許 歡，黃琳茜，王子成，陳曉明，徐 磊

（淮陰工學院生命科學與食品工程學院 江蘇淮安 223003）

果膠是一類廣泛存在于植物細胞壁中的陰離子雜多糖，對于植物組織的結構與硬度具有重要意義[1]。果膠分子呈現多樣化的結構，是自然界結構最復雜的多糖，主要由α-（1-4）-D-半乳糖醛酸構成的線性主鏈和中性糖構成的側鏈組成[2]，具有良好的凝膠[3]、增稠、乳化[4]和抗菌[1]等功能，近年來被廣泛應用在食品、生物醫(yī)學、化妝品等工業(yè)領域。果膠的分子結構是決定其物理化學性質的重要因素，其單糖組成、支化類型和分子質量等因植物來源、位置和提取條件的不同而差異顯著[5]。

果膠在植物中普遍存在，目前的商業(yè)化果膠主要來源于柑橘皮和蘋果渣。甜菜果膠（Sugar beet pectin，SBP）是一種從甜菜粕中提取得到的果膠，屬于中等分子質量、酯化度較高的果膠，具有較高的蛋白質組分，因而表現出較高的乳化活性，被認為具有特殊的工業(yè)價值[6]。通常情況下，果膠可以通過添加Ca2+、蔗糖和降低pH 的方式形成凝膠，然而，天然SBP 凝膠性能較差，對于主要以凝膠特性應用于食品工業(yè)中的果膠來說，SBP 的使用明顯受到限制。研究發(fā)現，SBP 的鼠李糖半乳糖醛酸Ⅰ結構側鏈上含有大量的阿魏酸基團，可以通過酶法對SBP 進行交聯改性，從而改善其凝膠、乳化特性[4]。張露[7]對SBP 交聯時的pH、溫度和酶濃度等條件進行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，制得的交聯SBP 分子質量和黏度顯著增大。Kuuva 等[8]研究發(fā)現，SBP 無法在僅存在Ca2+的情況下形成凝膠，而添加漆酶后會形成凝膠，且膠凝速率和力學性能會隨著漆酶添加量的變化發(fā)生顯著的改變。漆酶交聯得到的SBP 微凝膠被證實相比于傳統的鈣交聯微凝膠具有更高的穩(wěn)定性[9]。而酈金龍等[10]分別采用漆酶和辣根過氧化物酶制備交聯SBP，發(fā)現辣根過氧化物酶交聯得到的SBP 具有更好的乳狀液穩(wěn)定性能。

盡管目前已有大量的文獻探討交聯SBP 的應用，然而對不同交聯程度SBP 的結構及流變性質的詳細論述仍缺乏。本研究采用漆酶催化交聯SBP，通過摩爾質量分析、熱重分析、XRD 分析、SEM 分析、流變分析等，研究交聯時間對SBP 流變、結構等性質的影響，可為SBP 的應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SBP，德國Herbstreith &Fox KG 公司；漆酶，夏盛（北京）生物科技開發(fā)有限公司；無水乙醇、蔗糖等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SU8010 型場發(fā)射掃描電鏡，日本日立高新技術公司；DHR-1 流變儀，美國TA 儀器公司；D8 Advance 型X-射線衍射分析（X-ray diffraction，XRD）儀，德國Bruker 公司；Waters 1525 型高效液相色譜儀，美國Waters 公司；TGA8000 熱重分析儀，日本日立高新技術公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 交聯SBP 制備 準確稱量10 g SBP，加入1 L 去離子水，過夜充分攪拌均勻，使用1 mol/L NaOH 調節(jié)SBP 溶液pH 值至6.0，按2 000 U/g SBP 添加漆酶，然后在45 ℃水浴分別反應0，10，20，30 min，隨后立即加入3 倍體積無水乙醇，停止反應。將上述溶液攪拌均勻后，過濾，濾渣于50℃烘箱干燥24 h，磨粉過100 目篩，放入干燥器中備用，所得樣品分別命名為SBP0、SBP1、SBP2、SBP3。

1.3.2 摩爾質量測定 采用高效體積排阻色譜法測定SBP 的摩爾質量[11]。稱取適量樣品，用流動相充分溶解配制成質量濃度為0.5 mg/mL 的溶液，10 000×g 離心10 min，過0.45 μm 濾膜后進樣。選擇Shodex OHpak SB-805HQ 和Shodex OHpak SB-804HQ 兩根色譜柱進行串聯使用，流動相為含有0.2 g/L NaN3的0.1 mol/L NaCl 溶液，柱溫為35 ℃，流速為0.7 mL/min。采用系統自帶軟件計算SBP 的重均摩爾質量、數均摩爾質量和旋轉半徑等參數。

