史含夢(mèng)， 洪 帆， 戴應(yīng)芬， 徐夢(mèng)雅， 楊 銳

(1. 寧波大學(xué)，浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波，315211；2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波，315211)

溶藻細(xì)菌(algae-lysing bacteria)是可以通過(guò)直接或間接方式抑制藻類生長(zhǎng)或殺死藻類、溶解藻細(xì)胞的細(xì)菌的統(tǒng)稱[1]。1942年有研究發(fā)現(xiàn)，寄生多囊粘菌(Polyangiumparasiticum)能殺死剛毛藻(Cladophoraspp.)，首次報(bào)道了細(xì)菌溶藻現(xiàn)象[2]。隨后關(guān)于細(xì)菌溶藻的報(bào)道陸續(xù)增多?，F(xiàn)已報(bào)道的溶藻細(xì)菌有黏細(xì)菌屬(Myxobacter)、噬纖維菌屬(Cytophaga)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Phingomonas)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、弧菌屬(Vibrio)和芽孢桿菌屬(Bacillus)等[3-4]。

許多海洋致病菌都具有溶藻特性。李杰等[5]在綠斑病紫菜的藻體中發(fā)現(xiàn)海洋假交替單胞菌(P.marina)具有較強(qiáng)的胞外酶活性，可殺死藻細(xì)胞。黃林彬等[6]發(fā)現(xiàn)科貝特氏菌屬(Cobetia)可侵入壇紫菜(Porphyra haitanensis)藻細(xì)胞并釋放內(nèi)毒素而殺死紫菜細(xì)胞，引起紅爛病[7]。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)海洋弧菌DHQ25可分泌胞外蛋白來(lái)抑制和殺死赤潮藻。Jeong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，海洋芽孢桿菌SY-1菌株分泌的多肽類物質(zhì)(bacillamide)對(duì)多環(huán)旋溝藻有特異性的殺滅作用。Guo等[10]證實(shí)了氣單胞菌菌株GLY-2107可通過(guò)分泌熱穩(wěn)定性的胞外化合物來(lái)殺死銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)。Li等[11]報(bào)道從患病的海帶藻體上分離出的假交替單胞桿菌SM0524可分泌藻酸鹽裂解酶，使海帶病爛?？梢?，溶藻細(xì)菌的作用方式多樣，且機(jī)制復(fù)雜。

紫菜絲狀體黃斑病是紫菜貝殼絲狀體育苗期間高發(fā)的嚴(yán)重疾病，能夠?qū)е仑悮こ霈F(xiàn)黃斑，最后白化，造成育苗失敗[12]。地中?；【?V. mediterranei) 117-T6(Vm117-T6)被證實(shí)是該病的一種致病菌，可以破壞紫菜絲狀體細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞空胞化[13]。我們發(fā)現(xiàn)，Vm117-T6同樣也能感染紫菜葉狀體以及赤潮異彎藻等其他藻類，造成細(xì)胞解體，是一株廣譜性的溶藻細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)擬觀察Vm117-T6對(duì)赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)、顆石藻(Pleurochrysis carterae)、叉鞭金藻(Dirateria inornata)和東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的溶藻作用，探究其溶藻物質(zhì)的特性，為解析菌株的溶藻機(jī)制提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用赤潮異灣藻(NMBjah045)、顆石藻、叉鞭金藻和東海原甲藻均由浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)提供。

將經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾后的海水，每1 L中添加1 mL寧大3號(hào)母液[12]作為培養(yǎng)基。將藻種按1.0×103CFU/mL的密度按照1∶5(體積比)的比例，接種至培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，每日搖瓶2次。于20 °C，光照強(qiáng)度36 μmol photons m?2s?1，光暗周期12 L∶12 D條件下將微藻培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。調(diào)整藻液濃度至1.0×106CFU/mL，備用。

