劉晗慧 李增蔚 李 奕 吳 杰 聞 慧 吳勁宇鄧尚貴 袁鵬翔，

（1浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000；2舟山技師學(xué)院，浙江 舟山 316000）

金槍魚在我國遠(yuǎn)洋漁業(yè)中占據(jù)重要地位，2022 年金槍魚捕撈量達(dá)34.55 噸［1］。魚骨占魚體總質(zhì)量的20%～30%，其鈣化物（57.2%）含量豐富、生物利用度高，是低價(jià)生物鈣素的潛在來源［2］。但在生產(chǎn)過程中，魚骨多被加工成低值動(dòng)物飼料或直接丟棄，造成水產(chǎn)資源的浪費(fèi)［3］。魚骨成粉可顯著提高魚骨的食用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，魚骨粉中的鈣離子和磷酸基團(tuán)的釋放度、流動(dòng)性、溶解度和持水能力等會(huì)隨其粒徑減少而增強(qiáng)［4］。然而，魚骨中鈣、磷酸基團(tuán)與膠原纖維構(gòu)成的牢固網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)很難使其被超細(xì)粉碎。研究者常使用球磨法［5］制備高純度的納米級魚骨粉，利用氣流粉碎法［6］和膠體磨法［7］等制備微米級或亞微米級等超微魚骨粉，但均存在耗時(shí)長、能耗大、生產(chǎn)效率低等問題［8］。

擠壓膨化技術(shù)是集混合、攪拌、破碎、膨化及成型為一體的技術(shù)，具有多功能、高產(chǎn)量、高品質(zhì)等特點(diǎn)［9］。堅(jiān)硬原料如魚骨在擠壓膨化過程中，常添加淀粉作為關(guān)鍵膨化輔助劑以調(diào)節(jié)原料膨化程度［10］。Ali 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，玉米淀粉在130 ℃下經(jīng)擠壓膨化后可高效制備改性玉米淀粉產(chǎn)物。Philipp 等［12］將豌豆蛋白添加至大米淀粉中，在溫度130 ℃、轉(zhuǎn)速400 r·min-1條件下，可高效且低能耗制備得到高膨化度且疏松多孔的產(chǎn)物。由此可見，以淀粉作為輔助劑的擠壓膨化方法為超細(xì)金槍魚骨粉的高效制備提供了有效手段。

魚骨粉因其鈣離子、磷酸基團(tuán)釋放度高而有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)無機(jī)鹽成為功能性魚糜凝膠增強(qiáng)劑［13］。魚糜的凝膠特性主要取決于鹽溶性蛋白在凝膠過程的膠凝情況，目前常用NaCl 和CaCl2等無機(jī)鹽中的Na+和Ca2+等金屬離子促進(jìn)魚糜蛋白質(zhì)中離子交換、增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子之間的凝聚，以及加強(qiáng)蛋白質(zhì)之間水和能力的穩(wěn)定性［14］。而超細(xì)魚骨在釋放大量Ca2+的同時(shí)，還可能釋放、暴露出與魚糜肌動(dòng)蛋白結(jié)合的其他基團(tuán)或基團(tuán)末端，以進(jìn)一步促進(jìn)凝膠的形成［15］。此外，魚骨粉還富含磷和膠原蛋白等營養(yǎng)成分，可增加魚糜的營養(yǎng)及保健價(jià)值。

本研究以金槍魚骨為原料，利用擠壓膨化法制備超微魚骨粉，并與未經(jīng)擠壓膨化粉碎魚骨粉的物化性質(zhì)進(jìn)行比較，明確擠壓膨化技術(shù)制備超微魚骨粉的效果。通過與NaCl、CaCl2、大米+淀粉、未經(jīng)擠壓膨化魚骨粉等對魚糜凝膠效果的對比研究，明確擠壓膨化超微魚骨粉對魚糜凝膠品質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)的影響，旨在實(shí)現(xiàn)金槍魚魚骨副產(chǎn)物的高值化開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚骨、冷凍帶魚魚糜，浙江省興業(yè)集團(tuán)有限公司；大米、淀粉、食鹽、腸衣（直徑25 mm）均為市售；其他化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.2 儀器與設(shè)備