1.3.3 微觀形態(tài)觀察 取適量交聯SBP 樣品，采用雙面導電膠帶固定在銅板上，在真空環(huán)境下對樣品進行噴金處理，然后在掃描電鏡中放大適當倍數進行形貌觀察，設置加速電壓為5 kV。

1.3.4 熱重分析 參照劉昕等[12]的方法進行SBP樣品的熱重分析。稱量8 mg 左右的樣品，將樣品從30 ℃加熱到600 ℃，控制升溫速率為10 ℃/min，選擇N2作為保護氣體，控制其流速為70 mL/min。

1.3.5 晶體結構分析 采用XRD 對SBP 樣品的晶體結構進行分析，采用銅靶Cu Kα，管壓為40 kV，掃描范圍2θ 為5°～50°，設定掃描速率為5.0°/min，步長為0.02°。

1.3.6 靜態(tài)流變學性質測定 分別配制10 g/L 的不同交聯時間的SBP 溶液，取適量加載至流變儀的帕爾貼板上，利用塑料刮板除去多余樣品，測定時所選用平板直徑為40 mm，設置間隙為1 000 μm。

1.3.6.1 蔗糖質量濃度的影響 向SBP 溶液中加入蔗糖，分別調整蔗糖質量濃度為0，100，300，500 g/L，測定時設置溫度為25 ℃，剪切速率范圍為0.1～100 s-1，記錄溶液黏度隨剪切速率的變化。采用Power-Law 方程對試驗數據進行擬合分析。方程如下：

式中，τ——剪切應力（Pa）；K——稠度系數（Pa·sn）；γ——剪切速率（s-1）；n——流動特征指數。

1.3.6.2 溫度的影響

1）升溫模式 測定時剪切速率設定為50 s-1，掃描溫度范圍為5～85 ℃，記錄溶液黏度隨溫度的變化，采用Arrhenius 方程對數據進行擬合。方程如下：

式中，η——黏度（Pa·s）；A——指前因子；Ea——表觀活化能（J/mol）；R——氣體常數，8.314 J/（mol·K）；T——溫度（K）。

2）恒溫模式 分別設定測試溫度為5，25，45，65 ℃，剪切速率范圍為0.1～100 s-1，記錄溶液黏度隨剪切速率的變化。

1.4 數據處理

采用OriginPro 2021 軟件進行數據處理與繪圖。

2 結果與分析

2.1 交聯處理對SBP 摩爾質量的影響

果膠分子質量是決定果膠增稠、凝膠和穩(wěn)定性能的重要參數[13]。交聯處理對SBP 摩爾質量的影響如表1 所示。從表1 中可以看出，SBP 摩爾質量呈現先增加后降低的趨勢，交聯10 min 后SBP的數均摩爾質量從1.856×105g/mol 增加到3.064×105g/mol，而后隨著交聯時間的延長數均摩爾質量反而降低，交聯20 min 和30 min 后的SBP 數均摩爾質量分別為1.670×105g/mol 和1.502×105g/mol。峰位、重均、Z 均摩爾質量等的變化也呈現類似的趨勢。產生上述結果的原因可能是SBP 的過度交聯導致其溶解度降低，高摩爾質量的交聯SBP 無法充分溶解到溶液中。圖1 為10 g/L 的不同交聯程度的SBP 溶液離心后的圖片，從圖中可以看出，SBP 溶液離心后均產生明顯的分層現象，且隨著交聯時間的延長，離心后底部沉淀增多，此結果可以解釋上述長時間交聯處理后SBP 摩爾質量反而降低的現象。這與Jung 等[14]發(fā)現的漆酶處理后SBP 分子質量提高而得率降低的結果一致。此外，Wang 等[15]在SBP 的干熱處理過程中也發(fā)現了SBP 的過度交聯會形成不溶性的聚集體。

表1 交聯甜菜果膠的摩爾質量分布Table 1 Molar mass distribution of crosslinked sugar beet pectin

圖1 交聯甜菜果膠溶液離心后圖片Fig.1 Pictures of crosslinked sugar beet pectin solution after centrifugation

2.2 交聯處理對SBP 微觀結構的影響

圖2 為不同交聯時間的SBP 在5 萬倍放大倍數下的掃描電鏡圖。從圖中可以看出，交聯處理使得SBP 表面結構發(fā)生變化。未交聯時，SBP 表面較為平整、光滑，呈現緊密堆積的塊狀結構。這與Peng 等[16]報道的結果一致。隨著交聯時間的延長，SBP 的塊狀結構變得逐漸蓬松，表面逐漸出現明顯的細紋和蜂窩狀結構，表明經交聯處理后SBP形成了網絡結構。SBP 交聯后形成的網絡結構可能在一定程度增加了SBP 的持水力，提高了SBP溶液的黏度。