1.2 Vm 117-T6的培養(yǎng)

紫菜絲狀體黃斑病病原菌Vm117-T6保存于浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。保藏菌株室溫解凍后接種至NaCl濃度為1%的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB，青島海博生物技術(shù)有限公司)液體培養(yǎng)基中，28 °C，110 r/min，活化培養(yǎng)12 h。菌株擴(kuò)增與培養(yǎng)條件相同。

1.3 Vm 117-T6感染實(shí)驗(yàn)

取活化的Vm117-T6，2775×g離心5 min，去除培養(yǎng)基后，在滅菌的富N/P的營(yíng)養(yǎng)海水(0.0008%P-H2PO4，0.002% N-NO3)中重新懸浮。調(diào)整菌體密度約1.0×107CFU/mL。

將菌體按1∶10(體積比)接種于指數(shù)生長(zhǎng)中期的赤潮異灣藻、顆石藻、叉鞭金藻和東海原甲藻等藻液中，每組設(shè)置3個(gè)平行。感染72 h后測(cè)定藻體中葉綠素a含量，并計(jì)算其溶藻率。取適量藻液，7104×g離心5 min，棄上清液，加入等體積95%乙醇，4 °C靜置24 h，7104×g離心5 min，取上清液于649 nm和665 nm下測(cè)定其OD值。Ca=13.95×OD665?6.88×OD649。式中，Ca為葉綠素a的質(zhì)量濃度。

溶藻率的測(cè)定∶I(%)=(1?Ct/C0)×100%。式中，I為溶藻效率；Ct和C0分別為感染時(shí)間為t時(shí)和0時(shí)對(duì)照的葉綠素a濃度。

1.4 Vm 117-T6對(duì)不同碳源的降解作用

分別以果膠、卡拉膠、纖維素和幾丁質(zhì)作為唯一碳源制備選擇培養(yǎng)基。將浸有Vm117-T6的濾紙片貼附在特定的選擇培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)基用碘液染色5 min后，無(wú)菌水清洗染液，測(cè)量菌落周圍透明圈的大小，以判斷Vm117-T6降解不同碳源的能力。

1.5 Vm 117-T6胞內(nèi)物、胞外物和菌體的溶藻效果

胞內(nèi)物制備參照已有文獻(xiàn)[14]，以1∶100(體積比)的比例將Vm117-T6接種于NaCl濃度為1%的TSB培養(yǎng)基中，28 °C，110 r/min培養(yǎng)48 h后，4 °C，11180×g離心30 min，收集菌體，加入滅菌的富N/P營(yíng)養(yǎng)海水(0.0008% P-H2PO4，0.002% N-NO3)重懸浮。低溫下，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)破碎20 min，將破碎液11180×g離心5 min，取上清液，4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

胞外物制備參照已有研究[9]，將200 μLVm117-T6涂布于鋪有無(wú)菌玻璃紙，NaCl濃度為1%的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA，青島海博生物技術(shù)有限公司)上，28 °C培養(yǎng)48 h。隨后，加入2 mL富含N、P的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)海水(0.0008% PH2PO4，0.002% N-NO3)，清洗菌苔。4 °C，11180×g離心30 min。上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

菌體制備以1∶100(體積比)的比例將Vm117-T6接種至NaCl濃度為1%的TSB培養(yǎng)基中，110 r/min，28 °C培養(yǎng)12 h，備用。

Vm 117-T6胞外物、胞內(nèi)物、菌體溶藻效果測(cè)定將上述處理所得溶藻物質(zhì)以1∶10(體積比)的比例接入100 mL指數(shù)生長(zhǎng)中期的赤潮異彎藻藻液中，24 h后測(cè)定其葉綠素a含量并計(jì)算其溶藻率。葉綠素a含量及其溶藻率的計(jì)算方法同“Vm117-T6感染實(shí)驗(yàn)”。

1.6 感染赤潮異彎藻顯微觀察

將制備好的Vm117-T6的胞外物與菌體按照1∶10(體積比)的比例接入100 mL指數(shù)生長(zhǎng)中期的赤潮異彎藻藻液中，感染條件為20 °C，光照強(qiáng)度36 μmol photons m?2s?1，光周期為12 L∶12 D，培養(yǎng)40、80和120 min時(shí)取藻細(xì)胞于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 不同處理下Vm 117-T6胞外提取物對(duì)溶藻率的影響

