韓 鎳，單佳麗，陸玲玲，汪倩妮，金 琳

1.上海中醫(yī)藥大學附屬光華醫(yī)院超聲科，上海 200052；2.上海體育大學運動健康學院，上海 200438；3.上海健康醫(yī)學院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院超聲科，上海201800

低強度脈沖超聲（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）作為一種治療性的超聲波，已逐漸應(yīng)用于中樞及外周神經(jīng)的調(diào)節(jié)［1］。根據(jù)傳統(tǒng)的針灸理論，“得氣”作為針灸的關(guān)鍵部分，既是針刺效果的前提，也是治療的關(guān)鍵因素，“得氣”的快慢與治療效果密切相關(guān)［2-3］。當“氣”到達時，患者常感到酸、麻、脹、重，而針灸醫(yī)師則常感到手部沉重、緊繃或停滯，局部組織表現(xiàn)為肌張力增加。超聲剪切波彈性成像技術(shù)（shear wave elastography，SWE）通過測量剪切波的傳播速度可反映組織的硬度，在針刺研究中可實時動態(tài)觀察、定量分析穴位局部組織結(jié)構(gòu)的變化，在穴位精準定位、得氣等的研究中均有重要價值［4-5］。

本研究通過SWE 評估LIPUS 刺激足三里穴時肌張力的變化情況，以期為LIPUS 實現(xiàn)經(jīng)穴效應(yīng)的研究提供更多信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗動物為16 只雄性SD 大鼠（體質(zhì)量200～250 g），購自上海睿太莫斯生物科技有限公司，均按照相關(guān)準則進行管理（實驗動物倫理批準文號：20221130）。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：12 h明暗交替，溫度（22±2）℃，空氣相對濕度（50±10）%。SD 大鼠隨機分為脛骨前肌組和腓腸肌組各8只。

1.2 儀器與方法

使用LIPUS 換能器（TP1.1C4NF，多普勒），射頻功率放大器（HSA4102，NF）和功能發(fā)生器（WF1974，NF）和超聲診斷儀（Aplio i800，東芝），18 MHz 線陣探頭。應(yīng)用LIPUS 連續(xù)刺激大鼠足三里穴，通過SWE 監(jiān)測脛骨前肌及腓腸肌的肌張力變化。參照《實驗針灸學》及相關(guān)文獻定位實驗動物穴位［6-7］，足三里穴定位于后肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè)腓骨頭下約3 mm處。采用1%戊巴比妥鈉以劑量50 mg/kg 體質(zhì)量對大鼠進行腹腔注射麻醉。以痛覺反射、翻正反射和眼瞼反射消失作為進入麻醉期的指標，以動物眼瞼反射恢復為蘇醒的指標［6］。剔除局部毛發(fā)涂抹耦合劑。采用直徑為4 mm的LIPUS換能器連續(xù)刺激穴位20 min。單位面積功率0.88 W/cm2，頻率1.1 MHz，占空比27%。

大鼠進入麻醉期后，下肢取自然位（踝關(guān)節(jié)屈曲約90°），厚涂耦合劑，探頭輕放在足三里穴區(qū)，避免下肢肌肉受壓。根據(jù)足三里穴局部肌肉解剖，超聲探頭長軸與大鼠腓腸肌肌束方向平行的狀態(tài)下，開啟剪切波彈性模式。在腓腸肌定位基礎(chǔ)上，探頭向小腿前外側(cè)平移，即可定位脛骨前肌。選取肌腹中段較厚部位為彈性成像ROI，ROI 直徑2 mm，深度0.5～1.0 cm［8］（圖1）。連續(xù)觀察在LIPUS刺激后20 min內(nèi)穴位周圍肌肉彈性值，每隔30 s測量1次組織彈性圖，測量3次取平均值。

圖1 剪切波彈性技術(shù)測量肌緊張度 注：圖1a 為測量脛骨前肌剪切波速度，圖1b為測量脛骨前肌楊氏模量值，圖1c為測量腓腸肌剪切波速度，圖1d為測量腓腸肌楊氏模量值；ROI直徑為2 mm，測量深度為0.5～1.0 cm

1.3 重復性檢驗

選取16 只大鼠的SWE 動態(tài)圖像，由2 位醫(yī)師分別測量剪切波速度和楊氏模量值；再由其中1位醫(yī)師重復測量，并將結(jié)果用于重復性檢驗。

1.4 血清5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）濃度檢測

使用5-HT ELISA 試劑盒（xl-Er0425，新樂生物技術(shù)有限公司），LIPUS 干預(yù)前后分別通過頸靜脈采集約1 mL 血液于促凝管中，在室溫下凝固1 h，3 000轉(zhuǎn)離心15 min，并儲存在-20 ℃。血清5-HT濃度通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進行量化。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 28.0和GraphPad Prism 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示。2組數(shù)據(jù)比較行t檢驗；多組數(shù)據(jù)比較行ANOVA 分析，事后檢驗采用Dunn’s 檢驗；采用Bland-Altman 法分析和組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation coefficient，ICC）評價觀察者間和觀察者內(nèi)的重復性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲檢查

