秦 紅,張偉宏,馬 杰,納 瑋,馬曉瑞,王彥海,王光俊,樊瑞軍

柯薩奇病毒A6型(CV-A6)屬于小RNA病毒腸道科腸道病毒屬A組,其病毒基因組為單股正鏈RNA,原型株Gdula株是1949年在美國(guó)紐約被首次分離出的[1]。自2008年芬蘭報(bào)道由CV-A6引起的手足口病暴發(fā)以來(lái)[2-3],全球多個(gè)國(guó)家包括中國(guó)的部分地區(qū)都暴發(fā)了以CV-A6為主要病原體的手足口病。法國(guó)、日本和西班牙等國(guó)均有CV-A6引起暴發(fā)疫情的相關(guān)報(bào)道[4-6]。中國(guó)北京、深圳和廣東等地區(qū)CV-A6陽(yáng)性率也較高[7-9]。相關(guān)研究[3,7-8,10-12]表明,2013年以后CV-A6引起手足口病的增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯,已逐漸成為手足口病腸道病毒的優(yōu)勢(shì)基因型。銀川市手足口病監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示,腸道病毒CV-A6已經(jīng)成為2016—2022年銀川市手足口病的優(yōu)勢(shì)病原體。本研究通過(guò)對(duì)2016—2022年銀川市手足口病病原學(xué)監(jiān)測(cè)標(biāo)本中分離培養(yǎng)出的CV-A6毒株進(jìn)行基因測(cè)序、同源性分析及氨基酸變異位點(diǎn)比較,闡明銀川市CV-A6分離株的基因特征,為手足口病的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有標(biāo)本均來(lái)源于2016—2022年銀川市手足口病哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)醫(yī)院,標(biāo)本嚴(yán)格按照《手足口病預(yù)防控制指南》(2009版)要求采集和運(yùn)送,保存于-80 ℃超低溫冰箱,對(duì)復(fù)核后確認(rèn)CV-A6核酸陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞組織培養(yǎng),分離病毒。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離培養(yǎng) 將CV-A6核酸陽(yáng)性的標(biāo)本解凍混勻,接種到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞,設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照,放置于含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,溫度設(shè)置為37 ℃,靜置培養(yǎng)。于7 d 內(nèi)每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況以及有無(wú)病變細(xì)胞,當(dāng)觀察到病變細(xì)胞達(dá)到75%時(shí),收集培養(yǎng)物及上清液,-80 ℃凍存?zhèn)溆?。如? d 內(nèi)未出現(xiàn)細(xì)胞病變,則第2次傳代。若經(jīng)過(guò)2次傳代均未出現(xiàn)細(xì)胞病變則判定病毒分離結(jié)果為陰性。

1.2.2 核酸提取 將收集的培養(yǎng)物及上清液解凍混勻,應(yīng)用上海之江生物科技股份有限公司全自動(dòng)核酸提取儀器(型號(hào)：EX9600)及配套核酸提取試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行病毒RNA核酸提取。

1.2.3 VP1區(qū)基因全長(zhǎng)序列PCR檢測(cè)及測(cè)序 采用一步法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)進(jìn)行VP1區(qū)全長(zhǎng)基因片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共20 μL [2*TS One-Step Reaction Mix 10 μL、One-Step Enzyme Mix 0.4 μL、RNase-Free Water 3.8 μL、上下游引物(10 μM)各0.4 μL、病毒RNA模板5 μL]。腸道病毒A組引物(486/488)：5′- TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNCC -3′,5′ -TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNCC -3′;引物(040/011)：5′-ATGTAYRTICCIMCIGGIGC -3′,5′-GCICCIGAYTGITGICCRAA -3′;反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃、30 min,94 ℃、5 min;(94 ℃、30 s,50 ℃、30 s,72 ℃、1 min),40個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像儀下觀察是否出現(xiàn)符合預(yù)期長(zhǎng)度的目的條帶。將PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物在冷鏈條件下送至武漢昆泰銳生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。RT-PCR擴(kuò)增使用美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)T100梯度型PCR儀,一步法RT-PCR 試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司(批號(hào)Q20721),擴(kuò)增引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 序列拼接、構(gòu)建發(fā)育樹(shù)及同源性分析 原始序列使用DNASTAR SeqMan軟件進(jìn)行拼接和整理,得到病毒分離株VP1區(qū)完整基因序列。序列進(jìn)行“Blast”比對(duì)定型,同時(shí)下載CV-A6的原型株Gdula(AY421764 -USA-1949)及國(guó)內(nèi)[13]CV-A6代表序列作為參考序列;應(yīng)用MEGA 7.0 軟件將本研究中拼接好的83株CV-A6序列和參考序列的核苷酸進(jìn)行比對(duì);采用鄰接法構(gòu)建基于VP1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Bootstrap值設(shè)置為1 000;應(yīng)用DNAStar MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸相似性計(jì)算,分析同源性的區(qū)間。

