetic diversity parameters for all populations of resistant P.massoniana

AMOVA 方差分析表明(表6)：抗性馬尾松遺傳變異14%存在于亞群間，而亞群內(nèi)變異為80%，表明亞群內(nèi)的遺傳變異是抗性馬尾松變異的主要來源。4 個亞群間FST為0.143，表明亞群間存在中等程度遺傳分化。

表6 基于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的遺傳變異分析Table 6 Analysis of molecular variance from microsatellite data using GenALEx

2.4 抗松材線蟲病馬尾松核心種質(zhì)庫構(gòu)建與評價(jià)

利用M 策略和隨機(jī)取樣策略構(gòu)建核心種質(zhì)的遺傳多樣性指標(biāo)見表7。結(jié)果顯示：基于隨機(jī)取樣策略的Power Core 和基于M 策略的Core Finder 分別篩選得到的核心種質(zhì)均保留了原有種質(zhì)100%的等位基因數(shù)。但Core Finder 核心種質(zhì)包含的種質(zhì)(72 份)少于Power Core (79 份)，且兩者間各遺傳多樣性參數(shù)差異不顯著(P＞0.05)。綜合以上分析表明：選擇M 策略抽取72 份抗性馬尾松種質(zhì)能夠以最小的種質(zhì)份數(shù)最大程度地代表收集區(qū)內(nèi)抗性馬尾松種質(zhì)資源的遺傳多樣性。利用M 策略構(gòu)建的核心種質(zhì)中包含廣西2 份(100.0%)、貴州1 份(100.0%)、福建4 份(66.7%)、安徽33 份(其中4 份為皖馬抗良種)(78.6%)、江西8 份(30.8%)和浙江24 份(64.8%)種質(zhì)材料。

表7 不同策略構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳多樣性指標(biāo)比較Table 7 Comparisons of genetic diversity index of core collections constructed by different tactics

由表8 可見：構(gòu)建的72 份抗性馬尾松核心種質(zhì)占114 份原有種質(zhì)的63.16%，其Na均值、Ne均值、I均值分別占原有種質(zhì)相應(yīng)遺傳參數(shù)的100.00%、95.67%和94.96%。t檢驗(yàn)結(jié)果表明：列入研究的抗性馬尾松種質(zhì)與入選的核心種質(zhì)的遺傳多樣性無顯著差異(P＞0.05)，說明本研究基于M 策略構(gòu)建的抗性馬尾松核心種質(zhì)能充分代表列入研究的原抗性馬尾松種質(zhì)資源的遺傳多樣性，剔除了與114 份原有種質(zhì)重復(fù)或親緣關(guān)系較近的材料。

表8 72 份抗性馬尾松核心種質(zhì)與114 份原有種質(zhì)遺傳多樣性對比Table 8 Comparison of genetic diversity between 72 core germplasm and 114 original germplasm of resistant P.massoniana

PCoA 分析(圖5)顯示：抗性馬尾松核心種質(zhì)均勻分布在整個馬尾松種質(zhì)資源中，表明本研究所構(gòu)建的抗性馬尾松核心種質(zhì)具有很好的代表性。UPGMA 進(jìn)化樹(圖6)顯示：72 份抗性馬尾松可分為3 個類群，其中類群Ⅰ的11 份抗性馬尾松種質(zhì)全部位于亞群Ⅰ(91.7%)，類群Ⅱ的30 份抗性馬尾松種質(zhì)全部位于亞群Ⅳ(61.2%)，類群Ⅲ的抗性馬尾松種質(zhì)18 份位于亞群Ⅱ(75.0%)，其余13 份位于亞群Ⅲ(44.8%)。結(jié)合結(jié)構(gòu)分析可知：位于亞群Ⅱ中混雜有黃色和紅色的核心種質(zhì)與亞群Ⅲ中的核心種質(zhì)聚為一個亞類，亞群Ⅱ中以黃色為主的核心種質(zhì)聚為另一個亞類，但抗性馬尾松核心種質(zhì)的UPGMA 聚類結(jié)果與列入研究的原有種質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和PCoA 分析結(jié)果基本一致，進(jìn)一步對核心種質(zhì)進(jìn)行了確認(rèn)。

圖5 72 份核心種質(zhì)與114 份原有種質(zhì)主坐標(biāo)分析Figure 5 Principal coordinate analysis of 72 core germplasm and 114 original germplasm

圖6 72 份抗性馬尾松核心種質(zhì)的UPGMA 聚類圖Figure 6 UPGMA clustering map of 72 samples of resistant P.massoniana