Vm117-T6胞外物乙醇處理取Vm117-T6胞外物溶藻組分100 mL，加入3倍體積無(wú)水乙醇，常溫下靜置10 min，1776×g離心20 min，分別收集上清液和沉淀。上清液于65 °C真空旋蒸濃縮至100 mL，重復(fù)3次。用少量蒸餾水溶解殘留固體，得到溶解相。將收集的沉淀用蒸餾水溶解后合并，去除殘留乙醇，得到沉淀相。無(wú)菌水定容至100 mL。

Vm 117-T6胞外物有機(jī)溶劑萃取取Vm117-T6胞外物溶藻組分100 mL，用2倍體積石油醚或乙酸乙酯靜置萃取24 h，分別收集水相和有機(jī)相。水相經(jīng)65 °C真空蒸發(fā)掉殘留有機(jī)溶劑。有機(jī)相于65 °C真空蒸發(fā)干燥，用少量蒸餾水溶解殘留固體。無(wú)菌水定容至100 mL。

Vm 117-T6胞外物活性炭吸附取Vm117-T6胞外物溶藻組分100 mL，加入適量活性炭粉后，經(jīng)過(guò)1776×g離心，過(guò)濾，將處理后的組分用無(wú)菌水定容至100 mL。

Vm 117-T6胞外物高溫處理取“Vm117-T6胞內(nèi)物、胞外物和菌體的溶藻效果”中胞外物溶藻組分100 mL，100 °C水浴20 min，冷卻至室溫，0.22 μm的濾膜過(guò)濾，無(wú)菌水定容至100 mL。

Vm 117-T6胞外物不同組分溶藻率的測(cè)定將上述處理所得溶藻物質(zhì)以1∶10(體積比)的比例接入100 mL指數(shù)生長(zhǎng)中期的赤潮異彎藻藻液中，24 h后測(cè)定其葉綠素a含量并計(jì)算其溶藻率。葉綠素a含量及其溶藻率的計(jì)算方法同“Vm117-T6感染實(shí)驗(yàn)”。

1.8 Vm 117-T6不同條件下差異蛋白的分離與分析

對(duì)常規(guī)條件、最佳生長(zhǎng)條件與易感條件下菌株的差異蛋白進(jìn)行分析。將Vm117-T6于3種條件培∶ A(易感條件下)為30 °C、pH 6.0、鹽度20；B(常規(guī)條件)為26 °C、pH 6.0、鹽度20；C(最佳生長(zhǎng)條件[12])為30 °C、pH 7.0、鹽度20。培養(yǎng)條件同“Vm117-T6的培養(yǎng)”。參照“Vm117-T6胞內(nèi)物、胞外物和菌體的溶藻效果”的方法制備不同生長(zhǎng)條件下菌體的胞外物與胞內(nèi)物。

利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離菌株蛋白質(zhì)，切割目的片段經(jīng)胰蛋白酶消化后進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Liquid Chromatograph Mass Spectromete，LC-MS)分析[15]，蛋白鑒定工作由上海鹿明生物科技有限公司協(xié)作完成。制備C18膜填充柱；將揮發(fā)干的多肽樣品重新溶解于Nano-HPLC Buffer A中；對(duì)多肽樣品進(jìn)行活化、平衡、固肽、脫鹽，后更換新的EP管，用40 μL Nano-HPLC Buffer B洗脫多肽樣品，并將脫鹽后的多肽樣品揮干。

將多肽樣品重新溶解于Nano-HPLC Buffer A中。采用Nano-HPLC液相系統(tǒng)(EASY-nLC1200，Thermo Inc.，美國(guó))，色譜柱使用Trap column(RPC18, 100 μm×20 mm, Thermo Inc.，美國(guó))和Analysis column(RP-C18, 75 μm×150 mm, Thermo Inc.，美國(guó))進(jìn)行分離。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Scientific，美國(guó))進(jìn)行全掃描(full scan)分析。

