孟 欣， 于 鵬， 單曉楓， 錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

錦鯽(Carassius auratus)又名草金魚，由于其花色似錦而得名，是一種重要的觀賞魚類。飼用促生長抗生素在過去的數(shù)十年間對保障動物健康發(fā)揮了重要作用，但大量使用抗生素會影響魚的生長及代謝，造成腸道菌群的失調(diào)，影響觀賞魚的體色和健康，導(dǎo)致水體耐藥細(xì)菌產(chǎn)生[1-2]。因此，替抗產(chǎn)品的研究已引起廣泛關(guān)注。

人參(Panax ginseng)為五加科(Araliaceae)人參屬植物，是中國傳統(tǒng)的名貴中草藥，通常為人們所熟知的是人參的根[3]。人參皂苷作為人參中重要的活性成分，在人參中含量較多且種類豐富，藥理活性表明其普遍具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、調(diào)節(jié)腸道微生物功能等作用[4]。我國作為人參栽培大國，此前人參莖葉一般是作為廢料丟棄，但為了使人參的應(yīng)用更為多元化，人參資源盡可能地有效利用，學(xué)者們開始對人參地上部分的化學(xué)成分以及相關(guān)藥理作用進(jìn)行研究[5]。稀有皂苷相較于原型人參皂苷而言其生物活性更加多元化，且更易被機(jī)體所吸收，但其提取方式相對繁難[6]。在人參的加工品中，其功效最主要通過稀有皂苷的含量來評價，因此，現(xiàn)在已經(jīng)有大量關(guān)于稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的研究，且發(fā)現(xiàn)人參莖葉所含皂苷含量是人參各部位中最多的，皂苷結(jié)構(gòu)更具多樣性，可作為人參皂苷提取的重要資源。因此，對于人參莖葉資源的利用不僅可以更好的發(fā)揮人參的地上價值，同時可以減少資源浪費(fèi)，保護(hù)環(huán)境。

微生物發(fā)酵是中藥材的重要炮制手段之一，在發(fā)酵過程中利用微生物將中草藥的有效成分更高效地分解出來，增強(qiáng)或新添功效，擴(kuò)大治療范圍[7]。與此同時，通過發(fā)酵產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，節(jié)約中藥材資源的同時增加中藥制劑的多元性及安全性[8]。由于大多數(shù)水產(chǎn)動物無法分解組成中藥材細(xì)胞壁的纖維素和半纖維素，導(dǎo)致中藥材的有效成分很難被魚體吸收從而產(chǎn)生浪費(fèi)[9]。通過益生菌發(fā)酵中藥技術(shù)可以有效地破壞中藥材的細(xì)胞壁，使活性成分溶解，減少藥物的用量。另外，發(fā)酵所使用的益生菌還可以調(diào)節(jié)胃腸道菌群，改善胃腸道功能，控制腸道內(nèi)腐敗菌生長[10]。因此，益生菌發(fā)酵中藥在魚類養(yǎng)殖中的應(yīng)用逐漸受到重視。

研究表明，利用益生菌發(fā)酵中藥的抑菌效果要比單獨(dú)使用中藥水提液或僅用益生菌的效果顯著。同時有研究表明，微生物可以通過去糖基化作用使人參固有皂苷向稀有皂苷轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)人參的藥理活性[11]。隨著人們對人參地上部分研究的不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的人參莖葉中皂苷類成分之間會發(fā)生轉(zhuǎn)化，Rg3、Rh2、Rh1等稀有皂苷的水平有所升高[12]。其中人參皂苷Rg3作為稀有皂苷已被證實(shí)可以抑制腫瘤生長，改善心臟功能[13]。目前對于益生菌發(fā)酵人參莖葉以及其有關(guān)活性成分作為飼料添加劑多應(yīng)用于畜牧業(yè)，在水產(chǎn)領(lǐng)域還尚未見報道，對于發(fā)酵人參莖葉應(yīng)用于水生動物時所使用的適配菌方面的研究還有待探究。因此，本實(shí)驗(yàn)利用不同干酪乳桿菌(Lacticaseibacillus casei)菌液接種量作為發(fā)酵菌種對人參莖葉進(jìn)行液體發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物與飼料均勻混合后進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，評估其對于錦鯽免疫及抗氧化功能的影響，同時篩選出在本實(shí)驗(yàn)條件下干酪乳桿菌在發(fā)酵人參莖葉提取物時的最佳接種量，以期為益生菌發(fā)酵人參莖葉在水生動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用中提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選用干酪乳桿菌ATCC393、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilaTPS-30)均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。人參莖葉提取物，即人參莖葉總皂苷，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥學(xué)院提供，測得總皂苷含量≥80%, 采用水提取大孔吸附樹脂富集方式制備。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)飼料的制備