單螺桿擠壓膨化機(jī)，永城市圣輝機(jī)械設(shè)備有限公司；Zetasize Nano ZS90 激光粒度分布儀，英國Malvern公司；Tensor Ⅱ傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker 公司；S35-LA993 斬拌機(jī)，濟(jì)南九陽股份有限公司；CS-210精密色差儀，杭州彩譜科技有限公司；iTexture 結(jié)構(gòu)測試儀，浙江浙科儀器設(shè)備有限公司；Thermo He 型高速冷凍離心機(jī)，上海賽默飛世爾科技有限公司；PQ001低場核磁分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；U-2800紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；HR-20旋轉(zhuǎn)流變儀，美國TA儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基于擠壓膨化技術(shù)制備亞微米-納米級魚骨粉 將魚骨切成約5 cm 小段后于沸水中煮20 min，自來水沖洗干凈后70 ℃烘干，并利用粉碎機(jī)初步粉碎魚骨。初步粉碎的魚骨（40.00%）與大米（52.50%）、淀粉（7.50%）混合均勻后用單螺桿膨化機(jī)在130 ℃、轉(zhuǎn)速400 r·min-1條件下處理［16］，所得產(chǎn)物用粉碎機(jī)再次粉碎制得擠壓膨化魚骨粉（extruded expanded fish bone meal，EE-FB）；另取與上述步驟中等比例的魚骨粉（40.00%）與大米（52.50%）、淀粉（7.50%），大米與淀粉先用單螺桿擠壓膨化機(jī)同條件下處理，再與初步粉碎的魚骨混合均勻后利用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，得到未經(jīng)擠壓膨化魚骨粉（non-extruded expanded fish bone meal，N-FB）。對比研究EE-FB 和N-FB，確定擠壓膨化制備亞微米-納米魚骨粉的方法。

1.3.2 亞微米-納米級魚骨粉物化特性測定

1.3.2.1 魚骨粉的粒徑測定 采用激光粒度分布儀測定魚骨粉粒度，對比研究EE-FB 組和N-FB 組粒徑大小。即以純水為分散介質(zhì)，以2%（NaPO3）6為分散劑，超聲15 min 使樣品分散均勻。利用Zetasizer Software Version 7.13 軟件分析結(jié)果。魚骨粉的粒徑采用平均直徑和粒徑分布表示。

1.3.2.2 魚骨粉的傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）測定 利用FT-IR光譜儀對比分析EE-FB 和N-FB 兩組魚骨粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)。將約1 mg魚骨粉與溴化鉀（KBr） （1∶100，w/w）混合，手動(dòng)壓成半透明薄片，以空白KBr 為掃描背景，F(xiàn)T-IR 掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描64次。

1.3.2.3 魚骨粉的化學(xué)組成測定 對比研究EE-FB和N-FB兩組魚骨粉的主要化學(xué)組分。參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》［17］中的直接干燥法測定樣品水分；參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》［18］中的凱氏定氮法測定樣品粗蛋白質(zhì)含量；參照GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》［19］中的索氏抽提法測定樣品脂肪含量；參照GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》［20］中的總灰分測定法測定樣品灰分含量；參照GB 5009.268-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》［21］測定樣品鈣含量。

1.3.3 擠壓膨化亞微米-納米級魚骨粉對魚糜凝膠品質(zhì)的影響研究

1.3.3.1 魚糜凝膠的制備 將冷凍帶魚魚糜在4 ℃下過夜解凍，切碎并斬拌2 min，添加2.5%NaCl 鹽擂2 min，分為5 組。其中，1 組不添加任何物質(zhì)（NaCl組），其他4組分別加入1.125%大米+淀粉（大米+淀粉組）、0.75%的N-FB（N-FB 組）、0.2%的CaCl2（CaCl2組）及0.75%的EE-FB（EE-FB組）（經(jīng)試驗(yàn)測得0.75%EE-FB 對魚糜凝膠品質(zhì)影響效果最好；0.75% N-FB和0.75% EE-FB均以魚骨粉質(zhì)量計(jì)；0.2%的CaCl2和魚骨粉鈣含量相當(dāng)）［22］。5 組都加入一定量的冰水，調(diào)節(jié)水分含量為78%，斬拌3 min，制作溫度控制在10 ℃以下。魚糜灌腸成型后，采用二段加熱法（40 ℃-30 min；90 ℃ -20 min）凝膠化，冰水冷卻后4 ℃貯藏。對比研究EE-FB對魚糜凝膠性能的影響。

