姜 慧，李軍祥，譚 祥1，，張 陽1，，萬 雯1，，施曉軍1，，韓海嘯△

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝細(xì)胞脂肪的過度積累，從非酒精性單純性脂肪肝（simple nonalcoholic fatty liver，NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），并可能發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1-2］。近年來，NAFLD 已成為最常見的慢性肝病，影響了全球約25%的普通人群［3］。目前，臨床上仍沒有獲得批準(zhǔn)的治療的NAFLD藥物［4］。因此，探索和開發(fā)有效的NAFLD藥物療法非常重要。

中醫(yī)藥歷史悠久，具有“多成分、多靶點”的特點，其臨床療效也得到普遍認(rèn)可［5］。健脾疏肝方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院李軍祥教授以“肝病實脾”理論為依據(jù)，謹(jǐn)合“肝郁脾虛，濕熱瘀阻”病機(jī)，并根據(jù)多年的臨證經(jīng)驗而創(chuàng)立的經(jīng)驗方。本方主要由絞股藍(lán)、水飛薊、炒白術(shù)、廣郁金、茯苓、白芥子、澤瀉、決明子、丹參、生山楂等十味中藥組成。然而，健脾疏肝方的分子機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步探索。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)的新方法，與中草藥多組分、多靶點作用的特點相契合，已被證明適用于分析中草藥中各種成分和作用的復(fù)雜關(guān)系［6］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究健脾疏肝方治療NAFLD的活性化合物、靶點及其作用機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步研究提供支撐。

1 資料與方法

1.1 健脾疏肝方活性成分和靶標(biāo)的篩選將健脾疏肝方中的中藥材的名稱輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺［7］（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），設(shè)定口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，藥物利用度（drug-likeness，DL）≥0.18，以獲得中藥材中合格的有效成分。TCMSP 數(shù)據(jù)庫沒有錄入的中藥信息從已發(fā)表文獻(xiàn)中獲得。然后在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中查詢中藥對應(yīng)的蛋白靶標(biāo)，利用UniProt蛋白序列資源［8］（https：//www.uniprot.org）查詢蛋白靶標(biāo)的基因名稱和規(guī)格ID，方便進(jìn)一步進(jìn)行研究。

1.2 藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建采用Cytoscape（V3.6.1）進(jìn)行活性化合物靶網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，以清晰顯示網(wǎng)絡(luò)和潛在目標(biāo)之間的關(guān)系。將鑒定的活性化合物和潛在靶標(biāo)導(dǎo)入軟件。使用“Network Analyzer”模塊對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩詤?shù)進(jìn)行分析，計算出整個網(wǎng)絡(luò)的“Degree”值。Degree值越高，該化合物越有可能成為中草藥的關(guān)鍵化合物。

1.3 疾病潛在作用靶點的篩選以“Non-alcoholic fatty liver disease”為檢索詞，在人類基因數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫［9］（GeneCards，http：//www.genecards.org）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫［10］（online mendelian inheritance in man，omim，http：//www.omim.org/）及藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫［11］（therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）檢索疾病相關(guān)靶點信息，并將上述3 個數(shù)據(jù)庫中的目標(biāo)進(jìn)行合并，刪除冗余目標(biāo)，得到總的疾病靶點目標(biāo)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建采用Draw Venn Diagram（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選健脾疏肝方和NAFLD 的共同靶點。后將共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫［12］（https：//string-db.org/）構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）。將物種設(shè)置為“Homo sapiens”（智人），最小交互閾值設(shè)置為“high confidence”（≥0.700），其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，導(dǎo)出并保存其TSV 格式文件，后導(dǎo)入到Cytoscape（V3.6.1）軟件中進(jìn)行可視化分析。

