姚港林，趙亞丹，柴 超，張紫辰，趙 彬，董鳳菊，徐枝芳，4

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)針灸研究中心，天津 301617；2.天津市第一中心醫(yī)院放射科，天津 300190；3.天津市靜海區(qū)醫(yī)院，天津 301600；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，天津301617

手十二井穴刺絡(luò)放血療法（井穴刺絡(luò)法）作為中醫(yī)傳統(tǒng)的急救促醒技術(shù)，自《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載始，便廣泛用于尸厥、中風(fēng)等昏迷急救。本課題組前期臨床研究已證實(shí)，井穴刺絡(luò)法對(duì)急性重度創(chuàng)傷性腦損 傷（traumatic brain injuries，TBI）［1-2］、腦卒中［3-4］、急性一氧化碳中毒［5］等多種中樞神經(jīng)損傷（central nervous system injury，CNSI）后的意識(shí)昏迷狀態(tài)均有顯著的改善作用，且其在井穴刺絡(luò)興奮腦干網(wǎng)狀上行激活系統(tǒng)（ascending reticular activating system，ARAS）促進(jìn)TBI 大鼠蘇醒機(jī)制研究中已取得突破性進(jìn)展［6-9］。盡管井穴刺絡(luò)法對(duì)CNSI 性昏迷促醒有確切療效，也明確相關(guān)神經(jīng)環(huán)路介導(dǎo)了井穴刺絡(luò)法促醒的效應(yīng)，但研究僅限于局部的神經(jīng)活動(dòng)，且臨床中CNSI 性昏迷患者病情多較重，難以配合長時(shí)間的影像學(xué)檢查，因此，井穴刺絡(luò)法治療CNSI 性昏迷產(chǎn)生促醒效應(yīng)的整體中樞響應(yīng)特征尚不明確，使其在實(shí)際應(yīng)用和推行中受到一定限制。本研究旨在設(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)方案，利用臨床影像學(xué)技術(shù)分析井穴刺絡(luò)法的整體中樞響應(yīng)特征，初步探討該法對(duì)醒覺相關(guān)環(huán)路的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在天津中醫(yī)藥大學(xué)師生中招募30例健康志愿者為受試對(duì)象。由于目前尚無臨床試驗(yàn)來探討井穴刺絡(luò)法對(duì)健康人群腦功能應(yīng)答的影響，且人體fMRI 研究與一般的臨床研究不同，因此樣本量的計(jì)算方法不能在一般的臨床試驗(yàn)中直接套用。另外，在關(guān)于fMRI研究樣本量的計(jì)算方面，國內(nèi)外尚無明確標(biāo)準(zhǔn)。本研究參考文獻(xiàn)及專家調(diào)研，期望25例，考慮20%脫落率，因此總樣本30例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡20～50 歲，性別不限；②BMI 18.5～23.9 kg/m2；③健康體檢項(xiàng)目正常，無器質(zhì)性疾病史，無肝、消化道、心、脾、腎、肺病史，無神經(jīng)系統(tǒng)病史，無血液系統(tǒng)疾病，無慢性軀體疾病，無長期藥物治療史，體檢無臨床意義的陽性體征；④無吸煙史和嗜酒史；⑤試驗(yàn)前3 周內(nèi)，未服藥；⑥近1 個(gè)月內(nèi)每周飲咖啡或濃茶累積量≤50 g，每日≤10 g；⑦右利手。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①妊娠期及月經(jīng)期；②抑郁自評(píng)量表評(píng)分＞52 分或焦慮自評(píng)量表評(píng)分＞49 分者［10］；③有外傷、皮損等，或所需穴位及其周圍皮膚有感染、潰爛者；④存在MRI 檢查禁忌證者（如幽閉恐懼癥、癲癇、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、危重癥，以及體內(nèi)植入金屬物品等）；⑤試驗(yàn)前3 個(gè)月內(nèi)或試驗(yàn)過程中參與其他臨床研究者；⑥有暈針或暈血史者；⑦了解試驗(yàn)具體方法和步驟后，不簽署知情同意書者。

1.3 剔除與中止標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 剔除標(biāo)準(zhǔn) ①M(fèi)RI 掃描前24 h 內(nèi)飲用含酒精飲品或興奮性飲料，如咖啡、濃茶者；②MRI 掃描前24 h 內(nèi)有明顯情緒波動(dòng)者；③其他病變（如顱腦病變明顯或頭顱解剖結(jié)構(gòu)嚴(yán)重異常）經(jīng)fMRI掃描明確者；④數(shù)據(jù)處理時(shí)，頭部旋轉(zhuǎn)角度＞1°，或向一定方向運(yùn)動(dòng)＞1 mm 者；⑤受試者因各種主觀或客觀因素?zé)o法正常完成試驗(yàn)而中止，主動(dòng)或被動(dòng)退出試驗(yàn)者。