1.3.3.2 魚糜凝膠色差測定 將待測樣品切成20 mm厚的圓柱體，于室溫下平衡30 min。利用色差儀分別測定NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB組魚糜凝膠的L*（亮度）、a*（紅/綠色）、b*（黃/藍(lán)色）值。按公式（1）計(jì)算白度（W）值：

1.3.3.3 魚骨凝膠質(zhì)構(gòu)特性測定 將待測樣品切成20 mm×20 mm 圓柱體。采用P/0.5 S 球形探頭測定NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度，測試前、中、后速度分別為1.0、1.0、10.0 mm·s-1，觸發(fā)力5.0 g，形變50%，測定并記錄斷裂力（g）和形變量（mm）。魚糜的凝膠強(qiáng)度表示為公式（2）：

采用直徑為35 mm（P/35）的圓柱形鋁制探頭對凝膠圓柱體進(jìn)行兩次循環(huán)壓縮測試，測試前、中、后速度分別為1.0、1.0、10.0 mm·s-1，觸發(fā)力為5.0 g，形變量為50%，下壓高度為10.0 mm，測定并分析樣品的硬度、彈性、咀嚼性和膠黏性［23］。

1.3.3.4 魚凝膠持水力和蒸煮損失率測定 分別準(zhǔn)確稱取NaCl組、大米+淀粉組、N-FB組、CaCl2組、EE-FB組魚糜凝膠樣品3.0 g（w1），3層濾紙包裹后，于50 mL離心管中4 ℃和5 000×g離心15 min，再次稱重（w2）。按公式（3）計(jì)算持水力（water holding capacity，WHC）：

將切成薄片的各組魚糜樣品稱重（m1）后放入封口蒸煮袋，90 ℃恒溫水浴20 min，迅速取出魚糜凝膠，輕柔擦去表面液體后再次稱重（m2）。按公式（4）計(jì)算蒸煮損失率：

1.3.3.5 魚糜凝膠低場核磁共振測定 分別取NaCl組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組各組魚糜凝膠樣品置于高2.5 cm 的核磁管中，采用核磁共振分析儀測定橫向弛豫時(shí)間常數(shù)T2，根據(jù)T2圖譜中各峰面積計(jì)算不同類型水分含量的比例。

1.3.4 擠壓膨化亞微米-納米級魚骨粉對魚糜凝膠蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

1.3.4.1 魚糜糊的流變特性測定 利用流變儀測定NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜糊的儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G″）。即將魚糜糊均勻涂抹在測試平臺，用硅油密封，采用溫度掃描模式測定，測定參數(shù)為振蕩頻率1 Hz、應(yīng)變2%、平行板間距1 mm，升溫掃描范圍20～90 ℃、升溫速率4 ℃·min-1［24］。

1.3.4.2 魚糜凝膠的化學(xué)作用力測定 準(zhǔn)確稱取NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠樣品3.0 g，分別與10 mL不同的SA （0.05 mol·L-1NaCl）、SB （0.6 mol·L-1NaCl）、SC （0.6 mol·L-1NaCl+1.5 mol·L-1尿素）、SD （0.6 mol·L-1NaCl+8 mol·L-1尿素）、SE （0.6 mol·L-1NaCl+8 mol·L-1尿素+0.05 mol·L-1β-巰基乙醇）等化學(xué)作用力破壞試劑混合均質(zhì)，4 ℃攪拌1 h 后離心，測定上清液中的蛋白濃度［25］。化學(xué)作用力以組間上清液蛋白濃度差表示：離子鍵為SB 與SA 差，氫鍵為SC 與SB 差，疏水作用力為SD 與SC 差，二硫鍵為SE與SD差。

1.3.4.3 魚糜凝膠的FT-IR 測定 將NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠樣品冷凍干燥后，取1 mg 干燥后的樣品與KBr 混合研磨后壓片。FT-IR 吸收光譜范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描64 次。對所得圖譜中酰胺Ⅰ帶進(jìn)行去卷積、二階求導(dǎo)，并通過高斯曲線擬合得到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的相對含量變化。

1.3.4.4 魚糜凝膠的掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察 將制備好的NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠樣品用刀片切成1 mm 厚度的小片，采用戊二醛溶液固定，用磷酸鹽緩沖液洗滌，依次進(jìn)行乙醇脫水、叔丁醇置換、冷凍干燥和噴金處理，在加速電壓3 kV 下放大10 000 倍觀察魚糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，每次樣品檢測重復(fù)3 次以上。用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，顯著性差異檢驗(yàn)使用Duncan 多重檢驗(yàn)，差異顯著為P＜0.05。用Origin 8.6軟件制圖，結(jié)果以±s的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 擠壓膨化魚骨粉的物化特性