干酪乳桿菌的活化及培養(yǎng)將干酪乳桿菌ATCC393于MRS固體培養(yǎng)基劃線，37 °C厭氧條件下過夜培養(yǎng)，接種單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37 °C條件下厭氧培養(yǎng)24 h。將菌懸液5000 r/min離心15 min，棄上清液，并加入等量無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，反復(fù)離心3次，用平板計(jì)數(shù)的方法確定干酪乳桿菌的菌液濃度，調(diào)整菌液濃度至1×108CFU/mL，置于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

中藥液制備稱取4份中藥人參莖葉提取物(8 g/份)，分別將其置于4個已滅菌50 mL的錐形瓶中，每瓶加入20 mL蒸餾水，保證中藥提取物均溶于水中后，于121 °C下高壓滅菌20 min，置于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

中藥發(fā)酵液的制備在4個已滅菌的250 mL錐形瓶中，分別加入200 mL pH 6.0的MRS液體培養(yǎng)基，隨后按3%、4%、5%、6%(干酪乳桿菌菌液體積/培養(yǎng)體系總體積)的比例接種干酪乳桿菌菌液，37 °C厭氧條件下發(fā)酵24 h后，即得到中藥發(fā)酵液，測得發(fā)酵液pH為3.5。

飼料的制備將4份中藥發(fā)酵液分別與1 kg基礎(chǔ)飼料混合均勻，置于37 °C恒溫箱烘干后，即得到4種實(shí)驗(yàn)飼料，干酪乳桿菌菌液接種量為3%、4%、5%和6%的飼料分別記為L3、L4、L5和L6，對照組飼喂基礎(chǔ)飼料記為L0，置于4 °C下低溫避光保存?；A(chǔ)飼料配方中魚粉35%、菜籽粕20%、大豆18%、小麥粉18%、酵母粉6%、氯化鈉1%、維生素1%、礦物質(zhì)1%。營養(yǎng)成分分別為粗蛋白質(zhì)33%、粗纖維8%、粗灰分12%、粗脂肪3%、水分9%、總磷1%、總賴氨酸1.5%。

1.3 實(shí)驗(yàn)日常管理

實(shí)驗(yàn)用錦鯽購買于長春某魚市，初始平均體重為(25.00±0.05) g，在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地控溫單循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前1周使用高錳酸鉀對魚缸內(nèi)進(jìn)行全面消毒，并提前3 d向其內(nèi)注水。實(shí)驗(yàn)錦鯽入水前，在3%濃度的鹽水中浸洗消毒10～15 min。在實(shí)驗(yàn)前2周使用基礎(chǔ)飼料飼喂，并觀察健康情況。暫養(yǎng)期結(jié)束后，挑選出健康無病的錦鯽250尾，并隨機(jī)平均分配到5個圓柱形玻璃魚缸內(nèi)(r=40 cm，h=110 cm，每缸容水量約為550 L)。分別用上述5組飼料持續(xù)投喂5周，日投餌率為錦鯽平均體重的3%～4%，每日分別在8:00和17:00投喂2次。實(shí)驗(yàn)在循環(huán)水系統(tǒng)中保持24 h持續(xù)供氧，每天更換1/3的水，保持養(yǎng)殖期間的水質(zhì)指標(biāo)，水溫設(shè)定為27～29 °C，溶解氧含量大于5 mg/L，氨氮值小于0.02 mg/L。本研究獲得了吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用倫理委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中操作人員嚴(yán)格遵守吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理規(guī)范，并按照吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.4 樣品收集與指標(biāo)檢測

樣品收集分別在養(yǎng)殖第0、7、14、21、28和35天進(jìn)行取樣，每次取樣前空腹24 h，每組隨機(jī)抽取3尾魚，尾部靜脈抽血，將血液置于37 °C溫箱0.5 h后，4 °C冰箱過夜，4 °C、5500 r/min離心15 min后，提取血清，分裝置于?80 °C冰箱中保存。無菌條件下采集臟器(肝胰臟、脾臟、中腎、全腸)，液氮速凍后，置?80 °C冰箱保存，用于后續(xù)相關(guān)免疫指標(biāo)的測定。