1.3.2 中止標(biāo)準(zhǔn) ①因異常精神狀態(tài)等而無法完成MRI 掃描者；②研究期間發(fā)生嚴(yán)重不良事件或危急重癥，不宜繼續(xù)參與本臨床試驗(yàn)研究者。

1.4 干預(yù)措施

采用Press 型一次性采血器、75%酒精消毒液和一次性醫(yī)用棉簽。受試者仰臥位完成靜息態(tài)fMRI數(shù)據(jù)采集后，行井穴刺絡(luò)放血，操作者使用一次性末梢采血針，定位，消毒后，對(duì)手十二井穴行刺絡(luò)放血法操作1次，時(shí)間＜5 min。

具體方法：先右手后左手，按少商、商陽、中沖、關(guān)沖、少?zèng)_、少澤的順序進(jìn)行。手十二井穴的定位參照GB/T12346-2021《經(jīng)穴名稱與定位》。刺絡(luò)前先從近心端向遠(yuǎn)心端推壓被刺處10次，使被刺處血液充盈。消毒后，操作者用押手固定穴位處，用刺手將采血針快速刺入穴位約1.8 mm，然后退針，輕按針孔附近，使每穴出血2滴（約0.25 mL），再用棉簽按壓針眼止血。

1.5 臨床觀察指標(biāo)

1.5.1 一般生物學(xué)指標(biāo) 年齡、身高、體質(zhì)量等以及體溫、心率、呼吸、血壓等（受試者入組后、靜息態(tài)fMRI掃描前后分別測量1次）。

1.5.2 井穴刺絡(luò)法促醒的中樞響應(yīng)特征分析 比較井穴刺絡(luò)法干預(yù)前后受試者大腦局部一致性（Re‐gional homogeneity，ReHo）的變化，將ReHo 值發(fā)生變化的腦區(qū)與腦干ARAS醒覺相關(guān)腦區(qū)行相關(guān)性分析，對(duì)比井穴刺絡(luò)前和刺絡(luò)后關(guān)鍵腦區(qū)在全腦中功能連接網(wǎng)絡(luò)的變化，探究井穴刺絡(luò)法介導(dǎo)促醒的中樞網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)特征。

1.5.3 安全性評(píng)價(jià) 井穴刺絡(luò)過程中發(fā)生血腫、淤青、暈針等異常情況時(shí)，需詳細(xì)記錄刺絡(luò)時(shí)間、異常情況類型、嚴(yán)重程度、處理方式、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸等。

1.6 儀器與方法

1.6.1 掃描儀器及序列參數(shù) 采用Siemens 3.0 T MRI掃描儀及64通道相控陣頭線圈。掃描序列與參數(shù)：①橫斷面BOLD 成像，TR/TE 2 500 ms/30 ms，視野220 mm×220 mm，層數(shù)40，層厚3 mm，層距0.3 mm，分辨率96×96，翻轉(zhuǎn)角90°。②矢狀面T1MP-RAGE，層數(shù)176，視野250 mm×250 mm，像素大小1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm，層厚1 mm，帶寬170 Hz/pixel，翻轉(zhuǎn)角9°。③stage 成像參數(shù)，其中newB1_PDW：TR1/TE1 25 ms/8.5 ms，TR1/TE1 25 ms/18.5 ms，像素大小0.7 mm×0.7 mm×2.0 mm，視野256 mm×256 mm，層數(shù)64，層厚2 mm，層距2 mm，翻轉(zhuǎn)角24°，帶寬240 Hz/pixel。newB2_T1W：TR1/TE1 25 ms/7.5 ms，TR1/TE1 25 ms/17.5 ms，像素大小0.7 mm×0.7 mm×2.0 mm，視野256 mm×256 mm，層數(shù)64，層厚2 mm，層距2 mm，翻轉(zhuǎn)角6°，帶寬240 Hz/pixel。newB3_MRAV：TR1/TE1 20 ms/2.5 ms，TR1/TE1 20 ms/12.5 ms，像素大小0.7 mm×0.7 mm×2.0 mm，視野256 mm×256 mm，層數(shù)64，層厚2 mm，層距2 mm，翻轉(zhuǎn)角12°，帶寬1 為650 Hz/pixel，帶寬2 為240 Hz/pixel。④橫斷面ASL成像，TR/TE 2 500 ms/11 ms，TI1/TI2 2 700 ms/1 800 ms，視野256 mm×256 mm，層厚8 mm，層距2 mm，翻轉(zhuǎn)角90°，矩陣64×64×11。⑤橫斷面T2WI，TR/TE 6 000 ms/93 ms，層數(shù)25，像素大小0.7 mm×0.7 mm×0.4 mm，視野220 mm×100 mm，帶寬220 Hz/pixel，翻轉(zhuǎn)角120°。⑥T2-FLAIR，TR/TE 8 000 ms/85 ms，層數(shù)22，像素大小0.5 mm×0.5 mm×5.0 mm，視野240 mm×240 mm，層厚5 mm，帶寬287 Hz/pixel，翻轉(zhuǎn)角90°。