結(jié)果按照如下所示參數(shù)進(jìn)行搜庫(kù)分析，Software∶ProteomeDiscover 2.4；Database∶地中?；【?uniprot-Vibrio+organism_mediterranei.fasta；MS1 tolerance∶10 ppm；MS2 tolerance∶0.02 Da；Missed cleavage∶2；Static modification∶Carbamidomethyl (C)；Dynamic modification∶Acetyl (Protein N-term)、Deamidated (NQ)、Oxidation (M)。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2020和Origin 2020軟件進(jìn)行作圖分析，并采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)或雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)，使用Tukey多重比較檢驗(yàn)來(lái)確定各處理間的差異顯著性。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 Vm 117-T6對(duì)不同微藻的溶藻作用

Vm117-T6感染72 h后溶藻率顯示，該菌株具有廣譜且較強(qiáng)的溶藻活性，對(duì)東海原甲藻的溶藻率高達(dá)93.5%、對(duì)赤潮異彎藻、顆石藻和叉邊金藻的溶藻率分別達(dá)到了88.5%、62.3%和73%(圖1)。

圖1 Vm 117-T6感染不同微藻72 h的溶藻率1.赤潮異彎藻，2.顆石藻，3.叉鞭金藻，4.東海原甲藻Fig. 1 Algae-lysis rate of Vm 117-T6 infection on different microalgae for 72 h1. H. akashiwo，2. P. carterae，3. D. inornata，4. P. donghaiense

2.2 Vm 117-T6對(duì)不同微藻葉綠素含量的影響

Vm117-T6感染72 h后，不同微藻的葉綠素a的含量始終顯著低于對(duì)照組(P＜0.05，圖2)。不同藻類對(duì)Vm117-T6的敏感程度也有所差異。處理72 h后，赤潮異彎藻和東海原甲藻的葉綠素a含量較對(duì)照組分別下降7.71和14.34倍；而顆石藻與叉鞭金藻的葉綠素a含量較對(duì)照組分別下降1.65和2.67倍。

圖2 Vm 117-T6感染72 h對(duì)不同微藻葉綠素a含量的影響(a)赤潮異彎藻，(b)顆石藻，(c)叉鞭金藻，(d)東海原甲藻；對(duì)照. 未經(jīng)感染的微藻，Vm 117-T6. 感染Vm 117-T6的微藻；“*” 表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理之間差異顯著(P＜0.05)，“**” 表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理之間差異極顯著(P＜0.01)。Fig. 2 Effect of 72 h Vm 117-T6 infection on the chlorophyll a content of different microalgae(a) H. akashiwo, (b) P. carterae, (c) D. inornata, (d) P. donghaiense; control. uninfected microalgae, Vm 117-T6. uninfected microalgae; "*" means the difference between different treatments is significant(P＜0.05), “**” means the difference between different treatments is extremely significant(P＜0.01).

本研究所用微藻均為從東海赤潮中分離獲得的形成赤潮水華的種類。鑒于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到赤潮異灣藻無(wú)細(xì)胞壁，便于更好地觀察細(xì)胞變化，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取赤潮異彎藻為對(duì)象，用于評(píng)估Vm117-T6的溶藻特性。

2.3 Vm 117-T6對(duì)不同碳源的降解能力

果膠、卡拉膠、纖維素和幾丁質(zhì)均為藻類細(xì)胞壁的重要組分，以其作為唯一碳源來(lái)培養(yǎng)Vm117-T6，發(fā)現(xiàn)菌株僅在卡拉膠固體培養(yǎng)基上形成明顯的透明水解圈(圖3)，而對(duì)其他幾種物質(zhì)無(wú)顯著效果。這說(shuō)明Vm117-T6具有特異性降解卡拉膠的能力，不能分解果膠、纖維素和幾丁質(zhì)。