脛骨前肌及腓腸肌的剪切波速度、楊氏模量值及其平均值曲線圖見表1、2及圖2。

表1 脛骨前肌肌張力變化（）

表1 脛骨前肌肌張力變化（）

注：事后檢驗以基線水平為對照組，采用Dunn’s檢驗法。

表2 腓腸肌肌張力變化（）

表2 腓腸肌肌張力變化（）

注：事后檢驗以基線水平為對照組，采用Dunn’s檢驗法。

圖2 低強度脈沖超聲（LIPUS）刺激足三里穴后的穴位周圍組織肌張力變化 注：圖2a為脛骨前肌及腓腸肌楊氏模量值變化，圖2b為脛骨前肌及腓腸肌剪切波速度變化

相較于基線水平（0 min），脛骨前肌的肌張力在刺激足三里穴后3 min，剪切波速度和楊氏模量值均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。相較于基線水平，腓腸肌刺激后13、14 min 剪切波速度和楊氏模量值均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。

2.2 重復性檢驗

同一醫(yī)師檢測楊氏模量值和剪切波速度的ICC分別為0.55、0.67，表明一致性均良好（圖3a，3b）。Bland-Altman 散點圖分析顯示，不同醫(yī)師楊氏模量值2 次測量差值為（-0.02±1.03）（圖3c），剪切波速度值平均差值為（-0.01±1.08）m/s（圖3d），且所有點均位于相應(yīng)的95%一致性界限內(nèi)。

2.3 5-HT濃度變化

LIPUS刺激足三里穴20 min后，血清5-HT水平較刺激前明顯增加［（27.92±7.72）×10-3μmol/L vs.（35.44±7.76）×10-3μmol/L］（P＜0.05）（圖4）。

圖4 血清5-羥色胺水平變化 注：LIPUS為低強度脈沖超聲

3 討論

LIPUS 是指有效強度＜3 W/cm2的脈沖型超聲波，自2010 年Tufail 等［9］使用LIPUS 刺激在體小鼠海馬，成功誘發(fā)了CA1 區(qū)gamma 振蕩和尖波-漣漪振蕩，實現(xiàn)了LIPUS 調(diào)控中樞神經(jīng)的可行性。近年來，LIPUS作為一種無創(chuàng)調(diào)控手段得到了快速發(fā)展，在中樞、外周神經(jīng)調(diào)控、疾病治療等方面發(fā)揮重大作用［10-11］。針灸的治療效應(yīng)源于經(jīng)絡(luò)理論，特定的經(jīng)絡(luò)、腧穴與人體有著特殊聯(lián)系，可產(chǎn)生一定的治療作用，而“得氣”是針刺取效的法門，“得氣”感即針感，與針刺效應(yīng)密切相關(guān)。本研究應(yīng)用SWE 實時觀測LIPUS 刺激足三里穴后肌張力的變化，探索LIPUS 在經(jīng)穴特異性研究中的可行性。

本研究顯示，在LIPUS 刺激后，脛骨前肌及腓腸肌的剪切波速度和楊氏模量值均先升高、后下降趨于穩(wěn)定；說明LIPUS 刺激穴位后局部肌肉組織硬度發(fā)生改變。這主要是因為超聲波可能通過空化效應(yīng)作用于穴位處的局部肌肉筋膜和神經(jīng)，局部筋膜區(qū)域細小神經(jīng)放電，選擇性地激活機械敏感的Na+和K+通道，從而引起肌肉收縮、帶來組織硬度的變化［12］。經(jīng)絡(luò)效應(yīng)是一個復雜的綜合效應(yīng)，一方面穴位局部筋膜的刺激產(chǎn)生肌肉痙攣及硬度變化，可能還伴隨穴位局部特異性的神經(jīng)纖維發(fā)生改變，這些變化共同組成了針刺效應(yīng)［13］。然而在以往的針刺效應(yīng)研究中，傳統(tǒng)針灸針刺穴位后可立即觀察到局部肌張力的增加［14］。而LIPUS 引起的肌肉硬度升高的峰值時間相對延遲，可能與超聲能量的衰減和沉積有關(guān)。當能量通過介質(zhì)時，超聲波除了衰減外，還在介質(zhì)中沉積動量，產(chǎn)生聲輻射力［15］?？紤]到穴位的深度，超聲能量需積累到一定程度才能引起穴位周圍神經(jīng)的放電。因此，本實驗中，腓腸肌的肌張力升高峰值時間晚于脛骨前肌，可能因為腓腸肌位置較深，其組織質(zhì)地較硬，在LIPUS 刺激時需沉積更多能量而產(chǎn)生硬度的變化。另外，脛骨前肌及腓腸肌的剪切波速度和楊氏模量值在升高后下降趨于穩(wěn)定。考慮隨感受器的適應(yīng)現(xiàn)象，肌張力逐漸降低，即使刺激仍有效，但傳入神經(jīng)纖維的沖動頻率已開始下降［16］。這一現(xiàn)象與Leow等［17］的報道一致。

電針足三里穴能有效調(diào)節(jié)正常大鼠血清及組織中5-HT 的變化［18］。本研究顯示，LIPUS 刺激足三里穴后，大鼠血清中的5-HT濃度升高，與以往研究［19-20］結(jié)果一致，提示LIPUS 刺激足三里穴與神經(jīng)活動調(diào)節(jié)有相關(guān)性。

本研究的局限性：僅以大鼠為實驗對象，實驗參數(shù)是基于前期LIPUS 和電針的神經(jīng)調(diào)節(jié)研究；5-HT濃度升高，但仍在正常范圍內(nèi)，主要因?qū)嶒瀸ο鬄檎４笫?，今后將納入不同疾病進一步研究。

綜上所述，SWE 可為評估LIPUS 刺激穴位引起的肌肉張力變化提供客觀依據(jù)，為LIPUS 的經(jīng)穴效應(yīng)研究提供更豐富的信息。