血清學(xué)指標(biāo)檢測溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、免疫球蛋白M(IgM)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)以及丙二醛(MDA)均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行檢測，具體檢測方法依照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

細(xì)胞因子表達(dá)量的測定通過實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測錦鯽各臟器組織中IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ和IL-1β的相關(guān)表達(dá)量。所需研缽均在烘干箱170 °C干熱4 h后使用，操作臺為提RNA專用操作臺，槍頭、離心管均為無RNA-free。按BioFlux總RNA提取試劑盒說明書，提取各臟器組織總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于?80 °C保存。以各組織的cDNA作為模板，進(jìn)行qRT-PCR操作，反應(yīng)體系20 μL∶2×Taqmix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，無菌水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件∶95 °C預(yù)變性30 s；95 °C變性5 s，55～61 °C退火30 s (不同引物退火溫度不同)，40個循環(huán)。對照組樣品作為參照，每個樣品設(shè)定3個重復(fù)，內(nèi)參基因選擇β-actin(表1)。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab. 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.5 攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，選擇嗜水氣單胞菌TPS進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。每組選擇20尾規(guī)格相近的魚，每尾腹腔注射1×108CFU/mL的嗜水氣單胞菌0.1 mL后恢復(fù)投餌，并記錄攻毒后14 d內(nèi)各組錦鯽的發(fā)病癥狀以及死亡情況，初步檢測不同干酪乳桿菌菌液接種量的發(fā)酵產(chǎn)物對錦鯽嗜水氣單胞菌攻毒的保護(hù)效果。

1.6 數(shù)據(jù)分析

除攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)外，其余結(jié)果均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，若方差分析顯著，進(jìn)一步利用Duncan氏進(jìn)行多重比較，顯著水平設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，各組體重均有增加，平均體重為(30.16±0.07)g。4個飼喂發(fā)酵液組別存活率均為100%，體表健康，活力正常，攝食情況均較好，每天2次投食可在5～10 min吃完。

2.1 不同發(fā)酵液對錦鯽血清生化指標(biāo)的影響

與L0組相比，L4、L5和L6組AKP活性均在整個實(shí)驗(yàn)期間有明顯的上升趨勢，并顯著高于L0組(P＜0.05)；其中L5組在第35天時達(dá)到AKP活性的最高值(圖1)。L5組LZM活性在第28天時LZM活性達(dá)到最高，顯著高于L0組(P＜0.05)，其他組別的上升趨勢并不顯著(P＞0.05)。各發(fā)酵液組間相比較，L5組SOD活性上升最為明顯，從第21天開始呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，并在第35天時達(dá)到最高，顯著高于L0組(P＜0.05)，其余3個發(fā)酵液組別的SOD活性在整個實(shí)驗(yàn)期間上升趨勢并不顯著(P＞0.05)。四個發(fā)酵液處理組的CAT活性均表現(xiàn)上升趨勢，其中L5組上升趨勢最為顯著，在第28天時活性顯著升高并達(dá)到最高值(P＜0.05)。4組發(fā)酵液處理組別GSH-Px活性在整個實(shí)驗(yàn)期間均表現(xiàn)出不同程度的上升，其中L5組上升最為明顯，并在第28天時達(dá)到最高值，與L0組相比有顯著差異(P＜0.05)。與L0組相比，4個發(fā)酵液處理組MDA含量均呈下降趨勢，但各組下降趨勢并不顯著(P＞0.05)，其中L5組在第35天時達(dá)到最低。各發(fā)酵液處理組的IgM活性均有上升趨勢，但并不明顯(P＞0.05)，但L5組在第28天時IgM活性最高。

圖1 不同發(fā)酵液對錦鯽血清生化指標(biāo)的影響L0. 對照組，L3. 干酪乳桿菌接種量3%的發(fā)酵液，L4. 干酪乳桿菌接種量4%的發(fā)酵液，L5. 干酪乳桿菌接種量5%的發(fā)酵液，L6. 干酪乳桿菌接種量6%的發(fā)酵液；下同。Fig. 1 Effects of different fermentation products on serum biochemical parameters of C. auratusL0. control group, L3. fermentation broth group with 3% inoculation amount of L. casei, L4. fermentation broth group with 4% inoculation amount of L.casei, L5. fermentation broth group with 5% inoculation amount of L. casei, L6. fermentation broth group with 6% inoculation amount of L. casei; the same below.