EE-FB 和N-FB 見圖1-A，EE-FB 較N-FB 的顏色更深，粒徑結(jié)果如圖1-B 和圖1-C 所示。結(jié)果表明，N-FB 的平均粒徑為465.03 nm，其中僅有10.80%小于100 nm（納米級），且17.24%的魚骨粉粒徑高于1 000 nm（微米級，有沙礫感）。而EE-FB 組平均粒徑達(dá)308.07 nm，顯著小于N-FB 組（P＜0.05），且約有59.41%的魚骨粉粒徑屬于亞微米級（100～1 000 nm），約有40.59%的魚骨粉粒屬于納米級（1～100 nm）。由此可見，擠壓膨化可顯著減少魚骨粉的粒徑，可高效地制備亞微米-納米級魚骨粉。圖1-D 是N-FB 組和EE-FB組的FT-IR結(jié)果，兩者圖譜基本相同，都暴露出較多的羥基、磷酸基團(tuán)，由此可知，高溫高壓的擠壓膨化過程并沒有破壞魚骨原有的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)。N-FB 組和EE-FB 組的水分、粗蛋白、脂肪、灰分和鈣元素含量測定結(jié)果見表1。EE-FB 組的各組分含量均顯著低于N-FB 組（P＜0.05），但兩組的灰分含量均為最高，粗蛋白含量次之。灰分的主要成分為羥基磷灰石，其含有豐富的鈣、磷等礦物元素［26］，且EE-FB 組鈣含量達(dá)灰分總量的40.00%，高于N-FB 組的37.06%。由此可見，擠壓膨化可高效制得亞微米-納米級魚骨粉，其粒徑更細(xì)小且為鈣源豐富的蛋白原料，更適于高值化產(chǎn)品的開發(fā)。

表1 魚骨粉基本成分及含量Table 1 Basic composition and content of fish bone meal/%

圖1 擠壓膨化魚骨粉（EE-FB）與未擠壓膨化魚骨粉（N-FB）的物化性質(zhì)Fig.1 Physical and chemical properties of extruded expanded fish bone meal（EE-FB） and non-extruded expanded fish bone meal （N-FB）

2.2 擠壓膨化亞微米-納米級魚骨粉對魚糜凝膠品質(zhì)的影響

2.2.1 魚糜凝膠色差 色差能反映魚糜凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)也是評價(jià)魚糜凝膠色澤和品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其變化與蛋白質(zhì)成分、變性、聚合、交聯(lián)程度及表面的光學(xué)特性密切相關(guān)［27］。NaCl 是魚糜加工過程中常用的凝膠增強(qiáng)劑。由表2 可知，與NaCl 組魚糜凝膠相比，CaCl2組魚糜凝膠的L*無顯著差異，b*值顯著減小，W顯著增加；大米+淀粉組魚糜凝膠的L*、a*、b*、W均無顯著差異；而N-FB 組和EE-FB 組魚糜凝膠的L*和W均顯著減小，b*顯著增加，相比之下，0.75%EEFB魚糜凝膠組的色差變化更大（圖2）。

表2 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜凝膠色度和白度的影響Table 2 Effects of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on color and whiteness of surimi gel

圖2 添加不同凝膠物的魚糜凝膠圖Fig.2 Diagrams of surimi with the addition of different gels

2.2.2 魚糜質(zhì)構(gòu)特性 破斷力和破斷距離是影響魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的關(guān)鍵參數(shù)，兩者均與凝膠強(qiáng)度呈正相關(guān)［23］。由表3可知，EE-FB組魚糜凝膠的破斷力和破斷距離最大，其凝膠強(qiáng)度也最強(qiáng)（1 249.65 g·mm），且顯著高于其他組。相比NaCl魚糜凝膠組，EE-FB 組魚糜凝膠的硬度、彈性、咀嚼性和膠黏性都顯著升高；大米+淀粉組魚糜凝膠的彈性和咀嚼性無顯著變化，而硬度和膠黏性顯著降低；添加N-FB 雖能顯著增強(qiáng)魚糜凝膠的強(qiáng)度、硬度和膠黏性，但無法增強(qiáng)其彈性；添加CaCl2雖可顯著增加魚糜凝膠的強(qiáng)度、彈性和咀嚼性，但無法改善其硬度和膠黏性。綜合分析，EE-FB 提高魚糜的質(zhì)構(gòu)特性的作用最佳。