3 討論

3.1 抗松材線蟲病馬尾松種質(zhì)資源遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)

遺傳多樣性在生物育種工作中至關(guān)重要，是評價(jià)生物多樣性的重要組成部分，物種的遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，其對環(huán)境變化的適應(yīng)能力也就越強(qiáng)[26]。本研究利用14 對 SSR 引物對經(jīng)高強(qiáng)度人工接種松材線蟲后存活下來的103 份馬尾松種質(zhì)和安徽省林業(yè)科學(xué)研究院審定的11 份高抗良種進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。Na是衡量SSR 位點(diǎn)多態(tài)性高低的重要指標(biāo)，其中所有種質(zhì)的平均Na為8.17，高于沈敬理等[27]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對131 個馬尾松無性系的研究(Na=3.67)，可能是本研究選擇的 SSR 引物具有較高多態(tài)性和基因分型檢測手段不一樣造成的。Ne、He、I等是評價(jià)遺傳多樣性的重要指標(biāo)。高景斌等[28]利用 SCAR 分子標(biāo)記對抗性馬尾松材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，其Ne和I分別為1.51 和0.46；YANG 等[19]運(yùn)用20 對 SSR 引物分析馬尾松二代親本種質(zhì)的遺傳多樣性，其Ne為3.01，I為1.26，PIC為0.89；董虹妤等[18]對選自馬尾松第2 代育種群體的12 份馬尾松材料運(yùn)用13 對 SSR 引物進(jìn)行研究，其中Na和I分別為3.17 和0.47。與上述研究結(jié)果相比，本研究所選擇的14 對 SSR 引物能有效用于檢測馬尾松的遺傳多樣性(Ne=5.54、He=0.64、I=1.51、PIC=0.90)，同時(shí)表明篩選獲得的103 份抗性馬尾松種質(zhì)和安徽省林業(yè)科學(xué)研究院審定的11 份良種具有豐富的遺傳多樣性，在未來的抗性育種進(jìn)程中具有很大的遺傳增益潛力。

Structure 結(jié)構(gòu)分析、UPGMA 聚類分析和PCoA 分析被廣泛應(yīng)用于推斷植物的群體結(jié)構(gòu)，但三者的統(tǒng)計(jì)原理不同。PCoA 分析是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維方法，通過對特征值和特征向量進(jìn)行排序來尋找主坐標(biāo)，從而有效地繪制所分析的樣本；Structure 結(jié)構(gòu)分析基于貝葉斯模型的計(jì)算方法，根據(jù)基因型信息對多組樣本進(jìn)行分類；UPGMA 聚類分析利用非加權(quán)組平均法對參試樣本進(jìn)行層次聚類。PCoA 和UPGMA 聚類分析可直觀看到材料間的分類關(guān)系，但Structure 結(jié)構(gòu)分析能清晰地反映材料間的遺傳背景和基因交流情況[29-30]。總體而言，Structure 結(jié)構(gòu)分析、UPGMA 聚類分析和PCoA 分析相輔相成，兩兩使用有助于全面了解不同樣本間的遺傳差異。本研究Structure 結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：114 份抗性馬尾松種質(zhì)資源被分成4 個亞群，而PCoA 分析將所有抗性馬尾松種質(zhì)劃分為3 組，將結(jié)構(gòu)分析所得4 個亞群中的亞群Ⅱ和亞群Ⅲ合并為一組，可能是因?yàn)檫@2 個亞群中的部分抗性馬尾松種質(zhì)Q＜0.6，存在一定頻率的基因交流和滲透。在結(jié)構(gòu)分析中，每個亞群內(nèi)都包含來自不同地區(qū)的個體，地理來源一致的抗性馬尾松種質(zhì)并沒有完全聚在一起，這可能是由于不同地區(qū)育種者之間親本交換或頻繁的人工引種，導(dǎo)致新環(huán)境中種質(zhì)的遺傳信息發(fā)生了改變。安徽省林業(yè)科學(xué)研究院審定的11 份抗松材線蟲病良種是中國所有的抗松材線蟲病馬尾松優(yōu)良種質(zhì)，已在安徽省松材線蟲病疫區(qū)進(jìn)行了大面積的林相改造和造林，在松材線蟲病防控中發(fā)揮了重要作用。這11 份抗松材線蟲病良種主要分布在亞群Ⅲ中，僅與19 份抗性馬尾松種質(zhì)聚為一個亞群，這表明本研究篩選獲得的大部分抗性馬尾松優(yōu)良品系與審定的良種遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，具有較低的遺傳相似性。因此，本研究篩選獲得的103 份抗性馬尾松種質(zhì)與審定的11 份良種遺傳信息同質(zhì)性程度較低，且具有較高的遺傳多樣性，可保障今后營造的抗性林在生態(tài)系統(tǒng)上具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