1.5 GO 和KEGG 富集分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）獲得靶點GO 和KEGG 信號通路富集分析結(jié)果，并將所得結(jié)果導(dǎo)入微生信云平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對接驗證將核心化合物和關(guān)鍵靶基因進(jìn)行分子對接驗證。首先，從PubChem 平臺（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性化合物的三維分子結(jié)構(gòu)，并使用openbabel（v3.1.1）軟件將SDF文件轉(zhuǎn)換為mol2格式。然后在UniProt 數(shù)據(jù)庫和PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www1.rcsb.org/）中搜索所選基因編碼的受體蛋白，下載蛋白的3D結(jié)構(gòu)。用PyMOL（v2.3.0）軟件去除受體蛋白中的水分子。用AutoDock tools（v1.5.6）軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行氫化并計算電荷。最后利用AutoDock Vina（v1.1.2）分子對接軟件驗證。

2 結(jié)果

2.1 健脾疏肝方的活性成分和靶標(biāo)信息通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻(xiàn)篩選，刪除重復(fù)項后，共獲得符合OB≥30%、DL≥0.18 的潛在活性成分共117 個，其中絞股藍(lán)15 種、水飛薊9 種、決明子13種、澤瀉7 種、白術(shù)4 種、茯苓6 種、郁金3 種、丹參58 種、白芥子1 種、山楂9 種。在這些活性化合物中，槲皮素是絞股藍(lán)、水飛薊和山楂的常見化合物；谷甾醇是絞股藍(lán)、澤瀉、郁金和山楂的常見化合物；豆甾醇是水飛薊、決明子和山楂的常見化合物；木犀草素是丹參和山楂的常見化合物；CLR 是絞股藍(lán)、水飛薊和決明子的常見化合物。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶基因預(yù)測系統(tǒng)，刪除重復(fù)值后共獲得279 個潛在靶標(biāo)，其中絞股藍(lán)161 個、水飛薊187個、決明子64個、澤瀉5個、白術(shù)18個、茯苓23個、郁金67個、丹參134個、白芥子17個、山楂198個。

2.2 活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了進(jìn)一步說明健脾疏肝方活性成分與相應(yīng)靶標(biāo)的相互作用，構(gòu)建了化合物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)由404個節(jié)點（115 個活性成分，279 個靶標(biāo)，10 個藥草名稱）和2071 條邊組成。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲岛Y選健脾疏肝方治療NAFLD 的關(guān)鍵活性成分，并將大于degree 中位數(shù)2 倍值、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）中位數(shù)作為篩選指標(biāo)，見表1。槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等高度值活性化合物可能是健脾疏肝方治療NAFLD的重要活性成分。

表1 健脾疏肝方中篩選活性化合物的基本信息

圖1 健脾疏肝方潛在靶點的復(fù)合靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

2.3 NAFLD 的潛在靶基因從GeneCards、OMIM和TTD 數(shù)據(jù)庫中分別收集到806 個、622 個和4 個已知的NAFLD 相關(guān)靶點，取并集后共得到1362 個疾病靶點信息。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建首先Venn圖分析得出了133個健脾疏肝方和NAFLD 的共同靶點，這些靶點是健脾疏肝方治療NAFLD的潛在靶點，見圖2。然后將133個靶點上傳到STRING數(shù)據(jù)庫中，PPI評分設(shè)為0.700的高置信度。后將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。根據(jù)CytoHubba插件中的MCC方法，獲得排名前50 的核心基因，見表2、圖3。

表2 排名前50的核心基因

圖2 健脾疏肝方治療NAFLD的Venn圖

圖3 健脾疏肝方治療NAFLD的PPI靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 和KEGG通路富集分析為了進(jìn)一步了解交集基因的功能，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對健脾疏肝方治療NAFLD的50個核心靶點進(jìn)行GO功能富集分析以及KEGG信號通路富集分析。設(shè)定篩選條件為P＜0.01，GO 富集分析得到生物過程（biological process，BP）主要包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)等；細(xì)胞組成（cellular component，CC）主要包括細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)等；分子功能（molecular function，MF）主要包括酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞增殖活性等。將篩選出的排名前10 的BP、CC、MF 結(jié)果通過微生信平臺作柱狀圖進(jìn)行可視化分析，見圖4。