表3 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 3 Effects of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on texture of surimi gel

2.2.3 魚糜凝膠持水力、蒸煮損失率和水分狀態(tài) 不同處理組魚糜凝膠持水力和蒸煮損失率結(jié)果如圖3-A所示，EE-FB 組魚糜凝膠的持水力顯著高于其他組，而蒸煮損失顯著低于其他組；CaCl2組的魚糜凝膠持水力顯著低于其他組，而蒸煮損失顯著高于其他組；NFB 組、NaCl 組和大米+淀粉組的魚糜凝膠持水力和蒸煮損失率均維持在中間水平。因此，EE-FB 可提高魚糜凝膠及其在熱加工過程中的持水能力和凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度。圖3-B為不同處理魚糜凝膠組的低場核磁共振結(jié)果，圖中每個(gè)峰的面積與魚糜凝膠不同狀態(tài)的水分體系密切相關(guān)，可精確計(jì)算出結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水的含量。魚糜凝膠中的結(jié)合水能使魚糜凝膠維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，計(jì)算結(jié)果表明，大米+淀粉組、N-EB組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠中的結(jié)合水含量相比NaCl 組分別增加了1.06、3.08、0.39、1.72 個(gè)百分點(diǎn)，即EE-FB 可最大程度增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)與水分子之間的作用力，促進(jìn)魚糜凝膠中自由水向更穩(wěn)定的結(jié)合水轉(zhuǎn)化。這與持水性及蒸煮損失率的結(jié)果一致，輔證了EE-FB可有效改善魚糜凝膠的持水性。

圖3 不同處理組魚糜凝膠持水力和蒸煮損失率結(jié)果Fig.3 The results of water holding capacity and steaming loss of surimi gel in different groups

2.3 擠壓膨化亞微米-納米級魚骨粉對魚糜凝膠蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 魚糜糊蛋白流變特性 流變特性可反映魚糜蛋白的非破斷凝膠特性，其中，常用儲(chǔ)能模量（G′）反映樣品的彈性趨勢，損耗模量（G″）表示樣品的粘性趨勢［24］。NaCl組、大米+淀粉組、N-FB組、CaCl2組、EE-FB組魚糜糊蛋白的G′和G″變化趨勢分別見圖4-A 和圖4-B。各組魚糜糊的G′始終大于G″，表明其具有較高的彈性。溫度從20 ℃升至90 ℃的過程中，NaCl 組、大米+淀粉組、CaCl2組魚糜表現(xiàn)出相似的流變特性，即G′值均在55～60 ℃達(dá)到最低點(diǎn)，之后緩慢上升，并在80 ℃后基本保持不變。相比之下，N-FB 組和EE-FB組魚糜糊均在43 ℃左右到達(dá)最低點(diǎn)，隨后急劇上升，分別在55 和80 ℃達(dá)到最大G′值，其中EE-FB 組魚糜糊的最大G′值可達(dá)11 136.5 Pa，遠(yuǎn)高于其他組。同時(shí)，不同處理組的G″變化趨勢和G′相似，在79 ℃后，EE-FB 組魚糜糊蛋白的G″值最大且遠(yuǎn)高于其他組。魚糜糊蛋白流變特性結(jié)果表明，EE-FB 組具有最高的蛋白質(zhì)交聯(lián)密度，因此能表現(xiàn)出最好的蛋白凝膠彈性（表3），即EE-FB 能最大程度改善魚糜糊蛋白的流變特性。

圖4 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜糊流變特性的影響Fig.4 Effect of NaCl，rice + starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the rheological properties of surimi paste

2.3.2 魚糜凝膠蛋白的化學(xué)作用力 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB 對魚糜凝膠化學(xué)作用力的影響見圖5。相比NaCl 組，EE-FB 組魚糜凝膠的離子鍵有所下降（下降1.08 g·L-1），但仍維持在較高的水平，而大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組魚糜凝膠的離子鍵含量則分別下降了7.24、4.04、2.11 g·L-1。EE-FB 和CaCl2可顯著增強(qiáng)魚糜凝膠的疏水相互作用和二硫鍵，且EE-FB 的增強(qiáng)效果最顯著。相比NaCl 組，N-FB 組魚糜凝膠的二硫鍵含量無顯著變化且疏水相互作用顯著減小，大米+淀粉組魚糜凝膠的疏水相互作用顯著升高而二硫鍵含量顯著減少。離子鍵主要用來穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的聚集，疏水相互作用和二硫鍵是支撐凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力，因此，EE-FB 可最大程度優(yōu)化魚糜凝膠蛋白的結(jié)構(gòu)并促進(jìn)其凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。