1.2.5 氨基酸變異位點(diǎn)分析 利用MEGA 7.0 軟件將比對(duì)后的VP1全長(zhǎng)基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列,與原型株進(jìn)行比較查詢存在的氨基酸變異位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 CV-A6毒株分離培養(yǎng) 2016—2022年銀川市共收集到手足口病腸道病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本1 923份,其中CV-A6核酸陽(yáng)性標(biāo)本814份,占比42.3%。采用RD細(xì)胞進(jìn)行病毒培養(yǎng)分離得到CV-A6毒株90株。

2.2 CV-A6分離株的VP1區(qū)擴(kuò)增和測(cè)序 使用一步法RT-PCR擴(kuò)增出CV-A6分離株基因片段,測(cè)序后經(jīng)拼接整理,成功獲得83株CV-A6 VP1區(qū)全長(zhǎng)序列,登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì),結(jié)果均顯示為CV-A6型別。其中2016年11株,2017年12株,2018年37株,2019年6株,2020年4株,2021年8株,2022年5株。

2.3 基于CV-A6分離株完整VP1區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 為分析2016—2022年銀川市83株CV-A6分離株的VP1區(qū)核苷酸進(jìn)化特點(diǎn),從NCBI網(wǎng)站上篩選下載CV-A6的原型株Gdula株(AY421764 -USA-1949)以及具有代表性的參考序列共64條,分別來(lái)自美國(guó)、日本、西班牙、法國(guó)、印度、芬蘭及中國(guó)(含河南省、山東省、上海市、江蘇省、福建省、天津市、廣東省、甘肅省、河北省、山西省、云南省、遼寧省、江西省、湖南省、吉林省、浙江省、四川省等省、市)。CV-A6的原型株Gdula株的分離時(shí)間最早,其余毒株分離時(shí)間均在1992—2015年,將銀川市83株CV-A6分離株與參考序列共同構(gòu)建基于VP1區(qū)全長(zhǎng)序列的系統(tǒng)進(jìn)發(fā)育樹(shù)。將本研究中全部147條CV-A6的序列分為A、B、C和D 4種基因型。A基因型只有1949年美國(guó)分離的原型株Gdula株(AY421764)1株;B基因型由中國(guó)的4株組成,分別是1992年山東株(JQ364886)、2004年廣東株(KP143074)、2005年廣東株(KP143075)和2007年廣東株(KP143078);C基因型由1996年中國(guó)山東株(JQ364887)和2008年印度株(JN203517)組成;D基因型由其余140株組成。而D基因型又分為D1、D2和D3共3個(gè)亞型。D1亞型來(lái)自日本、西班牙和法國(guó);D2亞型來(lái)自中國(guó)和日本;D3亞型來(lái)自中國(guó)、日本、芬蘭、西班牙和法國(guó),其中D3亞型又包括D3a和D3b兩個(gè)分支。在本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖中,2016—2022年銀川市83株CV-A6分離株與D3亞型的D3a分支參考序列聚集為1支。