圖4 排名前50核心基因的GO富集分析柱狀圖（BP、CC、MF）

KEGG 信號通路富集分析篩選共得到104 個富集條目（P＜0.01），主要包括癌癥相關(guān)通路、TNF信號通路、乙型肝炎、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路及NAFLD 信號通路等。將篩選出的排名前20 的通路通過微生信平臺作氣泡圖進(jìn)行可視化分析，見圖5。該結(jié)果表明，中醫(yī)藥可從多靶點、多途徑干預(yù)本病，對NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后發(fā)揮積極作用。

圖5 排名前50核心基因的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 分子對接將健脾疏肝方主要活性成分槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚與潛在主要治療靶點蛋白IL-6、TNF、STAT3、PTGS2、VEGFA進(jìn)行分子對接驗證，計算結(jié)合能，并將結(jié)合能≤-5 kcal/moL作為說明受體蛋白與藥物活性成分可能具有較好的結(jié)合活性的標(biāo)準(zhǔn)［13］，將最小結(jié)合能進(jìn)行展示，見表3。其中結(jié)合活性較強(qiáng)的化合物與靶蛋白分子對接模式見圖6。結(jié)果顯示，健脾疏肝方主要活性化合物可與靶點受體蛋白通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。

表3 分子對接結(jié)合能kcal/moL

3 討論

NAFLD 是最常見的肝臟疾病之一，是一種多因素發(fā)病機(jī)制和多種臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性、代謝性疾?。?4］。NAFLD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均在本病的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色［15］。目前尚未研制出特效藥物，而中醫(yī)藥在代謝性疾病的防治中具有較為確切的療效［16］。健脾疏肝方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院脾胃肝膽科李軍祥教授治療NAFLD 的臨床經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用療效顯著［17］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾疏肝方具有降低NASH 大鼠肝臟的脂質(zhì)沉積、改善組織炎癥狀態(tài)、對抗氧化損傷等作用［18-19］，不過具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡釋及明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠系統(tǒng)地識別藥物與疾病的關(guān)系，揭示多分子藥物協(xié)同作用的優(yōu)勢［20］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法篩選健脾疏肝方的有效成分和治療靶點，并進(jìn)行基因功能分析和KEGG 通路富集分析，以期進(jìn)一步闡明健脾疏肝方治療NAFLD的機(jī)制。

從藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，網(wǎng)絡(luò)中的每個活性化合物都與多個靶點蛋白相連，說明健脾疏肝方治療NAFLD 的多成分、多靶點的生物學(xué)特性。其中槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚是健脾疏肝方主要的活性化合物，起到關(guān)鍵的治療作用。槲皮素是一種具有多種生物活性的多羥基黃酮類化合物，具有很高的藥用抗炎、抗癌、抗氧化及抗纖維化價值［21-22］。木犀草素是一種在許多中藥及蔬菜中存在的天然類黃酮，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用［23-24］。豆甾醇是存在較為廣泛的一種植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及降低膽固醇等作用［25］。研究證明，豆甾醇可較明顯改善NAFLD 肝細(xì)胞脂肪變性程度，并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)［26］。山柰酚是一種植物來源的類黃酮化合物，具有諸多藥理特性，如減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗腫瘤和抗炎作用等。有報道稱山柰酚對PI3K/Akt 通路和環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）有抑制作用［27］。