圖5 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.5 Effect of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the chemical force of surimi gels

圖6 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜凝膠二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the protein secondary structure of surimi gel

2.3.3 魚糜凝膠蛋白的二級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要包括β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)，高含量的β-折疊和低含量α-螺旋能維持魚糜較好的凝膠特性［28］。相比NaCl 組魚糜凝膠，大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠的β-折疊含量分別顯著增加了0.49、0.30、2.06、2.34個(gè)百分點(diǎn)；且EE-FB 組的α-螺旋含量顯著減少。由此可見，EEFB 可最大程度增加β-折疊和降低α-螺旋的作用，進(jìn)而增強(qiáng)魚糜凝膠強(qiáng)度。

2.3.4 魚糜凝膠蛋白的SEM NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2、EE-FB 對魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響見圖7，其中NaCl 組魚糜的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多孔且不均勻（圖7-A），N-FB（圖7-C）、CaCl2（圖7-D）、EE-FB（圖7-E）促使魚糜形成了致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。且EE-FB組（圖7-E）魚糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較N-FB 組（圖7-C）、CaCl2組（圖7-D）更為致密，這與上述魚糜凝膠強(qiáng)度（表3）和持水力（圖3-A）結(jié)果一致。

圖7 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB的魚糜凝膠SEM圖Fig.7 SEM image of surimi gels NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB

3 討論

本研究結(jié)果表明，擠壓膨化可使高度有序的金槍魚骨短時(shí)間內(nèi)制備出細(xì)小、均勻的亞微米-納米級魚骨粉。小粒徑的魚骨粉可暴露出更多的鈣離子、磷酸、多肽等末端或基團(tuán)以表現(xiàn)出更好的理化特性［4］。通過對比發(fā)現(xiàn)，擠壓膨化技術(shù)可改變魚骨在加工過程中的物理形態(tài)，不會(huì)改變其基本成分和化學(xué)結(jié)構(gòu)，但EE-FB組的各組分含量相比N-FB 組均顯著降低。Gao 等［29］研究表明，擠壓膨化過程中的高溫會(huì)加速原料中水分蒸發(fā)、誘使部分蛋白質(zhì)和脂肪變性，同時(shí)在擠壓膨化設(shè)備中會(huì)粘黏或殘留少量的魚骨粉，這些因素共同導(dǎo)致EE-FB 組各組分含量降低。Yin 等［5］利用濕法球磨法耗時(shí)6 h 得到納米魚骨粉。本研究通過擠壓膨化技術(shù)在1 min 內(nèi)可制得平均粒徑為308.07 nm 的亞微米-納米級魚骨粉，雖然粒徑達(dá)不到濕法球磨法的大小，但可更節(jié)能、高效地生產(chǎn)亞微米-納米級魚骨粉，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

對比探究EE-FB 對魚糜凝膠品質(zhì)的影響表明，添加大米和淀粉不會(huì)影響魚糜凝膠色澤，但添加N-FB和EE-FB（兩者都含有大米和淀粉）組的L*和W較NaCl組均顯著降低，b*均顯著增加，這表明魚骨粉是影響魚糜凝膠色澤的主要原因。而研究顯示，N-FB 和EE-FB 均為淡黃色，且EE-FB 的黃色更深，其魚糜凝膠b*值也更大，原因可能是未徹底脫去的脂類及蛋白質(zhì)在高溫?cái)D壓膨化過程中氧化褐變［30］。因此，EE-FB作為魚糜凝膠增強(qiáng)劑時(shí)，需調(diào)控魚骨粉的添加量以優(yōu)化魚糜凝膠色澤。EE-FB 組魚糜凝膠強(qiáng)度最大且硬度、彈性及膠黏性均較NaCl 組有顯著提升，翟璐等［22］關(guān)于金槍魚納米魚骨鈣對魚糜凝膠特性影響研究中也有類似結(jié)果。EE-FB 較N-FB 粒徑更小，可釋放更多Ca2+以激活魚糜內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，使谷氨酸和賴氨酸殘基共價(jià)交聯(lián)形成致密蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增大彈性、膠黏性和咀嚼性［31］。同時(shí)，EE-FB 高達(dá)11.96%的蛋白也能賦予魚糜凝膠較高的彈性、膠黏性和咀嚼性。魚骨粉尤其EE-FB 可釋放大量的磷酸基團(tuán)或末端，其可與相鄰多肽鏈的NH3+反應(yīng)，使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，從而增強(qiáng)其凝膠強(qiáng)度和硬度［32］。CaCl2釋放的大量Ca2+也可顯著增強(qiáng)魚糜凝膠的彈性和咀嚼性，但其無法釋放與NH3+高效作用的基團(tuán)，因此CaCl2組的凝膠強(qiáng)度和硬度顯著低于N-FB 組和EE-FB 組。此外，CaCl2為無機(jī)化合物，其可接受程度不及富含蛋白質(zhì)、脂肪和其他營養(yǎng)成分的天然EE-FB。因此，EE-FB 更適合作為魚糜凝膠增強(qiáng)劑。