圖2 交聯甜菜果膠的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of crosslinked sugar beet pectin

2.3 交聯處理對SBP 熱穩(wěn)定性的影響

SBP 加熱過程中質量的變化如圖3 所示。從圖中可以看出，SBP 的失重過程大致可分為50～150 ℃和150～400 ℃兩個階段。第一階段主要為樣品的水分散失，而第二階段主要對應果膠主鏈的降解過程，其中樣品在第二階段失重最為顯著，這與劉昕等[12]的研究結果類似。隨著交聯時間的延長，SBP 的質量殘留率從32.37%增加到42.20%，表明交聯處理后SBP 的熱穩(wěn)定性提高。這可能是因為漆酶促進了SBP 側鏈上的基團共價交聯，提高了SBP 分子內或分子間的部分化學鍵的能量，進而形成了有利于SBP 熱穩(wěn)定性的結構。與本研究結果一致，漆酶交聯處理已被證實可以顯著增強殼聚糖[17]、羥基酪醇[18]等的抗熱降解性。

圖3 交聯甜菜果膠的熱重曲線Fig.3 TG curves of crosslinked sugar beet pectin

2.4 交聯處理對SBP 晶體結構的影響

通過XRD 技術可判定果膠的晶體結構特征。如圖4 所示，不同時間交聯處理后的SBP 樣品具有相似的XRD 圖譜。所有SBP 樣品均在2θ 為12°和22°處出現低強度的寬型衍射峰，這與Zhang 等[19]報道的結果一致。此外，在2θ 為14°和33°處分別存在一個較為尖銳而不強烈的衍射峰，這可能主要是由樣品中殘余的小分子糖造成的[20]。因此，可以推斷SBP 主要以無定形聚合物的形式存在，交聯處理不會改變其晶體結構。果膠中含有的具有大量羧基的多聚半乳糖醛酸單元可通過有序堆積形成結晶結構，與本研究結果一致，來源于秋葵[21]、斑鳩占葉[20]的果膠被報道主要以無定形聚合物的形式存在。然而，Yang 等[20]報道柑橘和蘋果來源的果膠主要以晶體結構的形式存在。果膠的來源和提取技術等的差異都可能在一定程度上造成其晶體結構的差別[22]。

圖4 交聯甜菜果膠的X 射線衍射圖Fig.4 X-ray patterns of crosslinked sugar beet pectin

2.5 蔗糖對交聯SBP 溶液流變學性能的影響

果膠的流變行為是決定其應用范圍的重要參數，受結構特征、分子質量、聚合物濃度、pH 值和共溶質等諸多內在和外在因素影響[23]。蔗糖對交聯SBP 溶液流變學性質的影響如圖5 所示。從圖中可以看出，所有的SBP 溶液均呈現出剪切稀化的現象，黏度均隨著剪切速率的增加而明顯降低。這主要是由SBP 分子結構中纏結不足導致，當受到外界剪切作用時，SBP 分子中物理交聯點被破壞的速度大于其重建的速度[24]。對于未交聯的SBP，剪切稀化行為主要發(fā)生在低剪切速率范圍（＜1 s-1），而對于交聯的SBP，在整個剪切速率范圍內均可觀察到連續(xù)且顯著的剪切變稀行為。上述結果可能是由于隨著剪切速率的增加，SBP 分子在流動方向上迅速排列，相鄰分子鏈之間的這種物理相互作用減少，而交聯處理增強了SBP 分子間的相互作用，因此可以在較寬的剪切速率范圍內觀察到剪切變稀的行為。添加蔗糖后，SBP 的黏度曲線隨著濃度的升高呈逐漸上移的趨勢。表2為采用Power-Law 方程對SBP 溶液黏度變化擬合所得參數。從表中可以看出，隨著交聯時間的延長，SBP 的稠度系數K 呈逐漸增加的趨勢，表明交聯處理可以顯著提高SBP 的黏度[25]。所有樣品的流動特征指數n 都小于1，表明所有樣品都表現為假塑性流體行為。交聯處理后n 值增加，表明溶液更接近理想狀態(tài)的牛頓流體（n=1）。添加蔗糖后，所有SBP 溶液的K 和n 值均隨蔗糖質量濃度呈逐漸增加的趨勢。這一結果可歸因于蔗糖分子的存在促進了SBP 分子結構中的氫鍵鍵合和鏈間的疏水相互作用[26]。Nascimento 等[27]在來源于樹番茄的高甲氧基果膠中添加蔗糖，顯著增加了K 值，與本研究結果一致。