本研究構(gòu)建了健脾疏肝方和NAFLD 共有的133靶標(biāo)的核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。在這些指標(biāo)中，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 被認(rèn)為是顯著的，是健脾疏肝方干預(yù)NAFLD 潛在的理想靶點選項。TNF 和IL-6 作為炎癥介質(zhì)，當(dāng)肝臟受損時可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而引起肝細(xì)胞變性、壞死和纖維組織增生［28］，因此二者在NAFLD 發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以通過抑制IL-6、TNF-α 的產(chǎn)生，起到改善NAFLD 的作用［29］。PTGS2又可稱作COX-2，是一種較為重要的生理酶，在炎癥和腫瘤疾病中發(fā)揮作用，是藥學(xué)界存在較高關(guān)注度的靶點分子之一［30-31］。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2酶上調(diào)導(dǎo)致前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）水平升高，而PGE2有促炎作用的同時具有抗炎作用，所以COX-2 酶代謝產(chǎn)物的戰(zhàn)略性調(diào)控可用于治療性控制炎癥疾病的進(jìn)展［32］。STAT3 是STAT 家族成員之一，在人類惡性腫瘤的各種細(xì)胞因子、激素和生長因子的信號傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用［33］，研究認(rèn)為STAT3 可能是抗癌治療的新靶點［34-35］。相關(guān)研究報道，槲皮素可能通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號通路，達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且促進(jìn)肝癌自噬的作用［36］。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA的表達(dá)與NAFLD 具有一定的相關(guān)性［37］。由以上分析結(jié)果得出，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 等靶點可能是健脾疏肝方治療NAFLD 的關(guān)鍵靶點蛋白。此外，健脾疏肝方主要活性成分與這些靶點的對接結(jié)果也進(jìn)一步證明了健脾疏肝方對NAFLD 具有治療作用。

GO 分析結(jié)果顯示，健脾疏肝方干預(yù)NAFLD 在生物過程方面最可能與RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等相關(guān)，在細(xì)胞組分方面最有可能與細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面等組成成分相關(guān)，而在分子功能方面則最可能與酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等相關(guān)。KEGG 分析顯示，與健脾疏肝方治療NAFLD 有關(guān)的通路主要涉及癌癥相關(guān)通路、TNF 信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路及NAFLD 信號通路。其中，癌癥相關(guān)通路排在首位，說明健脾疏肝方在很大程度上發(fā)揮抗腫瘤的積極作用，這也與藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果相互印證。研究發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路是炎癥反應(yīng)的重要通路［38］，也是與NASH 纖維化密切相關(guān)的因子［39］。NAFLD 信號通路和AMPK信號通路在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。其中胰島素抵抗（insulin resistance，IR）信號通路是NAFLD 信號通路中的主要通路之一，IR 在NAFL 向NASH 發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并且IR 已被證實是NAFLD 的獨立危險因素，是NAFLD 進(jìn)展的關(guān)鍵［40］。AMPK 的激活可促進(jìn)下游抗氧化基因Nrf2 的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激，抑制炎癥反應(yīng)［41］。PI3K/Akt 在介導(dǎo)生長因子信號在生物體生長、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝等方面起著重要作用，是一個潛在的治療NAFLD 的靶點［42］。研究表明，槲皮素能通過調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB 信號通路改善NASH 大鼠肝組織脂肪變性程度，從而減輕肝臟炎癥［43］。

綜上所述，本研究主要采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法，對健脾疏肝方治療NAFLD 的主要活性成分、靶點間的相互作用進(jìn)行探討。研究結(jié)果表明，健脾疏肝方可能通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝等多種途徑干預(yù)NAFLD，其中槲皮素、木犀草素、豆甾醇和山柰酚為健脾疏肝方潛在的最核心化合物，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 五個靶蛋白為干預(yù)網(wǎng)絡(luò)中潛在的最佳靶點選項。本研究在一定程度上對中醫(yī)治療疾病提供理論依據(jù)具有很大的價值，為中藥復(fù)方作用機(jī)制提供了新方向。但是，由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于現(xiàn)有文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫平臺中的數(shù)據(jù)，如果這些數(shù)據(jù)存在偏差，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果就會不準(zhǔn)確，這也是預(yù)測的局限性所在。因此，關(guān)于健脾疏肝方在NAFLD 中的作用，還需進(jìn)行進(jìn)一步的臨床和基礎(chǔ)實驗驗證。