3.2 抗松材線蟲病馬尾松核心種質(zhì)庫構(gòu)建

傳統(tǒng)的核心種質(zhì)構(gòu)建方法是對比不同種質(zhì)資源在植物學(xué)、形態(tài)學(xué)等性狀上的差異來剔除親緣關(guān)系相近的樣本并且抽取核心種質(zhì)，但表型性狀容易受到外界因素影響而表現(xiàn)不穩(wěn)定[31]?；诜肿訕?biāo)記數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)可減少溫度、氣候、環(huán)境等外界因素的影響，能夠很好地作為植物形態(tài)和生理特性的有效補(bǔ)充。本研究根據(jù)SSR 分子標(biāo)記基因分型數(shù)據(jù)，利用Core Finder 和Power Core，基于M 策略和隨機(jī)取樣策略構(gòu)建抗松材線蟲病馬尾松核心種質(zhì)。綜合對比分析不同構(gòu)建策略，得到72 份抗性馬尾松核心種質(zhì)，其保留了列入研究的原有種質(zhì)全部的等位基因數(shù)，且各遺傳多樣性參數(shù)如Ne、I、He、PIC分別為5.30、1.43、0.63、0.92，均與114 份原有種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)無顯著差異(P＞0.05)。本研究構(gòu)建的72 份抗性馬尾松核心種質(zhì)在廣西、貴州、福建、安徽、江西和浙江6 省中均有分布，但江西抗性馬尾松核心種質(zhì)抽取比例為30.8%，低于其他省份抗性馬尾松種質(zhì)的入選比例，表明該省抗性馬尾松樣本存在較高的遺傳相似性。結(jié)合結(jié)構(gòu)分析可知：72 份抗性馬尾松核心種質(zhì)全面涵蓋了列入研究的抗性馬尾松種質(zhì)的4 個亞群，亞群Ⅲ抗性馬尾松核心種質(zhì)入選比例最低(44.8%)，表明該亞群抗性馬尾松種質(zhì)遺傳信息比較一致；亞群Ⅰ的抗性馬尾松核心種質(zhì)入選比例最高(91.7%)，表明該亞群可能存在最豐富的遺傳多樣性。

取樣比例的大小是核心種質(zhì)庫能否構(gòu)建成功的重要因素。WANG 等[32]和ESCEIBANO 等[33]認(rèn)為核心種質(zhì)取樣比例為5%～40%，大多數(shù)為5%～15%。李魁鵬等[34]利用SSR 分子標(biāo)記從864 份杉木Cunninghamialanceolata中篩選獲得了80 份核心種質(zhì)，占原有種質(zhì)的9.3%；黃小鳳等[35]利用SNP 分子標(biāo)記從221 份荔枝Litchichinensis品種(品系)中獲得了44 份核心種質(zhì)，占原有種質(zhì)的20%；張馨芳等[36]基于SSR 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，從161 份板栗Yanshanchestnut中構(gòu)建了含46 份種質(zhì)的核心種質(zhì)，取樣比例為28.6%。但本研究核心種質(zhì)取樣比例為63.13%，高于其他木本植物的取樣比例。李自超等[37]認(rèn)為核心種質(zhì)取樣比例通常由原有種質(zhì)的數(shù)量、群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平等決定，對于遺傳多樣性豐富、原有種質(zhì)數(shù)量較小的群體，可適當(dāng)增大取樣比例。

4 結(jié)論

利用14 對 SSR 引物對114 份抗松材線蟲病馬尾松種質(zhì)的遺傳多樣性分析表明：所選抗性馬尾松種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性(Na=8.17，Ne=5.54，He=0.64，I=1.51，PIC=0.90)，且本研究篩選的103 份抗性馬尾松材料遺傳結(jié)構(gòu)簡單、遺傳變異豐富，可用于開展馬尾松重要性狀的關(guān)聯(lián)分析研究。根據(jù)SSR 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)基于M 策略構(gòu)建了含有72 份材料的抗性馬尾松核心種質(zhì)，保留了列入研究的原有種質(zhì)100%的等位基因。經(jīng)過t檢驗(yàn)、PCoA 分析和UPGMA 聚類分析，構(gòu)建的抗性馬尾松核心種質(zhì)與列入研究的原有種質(zhì)之間無顯著差異，剔除了遺傳相近的材料，具有良好的代表性。