張 黎,鄭濱洋,張 琪,吳海蓮,潘紅星,朱鳳才,吳海生,周劍芳

鼠疫俗稱黑死病,是由鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis,以下簡稱鼠疫菌)感染引起的一種自然疫源性烈性傳染病,為我國法定甲類傳染病[1]。人感染鼠疫后可表現(xiàn)為腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫等,其中肺鼠疫發(fā)病急、傳染性強(可通過飛沫傳播),不及時治療病死率可達100%。鼠疫在人類歷史上共引起3次大流行,導(dǎo)致約1.6億人喪生[2]。

鼠疫菌屬于耶爾森菌屬(Yersinia),該屬的典型形態(tài)是短而粗、兩極濃染的小桿菌,有莢膜,無鞭毛和芽孢的革蘭陰性菌。鼠疫菌的主要保護性抗原為F1抗原和低鈣應(yīng)答V抗原(low-calcium response V antigen,LcrV),即V抗原。其中F1抗原為細菌莢膜,是鼠疫的主要保護性抗原[3]?？笷1抗體可協(xié)同干擾類鞭狀體結(jié)構(gòu)(injectosome)上的V抗原與免疫細胞間的整合,對抗病菌的入侵[4-5]。V抗原和其他分泌性耶氏菌外膜蛋白(Yersinia outer protein,Yop),如YopB及YopD等,由75 kb pCD1質(zhì)粒編碼,構(gòu)成重要的III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system, T3SS),是鼠疫菌感染入侵的基本毒力因子和誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性應(yīng)答的重要抗原[6-7],抗V抗體可阻止效應(yīng)蛋白Yop的遞送[8]。V抗原一直是鼠疫研究的熱點,同樣作為保護性抗原,V抗原和F1抗原具有協(xié)同保護效應(yīng),目前在研的鼠疫重組亞單位疫苗也都是采用F1+V的組合[9]。V抗原的單克隆抗體也具有與F1抗體協(xié)同保護效果,甚至非保護性的V抗體也能明顯提高F1抗體的保護效果[10]。

本研究采用基因工程手段,從鼠疫疫苗臨床試驗受試者外周血中獲得針對鼠疫V抗原的全人源單克隆抗體,初步評價鼠疫抗體與抗原結(jié)合特異性參數(shù)及對動物的保護效果,進而深入了解鼠疫的致病機制,為研究人體針對鼠疫抗原免疫應(yīng)答奠定基礎(chǔ),為制備針對鼠疫的診斷及治療制劑提供候選分子。

1 材料與方法

1.1 抗原、全血標本、菌株和實驗動物 鼠疫耶爾森菌重組V抗原由蘭州生物制品研究所保存并提供;5份全血標本來自于蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司的鼠疫重組疫苗II期臨床項目(臨床試驗批件號:2012L01329);鼠疫菌強毒株141株由青海地方病預(yù)防控制所鼠疫專業(yè)實驗室分離鑒定并保存;BALB/c小鼠購自江蘇華創(chuàng)信諾生物公司?？寺【闐H5α、建庫菌株XL1-Blue均由本室保存。

1.2 載體、細胞、試劑耗材 建庫載體pComb3-XSS、抗體IgG表達載體pGI由本室構(gòu)建及保存;HEK293F購自ATCC;人單核細胞系THP-1由本室保存;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑購自TaKaRa公司;SfiI內(nèi)切酶、T4鏈接酶購自NEB公司;TNF-α CBA試劑盒購自BD公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 文庫構(gòu)建 經(jīng)知情同意及倫理審查,從鼠疫疫苗II期臨床項目中采集完成3次免疫后的志愿者全血標本共5份,每份采集10 mL抗凝血。使用Ficoll密度梯度離心分離外周血單個核細胞(PBMC),使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取總RNA,然后采用Roche公司的第一鏈cDNA合成試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis for RT-PCR進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)文獻報道方法擴增抗體的輕鏈及重鏈可變區(qū)基因,并且經(jīng)過融合PCR鏈接成ScFv片段[11]。ScFv片段經(jīng)SfiI酶切后與同樣經(jīng)SfiI酶切的pComb3XSS載體鏈接后電擊宿主菌XL1-Blue感受態(tài)制備噬菌體抗體文庫,噬菌體抗體文庫經(jīng)野生型輔助噬菌體VCSM13包裝后進行后續(xù)篩選,具體方法按文獻進行[12]。