本研究表明，EE-FB 組魚糜凝膠相比其他組具有最高的持水力和最低的蒸煮損失率，這主要是由于亞微米-納米級的EE-FB中游離的Ca2+、磷酸基團(tuán)及暴露的基團(tuán)或末端誘使魚糜形成的致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能捕獲更多的水分子并將其保留在凝膠網(wǎng)絡(luò)中。此外，這些基團(tuán)或末端還可結(jié)合水分子，增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)與其之間的作用力［33］，促進(jìn)EE-FB 組魚糜凝膠中自由水向更穩(wěn)定的結(jié)合水轉(zhuǎn)化，增加其結(jié)合水含量，從而提高持水能力，并有效降低在熱加工過程中的蒸煮損失率。相比之下，N-FB 顆粒較大，不利于魚糜凝膠致密網(wǎng)絡(luò)的形成及水分的鎖定；而NaCl 和CaCl2釋放的大量游離Cl-可與魚糜蛋白表面帶相反電荷的基團(tuán)結(jié)合，降低了極性氨基酸與水的結(jié)合能力［34］。

本研究中EE-FB 組魚糜糊在79 ℃后的G′和G″值均顯著高于其他組，這表明EE-FB 能使魚糜肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)球蛋白變性形成熱不可逆的凝膠網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高度交聯(lián)，表現(xiàn)出較好的蛋白凝膠粘彈性［35］。本研究表明，EE-FB 可顯著增強(qiáng)魚糜凝膠的疏水相互作用和二硫鍵，這主要?dú)w因于EE-FB 可與魚糜凝膠作用使其肌球蛋白展開，暴露出疏水氨基酸并通過疏水相互作用發(fā)生聚集，形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)暴露更多的巰基并氧化為二硫鍵，促進(jìn)魚糜蛋白交聯(lián)［36］。由此可見，EE-FB能促進(jìn)蛋白質(zhì)的高度交聯(lián)并使其表現(xiàn)出優(yōu)良的粘彈性。此外，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的穩(wěn)定性高于α-螺旋，含有高含量β-折疊和低含量α-螺旋的魚糜凝膠特性更好。本研究顯示，EE-FB 可最大程度增加β-折疊和降低α-螺旋的作用，這主要是由于顆粒細(xì)小且暴露更多活性基團(tuán)的EE-FB 可均勻進(jìn)入魚糜，增強(qiáng)蛋白質(zhì)間相互作用并最終改變蛋白構(gòu)象，進(jìn)而最大程度增強(qiáng)魚糜凝膠強(qiáng)度［37］。

4 結(jié)論

本研究采用擠壓膨化技術(shù)可在1 min 內(nèi)高效細(xì)化魚骨粉的粒徑至308.07 nm，有利于實(shí)現(xiàn)亞微米-納米級魚骨粉的大規(guī)模生產(chǎn)。研究表明，EE-FB 可有效改善魚糜的凝膠特性、流變學(xué)特性、持水力，顯著增強(qiáng)魚糜蛋白凝膠形成過程中疏水相互作用和二硫鍵的交聯(lián)，同時(shí)可顯著提高魚糜凝膠的β-折疊含量并顯著降低α-螺旋含量，進(jìn)而改善魚糜品質(zhì)。因此，EE-FB 能最大程度優(yōu)化魚糜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、改善魚糜糊蛋白的品質(zhì)特性。