2.2 不同發(fā)酵液對錦鯽免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

發(fā)酵產(chǎn)物對錦鯽各臟器組織中不同免疫相關(guān)基因的表達(dá)量影響顯著(圖2)。在肝胰臟組織中，與L0組相比，IL-10和TNF-α基因表達(dá)水平整體隨干酪乳桿菌菌液接種量的增加呈先上升后下降的趨勢，L5組均在第35天達(dá)到最高值，表達(dá)量與L0組均有顯著的差異(P＜0.05)。IFN-γ基因表達(dá)量在L6組第28天時最高，與L0組有顯著的差異(P＜0.05)。四個經(jīng)發(fā)酵液處理的組別中，TGFβ基因表達(dá)水平均隨時間的增加呈先上升后下降的趨勢，其中L5組在第14天時表達(dá)量達(dá)到最高值，與L0組有顯著差異(P＜0.05)。IL-1β基因的表達(dá)量在第21天時L5組表達(dá)量最高，顯著高于L0組(P＜0.05)。

在脾臟組織中，IL-10基因從第21天開始，L4組、L5組、L6組有了顯著的上升趨勢(P＜0.05)，其中在第28天時L5組的基因表達(dá)量最高(圖3)。TNF-α、IFN-γ的基因表達(dá)量均隨飼喂時間的增加呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，并在第35天時達(dá)到最高值，其中L5組的TNF-α和IFN-γ基因表達(dá)水平均最高，與L0組有顯著的差異(P＜0.05)。IFN-γ的基因表達(dá)水平隨著干酪乳桿菌菌液接種量的增加呈先上升后下降的趨勢，在濃度達(dá)到5%時表達(dá)量達(dá)到最高值，同時在第35天時L4組、L5組、L6組均顯著高于L0組(P＜0.05)，其中L5組表達(dá)量最高。4個發(fā)酵液處理組TGF-β的基因表達(dá)水平整體隨飼喂時間的增加呈先上升后下降的趨勢，均在第21天時達(dá)到最高，其中L5組的表達(dá)量最高并于L0組有顯著差異(P＜0.05)。與L0組相比，各組IL-1β基因表達(dá)水平隨飼喂時間的增加呈先上升后下降的趨勢，其中L5組表達(dá)量與L0組有顯著差異(P＜0.05)。

在中腎組織中，IL-10基因的表達(dá)量上升趨勢最為敏感，在第35天時4個發(fā)酵產(chǎn)物處理組均有顯著的提高(P＜0.05)，同時L5組IL-10基因的表達(dá)量最高(圖4)。TNF-α的基因表達(dá)水平均隨時間增加呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，在第35天時L4組、L5組、L6組均有明顯的升高，均顯著的高于L0組(P＜0.05)，其中L6組TNF-α的水平最高。IFNγ基因的表達(dá)水平在整個飼喂時間中呈先升高后下降的趨勢，并從第21天開始L5組、L6組的表達(dá)量均有明顯上升，與L0組有顯著差異(P＜0.05)。TGF-β基因表達(dá)量在第21天時達(dá)到最高，其中L5組、L6組均和L0組有顯著差異(P＜0.05)。IL-1β基因在第21天時L6組與有顯著的上升(P＜0.05)，L5組在第28天時顯著的高于L0組(P＜0.05)，其他組別并無顯著升高趨勢(P＞0.05)。

圖4 不同發(fā)酵液對錦鯽中腎免疫炎癥因子的mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effects of different fermentation products on the mRNA expression levels of immune inflammatory factors in mesonephridium of C. auratus

在全腸組織中，與對照組相比，發(fā)酵產(chǎn)物處理組IL-10、TNF-α和IFN-γ的水平隨著干酪乳桿菌菌液接種量的升高而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，L5組表達(dá)量最高，顯著高于L0組(P＜0.05)；并且均在第21天有了顯著的升高，L5組均在第35天時達(dá)到最高值，但其中IL-10的水平升高最為敏感。TGF-β基因的表達(dá)水平在在整個飼喂時間內(nèi)呈先上升后下降的趨勢，L5組第21天時達(dá)到最高水平，與對照組有顯著的差異(P＜0.05)。IL-1β基因的表達(dá)水平隨著干酪乳桿菌菌液接種量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，L5組表達(dá)量最高，從第21天開始便顯著的高于L0組(P＜0.05(圖5)。