1.6.2 掃描前準(zhǔn)備 研究人員需在掃描前詳細(xì)介紹掃描流程，消除受試者心理壓力，使掃描過程順利進(jìn)行，以確保采集數(shù)據(jù)的有效性和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6.3 掃描方案 ①記錄受試者一般情況（包括文化程度、體質(zhì)量、身高、性別、姓名、年齡等）。②受試者取仰臥位，佩戴防噪聲耳塞，頭部置于顱腦線圈內(nèi)，戴上遮光眼罩，頭部兩側(cè)填充海綿墊，減少呼吸、心跳引起的頭部不自主運(yùn)動(dòng)。受試者保持安靜、放松、閉眼狀態(tài)，平靜呼吸，保持清醒，行30 min 基線靜息狀態(tài)fMRI檢查。在正中矢狀位圖像上平行于前后聯(lián)合線行定位獲得橫斷面圖像，掃描范圍覆蓋全腦。③完成靜息態(tài)fMRI 數(shù)據(jù)采集后，用一次性末梢采血針定位、消毒，對(duì)指定腧穴行井穴刺絡(luò)法操作，用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)。④井穴刺絡(luò)法操作完成后，fMRI 數(shù)據(jù)采集25 min，參數(shù)與靜息態(tài)掃描序列保持一致。

1.6.4 fMRI數(shù)據(jù)預(yù)處理 使用Dicom works軟件1.3.5版本，將DICOM 格式的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為NIFITI 格式，使用Matlab 平臺(tái)的SPM12 軟件進(jìn)行預(yù)處理。步驟：①移除前10 個(gè)時(shí)間點(diǎn)；②層面時(shí)間差校正；③頭動(dòng)校正；④空間標(biāo)準(zhǔn)化，將受試者的圖像與SPM 軟件自帶的蒙特利爾神經(jīng)病學(xué)研究所提供的模板匹配，并將其腦部圖像數(shù)據(jù)重新采集為3 mm×3 mm×3 mm；⑤去線性漂移；⑥濾噪，提取頻率為0.01～0.08 Hz 的信號(hào)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件，在符合正態(tài)分布及滿足方差齊性的數(shù)據(jù)組間比較行t檢驗(yàn)；而非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）用于不滿足正態(tài)分布或方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)。以上采取雙側(cè)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)閾值為P＜0.05。

使用SPM12 軟件包進(jìn)行ReHo 分析，采用肯德爾和諧系數(shù)轉(zhuǎn)化ReHo 的數(shù)值。逐點(diǎn)計(jì)算每個(gè)體素在同一時(shí)間序列中與其相鄰的26 個(gè)體素的ReHo，生成全腦ReHo 圖。根據(jù)全腦模版去除非腦組織，排除模版外的體素。為進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，需用全腦的平均ReHo值除以每個(gè)體素的ReHo值。用半高全寬為6 mm的平滑核校驗(yàn)產(chǎn)生的ReHo 圖，以進(jìn)行空間平滑和濾噪。ReHo結(jié)果需使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，性別為協(xié)變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)閾值為P＜0.05，采用FWE或FDR校正。

將井穴刺絡(luò)法前后ReHo 值變化的腦區(qū)與腦干ARAS 醒覺相關(guān)腦區(qū)（圖1）行相關(guān)性分析，篩選出井穴刺絡(luò)法產(chǎn)生促醒效應(yīng)的靶向腦區(qū)。