1.4 文庫篩選 按照結(jié)合、洗滌、洗脫、擴增的方式,對上述噬菌體展示抗體文庫進行親和淘選。將重組表達的鼠疫LcrV抗原包被于免疫管中進行固相化,包被濃度依次為500、300、200 ng/mL。具體步驟如下:向免疫管中加入相應(yīng)量的LcrV蛋白,4 ℃包被過夜;棄上清,0.05% PBST 洗板3次,加入 3% BSA 37 ℃封閉 2 h;棄封閉液,0.05% PBST 洗板3次,加入抗體文庫,37 ℃先振蕩孵育1 h,再靜置孵育1 h;棄上清,0.1% PBST洗滌10次,加入pH2.2的0.1 mol/L Gly-HCl洗脫,再用2 mol/L Tris中和至pH7.0,取10 μL測定滴度,剩余噬菌體感染XL1-Blue宿主菌后進行擴增,次日用PEG6000沉淀噬菌體再進行下一輪篩選。

1.5 陽性克隆鑒定 從第三輪篩選測滴度的平板上隨機挑取96個單菌落于96孔深孔板中,37 ℃、260 r/min培養(yǎng)4 h,然后1∶10轉(zhuǎn)接至新的深孔板中再震蕩培養(yǎng)4 h,加入1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)過夜。次日用間接ELISA法檢測上清中抗體的表達,具體如下:首先將鼠疫LcrV抗原以200 ng/孔包被于96孔酶標板中,加入50 μL 3%脫脂牛奶和50 μL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細菌上清,37 ℃震蕩孵育1 h,PBST洗板3次,加入HRP標記的抗M13噬菌體單克隆抗體,37 ℃孵育30 min后,PBST洗板,加入TMB顯色液顯色10 min,用2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)后讀取OD450的吸光度值。陽性克隆提質(zhì)粒后送測序,測序結(jié)果經(jīng)IMGT數(shù)據(jù)庫比對抗體可變區(qū)的基因序列,選取序列有差異的克隆進行全抗體表達。

1.6 抗鼠疫LcrV人源IgG1型全抗體表達 將LcrV抗體的重鏈可變區(qū)基因經(jīng)AgeI和SalI酶切位點克隆入全抗體表達載體pGI-H,輕鏈基因經(jīng)AgeI和Bsiw I酶切位點克隆入pGI-K載體。測序正確后,使用PEI轉(zhuǎn)染試劑將雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293F細胞,5 d后收取細胞上清,用Protein A柱純化目的抗體。

1.7 LcrV人源抗體與LcrV抗原結(jié)合特異性鑒定 采用間接ELISA及Western blot法鑒定人源抗體與LcrV抗原的結(jié)合特異性。首先,將LcrV蛋白以200 ng/孔包被96孔酶標板,純化抗體從1 μg/mL開始倍比稀釋,一抗37 ℃孵育1 h,PBST洗滌后加入HRP標記的抗人IgG,然后37 ℃孵育30 min,后TMB顯色,終止后讀取OD450吸光度值,每個樣品重復(fù)3次取平均值。然后,對目的抗體進行Western blot檢測,將10 μg的LcrV蛋白經(jīng)SDS-PAGE后,將PAGE膠上蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜中,經(jīng)3%脫脂牛奶封閉及重組LcrV人源單抗孵育,洗滌后加入HRP標記的抗人IgG。最后用DAB直接在PVDF膜上顯色。

1.8 抗體親和力測定 本研究使用生物膜干涉技術(shù)(BLI)檢測人源抗體與LcrV抗原結(jié)合的親和力及動力學(xué)參數(shù)[13]。使用Pro A傳感器將抗體固化于傳感器表面,再與稀釋后的LcrV抗原反應(yīng),通過分析表面光干涉的改變得到分子間相互作用的的信息。使用Octet Red 96 大分子作用儀實時監(jiān)測整個結(jié)合及解離過程。具體操作方法參考儀器說明書。

1.9 重組單抗對LcrV抗原激活免疫細胞的影響 將THP-1細胞株以4×105/孔接種于12孔板中,加入5 μg/mL的PMA(Sigma, p8139)37 ℃培養(yǎng)48 h,換無血清Opti-MEM培養(yǎng)過夜。次日,將測試單抗以50 μg/mL與5 μg/mL的LcrV抗原先37 ℃孵育1 h,加入誘導(dǎo)分化的THP-1細胞中,只加5 μg/mL的LcrV抗原作為陽性對照,用THP-1細胞作為mock對照。所有細胞培養(yǎng)24 h后收集上清,用BD TNF-α CBA(CB45641127)試劑盒檢測,以標準品濃度曲線計算待測上清中TNF-α濃度值。