圖5 不同發(fā)酵液對錦鯽全腸免疫炎癥因子的mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 5 Effects of different fermentation products on the mRNA expression levels of immune inflammatory factors in intestine of C. auratus

2.3 攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L0組在9 d內(nèi)全部死亡，并且腹部出現(xiàn)腫脹，體表出血，解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)多臟器出現(xiàn)出血或化為血水等現(xiàn)象(圖6)。L3組在13 d內(nèi)全部死亡，L5組的存活率相較于其他組而言最高，達(dá)到30%，L6和L4組存活率分別為20%和10%。

圖6 不同發(fā)酵液對錦鯽攻毒后存活率的影響Fig. 6 Effects of different fermentation products on survival rate of C. auratus after challenge

3 討論

3.1 不同發(fā)酵液對于錦鯽血清生化指標(biāo)的影響

體液免疫指標(biāo)對于魚生理和健康情況起著非常重要指示作用，反映了機(jī)體營養(yǎng)和環(huán)境的變化。AKP、IgM和LZM均在機(jī)體的非特異免疫防御中發(fā)揮著重要的作用，在機(jī)體受到病毒侵害時可迅速分泌從而起到抵御病原的作用[14]。AKP是一種胞外金屬酶類，可加快吞噬細(xì)胞的吞噬，提高水生動物機(jī)體免疫力[15]。IgM作為體液免疫重要組成部分，是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，可與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，發(fā)揮體液免疫功能。LZM是單核巨噬細(xì)胞的分泌酶，可水解細(xì)胞壁中黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解，破壞侵入機(jī)體的有害細(xì)菌，從而幫助機(jī)體達(dá)到防御的目的[16]。有研究表明，乳酸菌作為飼料添加劑可以增加黏膜特異性免疫反應(yīng)，從而提高機(jī)體血清中 LZM及IgM活性[17-18]。Mohammadian等[19]研究中還發(fā)現(xiàn)飼料中添加干酪乳桿菌可以使鯉(Cyprinus carpio)血清AKP和LZM活性升高。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，利用益生菌對于中藥進(jìn)行發(fā)酵同樣可以提高鯉魚抗感染能力以及非特異性免疫能力[20]。本實(shí)驗(yàn)選擇干酪乳桿菌對人參莖葉提取物進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)物可以提高錦鯽血清中AKP、IgM、LZM活性，在干酪乳桿菌接種量為5%時活性達(dá)到最高值。進(jìn)一步說明該發(fā)酵產(chǎn)物能夠激活鯽非特異性免疫應(yīng)答，分泌免疫相關(guān)酶類。

氧化應(yīng)激是水產(chǎn)動物發(fā)生疾病的主要原因之一， SOD、CAT和GSH-Px作為機(jī)體抗氧化酶，其活性的高低可以直接反映出機(jī)體的抗氧化水平[21]。SOD主要作用是將超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，從而降低氧化毒性，以阻止氧自由基對細(xì)胞造成傷害[22]。GSH-Px作為可以在機(jī)體分解的酶，可以催化GSH和H2O2的反應(yīng)，將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整的作用[23]。CAT則可以將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2，可以清除對機(jī)體有害的超氧自由基，降低機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。MDA是用于反映氧化損傷的典型參數(shù)，具有細(xì)胞毒性，會加劇細(xì)胞脂膜氧化，其含量的高低間接的反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[25]。有研究表明，魚類腸道定植的乳酸菌具有抗氧化活性，蔡紅丹等[26]在對點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus coioides)的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加益生菌可以顯著的提高魚血清中SOD的活性。發(fā)酵人參莖葉在畜牧業(yè)的應(yīng)用相對較多，牟柏德[27]在實(shí)驗(yàn)中添加酵母菌混合菌種發(fā)酵人參莖葉藥渣，發(fā)現(xiàn)蛋雞產(chǎn)蛋的蛋黃中SOD和GSH-Px含量顯著高于對照組，MDA含量顯著低于對照組。李艷嬌等[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂添加發(fā)酵人參莖葉的飼料可提高小鼠(Mus musculus)血清中SOD的含量，降低MDA的含量，說明發(fā)酵人參莖葉可對機(jī)體的抗氧化能力有所提高。這也證實(shí)了人參莖葉在發(fā)酵后其產(chǎn)物中所包含的活性物質(zhì)以及其藥理作用更為豐富。本研究結(jié)果顯示，在飼料中添加干酪乳桿菌發(fā)酵人參莖葉產(chǎn)物可提高錦鯽血清中SOD、CAT、GSH-Px的活性，降低MDA的含量。呂戰(zhàn)旗等[29]研究發(fā)現(xiàn)，利用黃體菌發(fā)酵丹參可顯著提高丹參的抗氧化活性。屈青松等[30]研究發(fā)現(xiàn)，利用發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵人參，發(fā)酵產(chǎn)物中皂苷含量均有一定升高，可對人參皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，人參勻漿SOD 活性也較發(fā)酵前有所提高。在本研究也顯示發(fā)酵后的人參莖葉對于錦鯽機(jī)體抗氧化能力有一定的促進(jìn)作用，猜測是發(fā)酵使人參莖葉中的皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)化，稀有皂苷的含量升高，發(fā)酵產(chǎn)物中多物質(zhì)共同作用所致。因?yàn)榧夹g(shù)手段的限制，本研究中未能對發(fā)酵前后的人參莖葉進(jìn)行稀有皂苷的定量分析。