表2 不同蔗糖質量濃度下交聯甜菜果膠溶液流動曲線擬合參數Table 2 Power-Law parameters for crosslinked sugar beet pectin at different sucrose mass concentrations

圖5 蔗糖質量濃度對交聯甜菜果膠溶液流變學性能的影響Fig.5 Effects of sucrose mass concentration on the flow behavior of crosslinked sugar beet pectin

2.6 溫度對交聯SBP 溶液流變學性能的影響

2.6.1 升溫模式 溫度是影響多糖溶液流變學性能的重要因素，升高溫度能夠加速分子的無規(guī)則運動，從而降低分子間以及分子內的相互作用，降低溶液黏度。從圖6 中可以看出，交聯SBP 溶液的黏度在5～85 ℃范圍內，隨著溫度的升高均呈逐漸降低的趨勢，而黏度大小排序始終為SBP3＞SBP2＞SBP1＞SBP0。汪海波等[28]在研究來源于干橘皮的低酯果膠流變學時也發(fā)現其黏度隨溫度升高而降低的現象。采用Arrhenius 模型研究了SBP 的溫度依賴性，擬合所得參數如表3 所示，R2均在0.922 以上，表明該模型較為合適。從表中可以看出，SBP的表觀活化能Ea為1.097×104～1.659×104J/mol，與報道的支鏈多糖的Ea值較為接近[29]。Ea值大小可以反映黏度變化對溫度的敏感性，較高的Ea值表明流動黏度更依賴于溫度[30]。隨著交聯時間的延長，SBP 的Ea呈逐漸降低的趨勢，表明交聯SBP的溫度依賴減弱。出現這一結果可能是由于交聯使得SBP 的更多側鏈相互以共價鍵結合，分子間相互作用力增強，因而對外界因素具有更高的抗性。而指前因子A 隨著交聯時間的延長呈逐漸升高的趨勢。

表3 交聯甜菜果膠溶液的Arrhenius 方程及相關參數Table 3 Arrhenius equations and their parameters of crosslinked sugar beet pectin solutions

圖6 溫度（升溫模式）對交聯甜菜果膠溶液流變學性能的影響Fig.6 Effects of temperature（variable mode）on the flow behavior of crosslinked sugar beet pectin

2.6.2 恒溫模式 交聯SBP 在5，25，45，65 ℃條件下，黏度隨剪切速率的變化而變化，如圖7 所示。不同交聯程度的SBP 在所有溫度條件下都表現出了剪切稀化的特征，且在低溫條件下更為明顯。這主要是由于剪切破壞了溶液中SBP 分子的纏結網絡結構，從而降低了流體動力阻力[31]。在同一剪切速率下，溫度越高交聯SBP 的黏度越低，此結論與變溫模式測定結果一致。由表4 可知，交聯SBP 溶液的n 值都小于1，且隨著溫度的升高，n值都呈逐漸增大的趨勢，這表明交聯SBP 溶液的假塑性減弱。此外，交聯SBP 溶液的K 值隨著溫度升高呈逐漸降低的趨勢。而在同一溫度下，隨著交聯時間的延長，K 值呈逐漸增加的趨勢，而n 值呈逐漸降低的趨勢。Marcotte 等[32]在卡拉膠、黃原膠、果膠等多糖的研究中也得到了類似的結論。

表4 不同溫度下交聯甜菜果膠溶液流動曲線擬合參數Table 4 Power Law parameters for crosslinked sugar beet pectin at different temperatures

圖7 溫度（恒溫模式）對交聯甜菜果膠流變學性能的影響Fig.7 Effects of temperature（constant mode）on the flow behavior of crosslinked sugar beet pectin

3 結論

漆酶交聯處理可顯著改變SBP 的結構及流變特性。SBP 經交聯處理后溶解性降低，摩爾質量隨著交聯時間的延長呈先增加后減小的趨勢。隨著交聯時間的延長，SBP 由表面平整、結構緊密的塊狀結構，逐漸變得蓬松粗糙，能夠明顯看到交織的網絡結構。SBP 主要以無定形聚合物的形式存在，交聯處理對其晶體結構幾乎沒有影響，而熱穩(wěn)定性在交聯處理后增強。SBP 溶液屬于假塑性流體，隨著蔗糖質量濃度的增大，SBP 的黏度曲線整體上移。此外，溫度對于SBP 溶液的黏度影響較大，隨著溫度的升高，溶液的黏度降低，而隨著交聯時間的延長，SBP 黏度的溫度敏感性降低。研究結果為交聯SBP 的開發(fā)利用提供一定的基礎數據。