1.10 動物保護試驗 在青海省地方病預(yù)防控制所鼠疫專業(yè)BSL-3實驗室完成該部分實驗工作。每組4只6～8周齡雌性BALB/c小鼠,將500 μg/只的重組LcrV抗體提前24 h經(jīng)腹腔注射小鼠,次日經(jīng)皮下多點注射攻毒100 MLD的強毒標準株141鼠疫菌。同時用4只未免疫抗體的小鼠注射100 MLD強毒株做未免對照,用于驗證毒株的毒力。完成免疫及攻毒后,將小鼠飼養(yǎng)在密封動物籠具中,每日記錄小鼠死亡情況,對于死亡的小鼠進行解剖后,取心、肝、肺臟器進行壓印平板培養(yǎng)鼠疫菌,對培養(yǎng)陽性菌用鼠疫菌特異性噬菌體裂解驗證。

2 結(jié) 果

2.1 人源抗鼠疫耶爾森菌噬菌體文庫的構(gòu)建 收集了5份鼠疫疫苗接種自愿者的外周全血,通過密度梯度離心分離出PBMC,分別提取RNA和反轉(zhuǎn)錄,然后將cDNA等比例混合后用19對人ScFv引物分別擴增抗體的輕重鏈可變區(qū)基因。酶切后連接噬菌體載體,連接產(chǎn)物電擊2次XL1-Blue感受態(tài)細胞,測定文庫的庫容量達7.54×108CFU,經(jīng)菌落PCR驗證文庫中正確插入率為100%。

2.2 人源抗體的篩選及抗體序列分析 經(jīng)3輪篩選后,挑取的96個單克隆菌落,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)及噬菌體ELISA,確定OD450值>1.0的陽性克隆29個,經(jīng)測序后得到輕重鏈序列完整的克隆26株,如圖1。經(jīng)過IMGT數(shù)據(jù)庫比對序列,獲得3株特異性單克隆抗體,分別命名為RV-B4、RV-D1、 RV-E8。3株抗體序列經(jīng)IMGT數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)RV-B4抗體的VH基因為VH1-46家族,輕鏈為Lambda 1-51;RV-D1和RV-E8重鏈均為VH3-30,輕鏈分別為Kappa鏈的VK3-20和VK1-39胚系基因,如表1所示。3株抗體的重輕鏈CDR區(qū)氨基酸序列如表2,其中RV-E8的重鏈CDR3長達22個氨基酸,這提示該抗體經(jīng)歷過較長的進化成熟,其親和力理論上較高。

圖1 噬菌體ELISA篩選文庫中的目的抗體Fig.1 Using phage ELISA to select antibodies in library

表1 3株LcrV特異性抗胚系基因及變異度分析Tab.1 Germline variation and deviation analysis of 3 LcrV-specific antibodies

表2 3株LcrV抗體CDR區(qū)氨基酸序列比對Tab.2 Amino acid sequence alignment of 3 LcrV antibodies’ CDR

2.3 人源抗體與LcrV抗原結(jié)合特異性鑒定 為了進一步確定表達純化的3株人源抗體與LcrV抗原結(jié)合的特異性,我們分別進行了抗體與LcrV重組蛋白的間接ELISA和Western blot實驗。如圖2A,3株人源抗體與LcrV重組蛋白ELISA結(jié)果顯示此抗體均能與LcrV抗原特異性結(jié)合,且對該重組抗體的檢測靈敏度可達3 ng/mL左右。Western blot結(jié)果顯示2株抗體均能與LcrV抗原反應(yīng),在37 kDa處出現(xiàn)明顯條帶,同時此結(jié)果顯示該抗體均識別抗原上的線性表位,如圖2B。

注:A. 3株人源單抗與LcrV蛋白間接ELISA結(jié)果;B. 3株抗體與LcrV蛋白的Western blot結(jié)果;M. 相對分子質(zhì)量標準;1、2和3分別為RV-B4、RV-D1和RV-E8抗體。圖2 3株人源單克隆抗體與LcrV重組蛋白結(jié)合特異性鑒定Fig.2 Characterization of binding specificity of 3 mAbs to LcrV antigen

2.4 抗體親和力測定 利用膜干涉技術(shù),對3個人源單克隆抗體分別與LcrV抗原結(jié)合、解離數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果表明,3個鼠疫抗體與LcrV抗原都有很高的親和力,其中RV-E8的KD值最高,為1.24 nmol/L,而RV-B4和RV-D1的KD值分別為2.1 nmol/L和42 nmol/L。見圖3。

圖3 3株人源抗體與LcrV抗原結(jié)合的動力學(xué)分析結(jié)果Fig.3 Kinetic analysis result of 3 human antibodies binding to LcrV protein