3.2 不同發(fā)酵液對于錦鯽免疫基因表達(dá)的影響

細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)先天性免疫、適應(yīng)性免疫以及受損組織修復(fù)等作用，可迅速響應(yīng)病原體感染和激活免疫細(xì)胞以應(yīng)對細(xì)菌的攻擊[31]。IL-10作為機(jī)體的重要抗炎因子之一，具有促使B細(xì)胞增殖分化及抗體分泌的效應(yīng)，是與免疫應(yīng)答密切相關(guān)的調(diào)節(jié)因子[32]。IL-10和IFN-γ對于激活巨噬細(xì)胞活性和促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖均具有調(diào)節(jié)作用，是天然免疫系統(tǒng)的重要刺激因子，常被用作免疫調(diào)節(jié)研究中的參考基因[33]。TNF-α能夠提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，誘導(dǎo)正常細(xì)胞增殖與分化，在機(jī)體受到病毒和細(xì)菌的侵襲時能增加抗感染作用[34]。IL-1β在機(jī)體損傷以及病原入侵時被活化，能夠獨(dú)立殺菌或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到清除病原的功能[35]。TGF-β是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的活性多肽類物質(zhì), 對細(xì)胞的生長、分化和多種生理、病理過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[36]。本實(shí)驗(yàn)中各組織IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-1β的表達(dá)水平均有不同程度升高，其中IL-10的表達(dá)水平升高更敏感。不同組織對于基因表達(dá)量響應(yīng)的先后時間也有一定的不同，在本實(shí)驗(yàn)條件下，全腸組織對于各基因的響應(yīng)均較快速，除了IFNγ基因外，全腸組織中其他各基因的表達(dá)水平均在第14天時表現(xiàn)出顯著的上升(P＜0.05)。肝胰臟組織中對于IL-10水平的表達(dá)與其他組織相比更為快速，從第7天開始干酪乳桿菌菌液接種量較高的組別便表現(xiàn)出顯著的升高(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，人參莖葉發(fā)酵液對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)可能存在時空差異。中藥有效成分通常是經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化之后發(fā)揮腸道消炎的作用，但考慮到魚類個體腸道菌群的差異性以及腸道微生物的復(fù)雜性，通過益生菌體外發(fā)酵后服用效果會更好[37-38]。人參也具有調(diào)節(jié)腸道微生物的作用，與益生菌發(fā)酵可以促進(jìn)益生菌的生長，抑制有害菌的生長[39]。Jang等[40]給予患有結(jié)腸炎的小鼠口服乳酸菌發(fā)酵紅參，發(fā)現(xiàn)其TNF-α以及相關(guān)炎癥基因的表達(dá)有升高，提高其藥效的同時可以防治腸道炎癥類疾病。魚類與畜禽類動物相比，消化道短，消化能力弱，腸道壁結(jié)構(gòu)薄且簡單，更容易受到損傷，所以對于魚類腸道的健康應(yīng)該受到重視[41]。孔雨昕等[42]利用3種乳酸菌飼喂烏鱧 (Channa argus)發(fā)現(xiàn)其各組織中IL-1β、IL-10和TNF-α基因表達(dá)水平均有不同程度升高，在腸道組織中均有促進(jìn)作用。Kong等[43]研究發(fā)現(xiàn)，重組干酪乳桿菌經(jīng)鯽口服后，鯽肝臟、脾臟、腎臟和腸中IL-10、IL-1β、IFN-γ和TNF-α水平在組織中顯著上調(diào)，提示重組干酪乳桿菌具有誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)、增強(qiáng)先天免疫應(yīng)答的能力，與本研究結(jié)果相似。王雨珊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵人參后可以提高其中Rg3和Rh2等稀有人參皂苷的含量，其中Rg3可顯著改善肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡形態(tài)，Rh2可抑制肝臟纖維化，口服給藥可以緩解小鼠酒精性肝損傷，抑制肝胰臟炎癥反應(yīng)。說明發(fā)酵后的人參可以對肝胰臟有一定的保護(hù)作用。對于益生菌發(fā)酵中藥在魚類養(yǎng)殖中對于免疫相關(guān)因子的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