2.4 CV-A6的VP1區(qū)全長(zhǎng)序列同源性分析 本研究中銀川市83株CV-A6分離株的VP1區(qū)基因全長(zhǎng)均為915 bp,共編碼305個(gè)氨基酸。與CV-A6原型株Gdula株(AY421764 -USA-1949)進(jìn)行對(duì)比均未發(fā)現(xiàn)核苷酸的插入或缺失。對(duì)2016—2022年銀川市83株CV-A6分離株與原型株Gdula株進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性分析,發(fā)現(xiàn)銀川市83株CV-A6分離株VP1區(qū)序列之間的核苷酸相似性為90.7%～99.9%,氨基酸相似性為86.6%～100.0%;銀川市83株CV-A6分離株與CV-A6原型株之間核苷酸相似性為82.1%～84.1%,氨基酸相似性為76.2%～80.5%。這表明2016—2022年銀川市83株CV-A6流行株之間同源性較高,沒(méi)有出現(xiàn)較大的進(jìn)化,而銀川市83株CV-A6分離株與原型株之間遺傳距離較遠(yuǎn)。對(duì)2016—2022年銀川市83株CV-A6分離株與其他基因型或亞型VP1區(qū)序列進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示83株CV-A6分離株與 B基因型參考序列核苷酸相似性為82.6%～85.2%,氨基酸相似性為77.2%～84.4%;與C基因型參考序列核苷酸相似性為82.8%～86.0%,氨基酸相似性為76.5%～82.1%;與 D基因型參考序列核苷酸相似性為85.9%～98.9%,氨基酸相似性為80.8%～99.3%;與 D1基因亞型參考序列核苷酸相似性為87.9%～94.2%,氨基酸相似性為83.7%～92.8%;與 D2基因亞型參考序列核苷酸相似性為85.9%～91.4%,氨基酸相似性為80.8%～90.2%;與 D3基因亞型參考序列核苷酸相似性為91.0%～98.9%,氨基酸相似性為86.6%～99.3%;與 D3基因亞型D3a分支參考序列核苷酸相似性為91.4%～98.9%,氨基酸相似性為88.6%～99.3%;與 D3基因亞型D3b分支參考序列核苷酸相似性為91.0%～95.7%,氨基酸相似性為86.6%～94.5%。由此可見(jiàn)2016—2022年銀川市83株CV-A6分離株基因序列與D3基因亞型中的D3a分支參考序列同源性最高,推斷銀川市83株CV-A6分離株均屬于D3a分支。2016—2022年銀川市83株CV-A6分離株與其他國(guó)家流行株比較,發(fā)現(xiàn)其與2010年法國(guó)株(HE572928、HE572938)同源性最高,核苷酸相似性為93.4%～97.2%,氨基酸相似性為90.2%～96.1%;與中國(guó)流行株比較,發(fā)現(xiàn)其與來(lái)自上海市、云南省、河南省、天津市、湖南省、遼寧省、江西省、山東省的參考株同源性比較高,見(jiàn)表1。提示銀川市2016—2022年CV-A6流行株可能存在多條傳播鏈。

表1 銀川市83株CV-A6分離株與其他地區(qū)流行株同源性分析(%)

2.5 CV-A6分離株的VP1區(qū)編碼氨基酸變異位點(diǎn)分析 將本研究中銀川市83株CV-A6分離株的VP1區(qū)核苷酸翻譯的氨基酸序列與CV-A6原型株Gdula株(AY421764-USA-1949)進(jìn)行比較,確定氨基酸的變異位點(diǎn),應(yīng)用MEGA7.0軟件進(jìn)行分析,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)氨基酸插入或缺失的情況,均是在原有氨基酸位點(diǎn)發(fā)生替換或突變。與原型株比較,本研究中銀川市83株CV-A6分離株共存在47個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異,將僅出現(xiàn)1次的15個(gè)隨機(jī)突變?nèi)コ?對(duì)其余32個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)進(jìn)行分析,見(jiàn)表2。

表2 2016—2022年銀川市CV-A6的VP1區(qū)全長(zhǎng)氨基酸序列變異比較

3 討論

手足口病是由多種腸道病毒(EV)引起的急性傳染病,常見(jiàn)的主要臨床癥狀為手、足皮膚及口腔皮疹或皰疹,該病屬于自限性疾病,極少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、急性遲緩性麻痹及神經(jīng)源性肺水腫等癥狀,嚴(yán)重時(shí)可致患者死亡[14]。本病具有傳播快、流行性強(qiáng)的特點(diǎn),多發(fā)于5歲以下兒童[15]。手足口病作為一種常見(jiàn)的傳染病嚴(yán)重危害著公眾健康,我國(guó)于2008年將其納入法定丙類傳染病報(bào)告管理[16],隨后建立起全國(guó)手足口病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室,逐漸實(shí)現(xiàn)規(guī)范化管理。銀川市于2011年加入全國(guó)手足口病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室,但是僅按照監(jiān)測(cè)要求對(duì)腸道病毒EV-A71型和柯薩奇病毒A-16型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)。2013年以后中國(guó)多地出現(xiàn)CV-A6,提示CV-A6已經(jīng)成為引起手足口病的重要病原體之一,因此應(yīng)將CV-A6型別鑒定納入常規(guī)監(jiān)測(cè)。