2.5 重組RV單抗對LcrV抗原免疫調(diào)節(jié)功能的影響 已發(fā)現(xiàn)的抗LcrV主要通過調(diào)理作用,干擾V抗原抑制單核細胞、中性粒細胞等吞噬細胞的吞噬功能和炎性應(yīng)答。我們選擇人單核細胞株THP-1為靶細胞系,用PMA在體外將其誘導(dǎo)分化為巨噬細胞,模擬研究LcrV抗原對吞噬細胞的免疫調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)與mock細胞相比出現(xiàn),LcrV抗原刺激后,細胞活化,分泌高水平的TNF-α,將3株單抗分別與LcrV抗原預(yù)孵育后, 發(fā)現(xiàn)RV-D1抗體有下調(diào)TNF-α的趨勢,但與陽性對照LcrV經(jīng)非參數(shù)配對t檢驗,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.25),如圖4。提示這3株抗LcrV單抗體外干擾V抗原的免疫調(diào)節(jié)功能不顯著,為進一步明確,我們進行了3株抗體的動物保護實驗。

圖4 單抗對LcrV抗原激活免疫細胞釋放TNF-α的影響Fig.4 Effect of mAbs on LcrV-induced TNF-α releasing from THP-1 cells

2.6 動物實驗結(jié)果 小鼠經(jīng)過免疫單抗、鼠疫141強毒菌株攻毒后,發(fā)現(xiàn)所有動物均在觀察期內(nèi)死亡,包括只注射100 MLD的對照組動物。結(jié)果提示3株RV抗體均沒有對BALB/c小鼠有免于死亡的保護作用,100 MLD的未免疫對照組小鼠也全部死亡,如圖5A。所有死亡小鼠取心、肝、脾、肺臟經(jīng)過壓印赫氏平皿,次日平皿上均有菌落長出(圖5B),經(jīng)鼠疫菌鑒別噬菌體裂解驗證,壓印菌均出現(xiàn)紅色虛線區(qū)域的清晰噬菌帶(圖5C),確認小鼠死亡皆由鼠疫菌導(dǎo)致。

注:A. 攻毒試驗中小鼠生存曲線;B. 死亡動物心、肝、脾、肺壓印赫氏平皿后細菌生長情況;C.鼠疫特異性噬菌體裂解鼠疫菌形成的噬菌帶。圖5 LcrV重組單抗對小鼠保護性試驗Fig.5 Protection ability of anti-LcrV mAbs against Y. psetis

3 討 論

雖然現(xiàn)在并非處于鼠疫大流行的時期,但是鼠疫仍然處于高度散發(fā)狀態(tài)。根據(jù)WHO統(tǒng)計,2013-2018年全球共報告了2 886例鼠疫,其中死亡504例[14]。

F1單抗具有保護性已經(jīng)得到了充分的驗證,1997年美國陸軍傳染病醫(yī)學(xué)研究所最早報道了1株針對F1抗原的F1-04-A-G1單抗,此抗體在小鼠模型中具有100%的保護力,由于安全原因,該抗體的序列至今沒有公布[15]。2017年陳薇院士團隊報道的F2H5鼠單抗,同樣也是針對F1靶標,該抗體進行了人源化后100 μg即可對小鼠起到完全保護[16]。吳智遠等[17]于2018年報道了1株針對F1的4C6鼠單抗。關(guān)于LcrV抗體報道的比較少,目前能檢索到的僅Hill J等報道的mAb7.3單克隆抗體為第1個具有保護性的抗-V抗原抗體[10],后續(xù)又發(fā)現(xiàn)mAb7.3與F1-04-A-G1聯(lián)用具有協(xié)同作用[18]。

據(jù)之前文獻報道LcrV是通過識別免疫細胞表面的TLR2/6和CD14分子而進行免疫調(diào)節(jié)[19],然而,根據(jù)本研究從多個角度對3株單抗的生物學(xué)活性進行評測結(jié)果來看,此3株抗體雖為LcrV特異性人源單抗抗體,但是在體外并不能明顯影響LcrV與TLR2/6和CD14分子的結(jié)合,進而減弱其對免疫細胞的進一步活化。同時,也沒有在動物實驗中表現(xiàn)出明顯的動物體內(nèi)保護性的效果,根據(jù)英國學(xué)者Hill J等[18]報道,LcrV單抗在與F1單抗連用時候可以明顯提高抗體組合的保護效果,其說明LcrV單抗對F1單抗有一定的協(xié)同效應(yīng),本研究報道的3株單抗是否也具有此特性,有待進一步研究。

利益沖突：無