3.3 不同發(fā)酵液對于錦鯽攻毒后存活率的影響

研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌是引起淡水魚類絕大多數(shù)細(xì)菌性疾病的病原菌，因此，采用嗜水氣單胞菌作為攻毒實(shí)驗(yàn)的感染菌株，能較好地評價該發(fā)酵產(chǎn)物對于錦鯽抗病力的影響[44]。通過攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)評價發(fā)酵產(chǎn)物的保護(hù)性，結(jié)果顯示，發(fā)酵產(chǎn)物處理的組別存活率高于對照組的存活率，其中L5組的存活率最高。表明干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物對錦鯽具有保護(hù)作用，可以一定程度抵抗病原菌感染，當(dāng)干酪乳桿菌的接種量為5%時發(fā)酵產(chǎn)物的保護(hù)效果最好。Harikrishnan等[44]在金魚(C. auratus)的研究中發(fā)現(xiàn)，在攝食中草藥后其對于嗜水氣單胞菌的抵抗能力有所升高，死亡率降低，證實(shí)了中草藥對于魚體的免疫保護(hù)作用。覃初斌[45]在研究干酪乳桿菌對斑馬魚(Danio rerio)抵御氣單胞菌感染的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌可以顯著提高維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)攻毒后斑馬魚的存活率，說明益生菌作為飼料添加劑可以增強(qiáng)魚體的免疫，從而提高存活率。謝全喜等[46]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)發(fā)酵的中草藥后，能有效抵抗肉雞對于大腸桿菌(Escherichia coli)感染。Gu等[18]發(fā)現(xiàn)，利用乳酸桿菌發(fā)酵復(fù)方中藥的抑菌效果要比單獨(dú)使用中藥水提液或僅用益生菌的效果顯著，并可以顯著緩解大腸桿菌所引起的仔豬腹瀉，這也表明通過益生菌發(fā)酵中藥可以提高其抗菌抗病毒作用。本研究中，發(fā)酵液組對嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的抗感染能力增強(qiáng)，推測由干酪乳桿菌、人參莖葉提取物中活性成分以及發(fā)酵所產(chǎn)生的新物質(zhì)共同作用所致。研究表明人，參莖葉皂苷即是免疫增強(qiáng)劑又是免疫調(diào)節(jié)劑，能明顯提高抗感染的能力[47]。田豐群等[48]發(fā)現(xiàn)，人參莖葉皂苷體內(nèi)治療可使感染后的創(chuàng)傷小鼠死亡率明顯降低，表明其可以促進(jìn)創(chuàng)傷后細(xì)胞的免疫功能，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體對傷后感染的抵抗力。這也證實(shí)了人參莖葉對于機(jī)體的免疫保護(hù)作用具有一定的貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

綜上所述，利用干酪乳桿菌發(fā)酵人參莖葉，其發(fā)酵產(chǎn)物可以提升錦鯽抗氧化以及先天免疫應(yīng)答的能力，并證實(shí)了該發(fā)酵產(chǎn)物可有助于魚體較好的預(yù)防并降低嗜水氣單胞菌的感染。本實(shí)驗(yàn)條件下5%為最佳干酪乳桿菌接種量。有關(guān)益生菌發(fā)酵中藥的相互作用機(jī)理還需進(jìn)一步挖掘。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）