在銀川市2016—2022年手足口病病原學(xué)監(jiān)測(cè)的1 923份核酸陽(yáng)性標(biāo)本中,CV-A6陽(yáng)性標(biāo)本有814份,占比42.3%。說(shuō)明CV-A6已經(jīng)成為近年來(lái)引起銀川市手足口病的優(yōu)勢(shì)病原體,所以對(duì)CV-A6進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)尤為重要。武晶等[17]研究報(bào)道北京市豐臺(tái)區(qū)2015—2019年手足口病優(yōu)勢(shì)病原體為CV-A6,占比37.71%;王浩權(quán)等[18]研究報(bào)道上海市嘉定區(qū)2015—2020年手足口病優(yōu)勢(shì)病原體也是CV-A6,占比57.07%;梁月玲等[19]研究報(bào)道CV-A6成為2017—2018年寧夏回族自治區(qū)手足口病的主要病原體之一;本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)CV-A6的A、B和C基因型比較穩(wěn)定,而D基因型在全球多地區(qū)流行。銀川市2016—2022年的83株CV-A6分離株均屬于D3基因亞型的D3a分支,未檢測(cè)到其他基因型,說(shuō)明近年來(lái)CV-A6的D3a單一基因型一直在銀川市持續(xù)傳播。這與SONG等[13]的研究中2014年以后我國(guó)除2014年新疆兩株、2015年云南1株分離株以外所有CV-A6分離株均位于D3基因亞型的D3a分支的研究結(jié)果一致;同時(shí)與梁月玲等[19]研究2017—2018年寧夏回族自治區(qū)流行的CV-A6毒株均為D3a基因亞型的結(jié)果相符。但與袁芳等[20]研究報(bào)道的2013—2015年寧夏61株CV-A6分離株分布在D1和D2這兩個(gè)分支,并且大部分集中在D2分支的結(jié)果不同。由此可見(jiàn),CV-A6不僅是銀川市手足口病的主要病原體之一,而且其基因亞型在流行過(guò)程中不斷發(fā)生改變。通過(guò)同源性分析發(fā)現(xiàn),銀川市83株CV-A6分離株與D3a基因亞型的參考序列同源性最高,再次印證了2016—2022年引起銀川市手足口病的CV-A6流行株屬于D3基因亞型D3a分支。銀川市2016—2022年CV-A6與我國(guó)上海市、云南省、河南省、天津市、湖南省、遼寧省、江西省、山東省等的CV-A6流行株親緣關(guān)系較近,說(shuō)明銀川市CV-A6與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)處于共同循環(huán)的狀態(tài),流行趨勢(shì)基本一致,可能存在多條傳播鏈。將本研究中83株CV-A6分離株與原型株Gdula株進(jìn)行氨基酸突變位點(diǎn)對(duì)比,發(fā)現(xiàn)銀川市83株CV-A6的VP1區(qū)蛋白有32個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在差異,其中第8、10、14、32、98、160、194、261、279和305個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異率100%,其他氨基酸位點(diǎn)部分變異。變異是否使其毒力增強(qiáng)是否導(dǎo)致銀川市近年來(lái)CV-A6引起的手足口病比例上升等,還需要后續(xù)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述,銀川市2016—2022年引起手足口病的CV-A6分離株屬于D3a基因亞型分支,其流行存在多條傳播鏈。本研究證實(shí)了CV-A6已經(jīng)成為銀川市近年來(lái)引起手足口病的重要病原體,完善了本地區(qū)手足口病流行株的分子進(jìn)化資料。在今后的手足口病病原學(xué)監(jiān)測(cè)工作中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)CV-A6的持續(xù)監(jiān)測(cè),通過(guò)核酸檢測(cè)和基因測(cè)序等方法,密切監(jiān)測(cè)病原譜的變化,為手足口病的防治工作提供科學(xué)的參考依據(jù),同時(shí)為研發(fā)有效的針對(duì)CV-A6感染的疫苗提供參考數(shù)據(jù)。