圖1 腦干網(wǎng)狀上行激活系統(tǒng)（ARAS）神經(jīng)投射系統(tǒng)的腹側(cè)（紅箭）和背側(cè)（黃箭）通路 注：LC（NA）為去甲腎上腺素能藍(lán)斑核，Raphe（5-HT）為五羥色胺能中縫正中核，vPAG（DA）為多巴胺能腹側(cè)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)，TMN（His）為組胺能下丘腦結(jié)節(jié)乳頭核，LH（ORX、MCH）為食欲素、黑色素濃集激素能下丘腦外側(cè)區(qū)，BF（Ach、GABA）為乙酰膽堿、γ-氨基丁酸能基底前腦，PPT（Ach）為乙酰膽堿能腦橋被蓋網(wǎng)狀核，LDT（Ach）為乙酰膽堿能腦干被蓋背外側(cè)核

使用SPM12 軟件行功能連接分析。去掉腦脊液和白質(zhì)信號(hào)及頭動(dòng)參數(shù)3個(gè)協(xié)變量；用基于體素的種子點(diǎn)相關(guān)全腦功能連接算法，以井穴刺絡(luò)法發(fā)揮促醒效應(yīng)過程中的關(guān)鍵腦區(qū)作為ROI，并以此為種子點(diǎn)，計(jì)算出其所有體素的平均時(shí)間序列，將其與全腦體素時(shí)間序列逐一行Person 相關(guān)分析，通過Fisher-Z變換將Person 相關(guān)計(jì)算的分布轉(zhuǎn)化為近似正態(tài)分布的數(shù)據(jù)；最終使用配對(duì)t檢驗(yàn)，以性別為協(xié)變量，得到井穴刺絡(luò)法發(fā)揮促醒效應(yīng)關(guān)鍵腦區(qū)的腦功能連接網(wǎng)絡(luò)變化。統(tǒng)計(jì)閾值為P＜0.05，以FWE 或FDR校正結(jié)果。

1.8 質(zhì)量控制

1.8.1 受試者質(zhì)量控制 嚴(yán)格執(zhí)行納入和排除標(biāo)準(zhǔn)。

1.8.2 針刺操作及效應(yīng)評(píng)價(jià)質(zhì)量控制 行井穴刺絡(luò)法針刺操作的預(yù)試驗(yàn)，穴位位置的選擇和針刺操作與正式試驗(yàn)保持一致。井穴刺絡(luò)法由同一名有中醫(yī)執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格、熟練操作刺血療法、經(jīng)規(guī)范化操作培訓(xùn)的碩士研究生完成。

效應(yīng)評(píng)價(jià)者的責(zé)任是解答受試者在受試過程中產(chǎn)生的疑慮和遇到的問題，不能對(duì)受試者的決定產(chǎn)生干擾。

1.8.3 fMRI掃描質(zhì)量控制 ①設(shè)備及磁場的質(zhì)量控制：MRI 掃描均在天津市第一中心醫(yī)院進(jìn)行，采用Siemens 3.0 T fMRI 掃描儀及標(biāo)準(zhǔn)梯度回波平面成像功能頭線圈。由1 名培訓(xùn)合格的研究人員實(shí)施定位掃描，受試者采用同一序列。②受試者狀態(tài)的質(zhì)量控制：除告知受試者M(jìn)RI 掃描注意事項(xiàng)外，針對(duì)掃描時(shí)的噪音大小、受試者感受及情緒狀態(tài)等設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)表，以判斷受試者在掃描過程中是否存在過度緊張，或因噪音而產(chǎn)生的煩躁情緒，從而修正數(shù)據(jù)。③圖像分析質(zhì)量控制：由經(jīng)驗(yàn)豐富的影像科醫(yī)師對(duì)圖像進(jìn)行篩查，確保無結(jié)構(gòu)異常后，再對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.9 倫理審查

本研究已通過中國注冊(cè)臨床試驗(yàn)倫理審查委員會(huì)倫理審批（ChiECRCT20220072）。

1.9.1 收益與風(fēng)險(xiǎn) ①井穴刺絡(luò)法已被證實(shí)對(duì)CNSI臨床療效確切、無毒副反應(yīng)、安全可靠；②受試者應(yīng)熟悉包含研究目的、研究方法、治療方案、影像學(xué)檢查等與本研究有關(guān)的內(nèi)容；③整個(gè)過程不收取受試者任何費(fèi)用；④研究過程中若出現(xiàn)針刺的不良反應(yīng)，應(yīng)及時(shí)處理。

1.9.2 受試者的醫(yī)療和保護(hù) ①按照《赫爾辛基宣言》的要求制訂知情同意書；②詳細(xì)告知受試者整個(gè)研究過程的預(yù)期收益，以及由此帶來的可能危害和操作上引起的不便；③受試者的個(gè)人資料保密，出于自愿原則參加本試驗(yàn)可在本研究中任何時(shí)間中止或退出；④受試者如因本研究受到損害，可在合理范圍內(nèi)得到相關(guān)補(bǔ)償；⑤當(dāng)受試者滿足相關(guān)要求，并在知情同意書上簽名、標(biāo)注日期后，即為自愿參加本試驗(yàn)，方可入組。

2 預(yù)期結(jié)果

與基線靜息態(tài)fMRI 掃描數(shù)據(jù)相比，井穴刺絡(luò)法后受試者靜息態(tài)腦功能顯著變化，其中腦干ARAS醒覺相關(guān)腦區(qū)（如丘腦、下丘腦等）腦功能ReHo 及腦功能連接網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)變化顯著。

3 討論

CNSI 是成人病死率升高的主要原因之一，但其病理生理學(xué)尚未完全闡明［11］。CNSI性昏迷患者能否盡快蘇醒是影響臨床預(yù)后的重要因素，由昏迷狀態(tài)惡化為植物狀態(tài)的患者給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［12］。因此，快速及時(shí)地采取有效的促醒急救措施是提高CNSI 救治率的第一步［13］。正常意識(shí)的保持依賴于ARAS 的正常功能及其向雙側(cè)丘腦和端腦的投射。CNSI 性昏迷發(fā)生與ARAS 受損或傳導(dǎo)功能抑制密切相關(guān)，興奮ARAS神經(jīng)傳導(dǎo)和促進(jìn)其修復(fù)是促醒機(jī)制的核心［14］。目前，仍無特效促醒療法的根本原因也在于缺乏安全快捷的興奮和修復(fù)腦干ARAS的靶向療法［15］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，井穴刺絡(luò)法在多種CNSI 性昏迷中具有明顯的促醒效應(yīng)，能調(diào)節(jié)ARAS中腹側(cè)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、下丘腦結(jié)節(jié)乳頭核區(qū)及下丘腦外側(cè)區(qū)相關(guān)神經(jīng)元的興奮性，但這僅從核團(tuán)局部神經(jīng)元的功能活動(dòng)揭示了井穴刺絡(luò)法的促醒機(jī)制，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)井穴刺絡(luò)法的整體響應(yīng)特征尚不明確?？紤]到對(duì)臨床中TBI 等CNSI 性昏迷患者使用fMRI 技術(shù)受到安全性、倫理等方面的諸多限制，因此在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，選擇健康人群為試驗(yàn)對(duì)象，觀察手十二井穴刺絡(luò)放血療法干預(yù)后所引起的腦功能區(qū)信號(hào)的變化；并從醒覺相關(guān)腦區(qū)（包括ARAS）功能活動(dòng)應(yīng)答的角度，對(duì)井穴刺絡(luò)法促醒可能的中樞響應(yīng)特征作初步探索。

本研究采用自身前后對(duì)照的設(shè)計(jì)類型，受試者于MRI 檢查床上行手十二井穴刺絡(luò)放血治療，方便參與，有利于增強(qiáng)其依從性。該方案詳細(xì)記錄刺絡(luò)前、刺絡(luò)后的靜息態(tài)fMRI數(shù)據(jù)，精確地反映井穴刺絡(luò)法干預(yù)產(chǎn)生的腦功能fMRI及腦功能連接網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)的瞬時(shí)效應(yīng)和長期效應(yīng)?；谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，井穴刺絡(luò)法可雙向調(diào)節(jié)中風(fēng)患者的腦血流量［16］，增加腦血腫家兔的腦血流量［17］，故設(shè)計(jì)該試驗(yàn)同時(shí)觀察井穴刺絡(luò)法對(duì)腦血流灌注量的變化。本研究可初步探索井穴刺絡(luò)法的中樞響應(yīng)特征及觀察腦血流灌注變化，有利于進(jìn)一步豐富現(xiàn)有機(jī)制研究內(nèi)容，揭示井穴刺絡(luò)法促醒的普適性作用原理，有助于井穴刺絡(luò)法的實(shí)際運(yùn)用和國際推廣，為CNSI 性昏迷提供一項(xiàng)新的療效顯著的促醒手段，減輕CNSI 性昏迷為家庭帶來的經(jīng)濟(jì)壓力和給社會(huì)帶來的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。