圖3 Vm 117-T6在卡拉膠固體培養(yǎng)基上的水解圈Fig. 3 Hydrolysis zone of Vm 117-T6 on carrageenan solid medium

2.4 Vm 117-T6胞外物、胞內(nèi)物和菌體的溶藻效果

對(duì)Vm117-T6的胞內(nèi)物、胞外物及菌體進(jìn)行溶藻效果比較。處理24 h后，胞內(nèi)物、胞外物與菌體的溶藻率分別為38.23% ± 3.76%、41.84% ±2.05%和37.89% ± 3.63%(圖4-a)，三者之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。添加Vm117-T6胞外物的赤潮異灣藻的葉綠素a含量從(52.64 ± 0.98) mg/L降低至(26.14 ± 0.94) mg/L(圖4-b)，差異極顯著(P＜0.01)，而胞內(nèi)物和菌體亦顯著降低了赤潮異彎藻的葉綠素a的含量(P＜0.05)。結(jié)果顯示，Vm117-T6及其胞內(nèi)物與胞外物均對(duì)赤潮異彎藻有顯著抑制作用。

圖4 Vm 117-T6胞內(nèi)物、胞外物及菌體作用24 h對(duì)赤潮異彎藻的溶藻率的影響1.Ck，2.胞內(nèi)物，3.胞外物，4.菌體。Fig. 4 Alginolytic effect of different microalgae-lysing components of Vm 117-T6 on H. akashiwo for 24 h1. Ck, 2. intracellular enzyme 9 (IS), 3. extracellular substance (ES), 4. bacteria (BAT).

2.5 Vm 117-T6胞外物及菌體對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞形態(tài)的影響

Vm117-T6胞外物對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞形態(tài)的影響結(jié)果顯示，感染0 min的赤潮異彎藻細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、緊密，游動(dòng)迅速(圖版-1,5)。胞外物感染40 min后，藻細(xì)胞的泳動(dòng)能力減弱、細(xì)胞逐漸膨脹變圓、細(xì)胞質(zhì)中開始出現(xiàn)空腔(圖版-2)。此時(shí)，藻細(xì)胞邊緣完整；胞外物感染80 min，藻細(xì)胞內(nèi)空腔不斷增大，內(nèi)含物的顏色逐漸變淡(圖版-3)。胞外物感染120 min，藻細(xì)胞破裂，細(xì)胞質(zhì)組分呈顆粒狀分散在培養(yǎng)液中(圖版-4)。

Vm117-T6菌體對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞形態(tài)的影響結(jié)果顯示。整體而言，菌體感染導(dǎo)致藻體活性降低更為嚴(yán)重，在感染40和80 min，藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)較胞外物感染組更為松散，感染120 min時(shí)，赤潮異彎藻的細(xì)胞內(nèi)容物分散成不規(guī)則的透明顆粒，其中嵌有細(xì)菌菌體(圖版-5～8)，表明菌體感染會(huì)對(duì)赤潮異彎藻造成更嚴(yán)重的損傷。

2.6 Vm 117-T6胞外物不同處理對(duì)赤潮異灣藻的溶藻效果

對(duì)Vm117-T6胞外物進(jìn)行不同處理，并檢測(cè)其產(chǎn)物的溶藻活性。結(jié)果顯示，作用24 h后，與未經(jīng)處理的胞外物溶藻率(41.84% ± 2.05%)相比、石油醚水相、碳吸附和高溫處理樣本的都檢測(cè)到較高溶藻率，分別為44.77%±2.39%、41.83%±1.91%和41.90%±1.79%，四者之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(圖5)。乙酸乙酯水相、乙醇溶解相與沉淀相的溶藻率分別為32.64%±1.56%、22.77%±2.56%、35.67%±2.79%，顯著低于未處理的胞外物溶藻活性(P＜0.05)，但此三者之間差異不顯著(P＞0.05)。胞外物的石油醚相或者乙酸乙酯相的溶藻率均為負(fù)值，與正常培養(yǎng)的藻類無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表示此二者不具溶藻活性。由此可知，Vm117-T6胞外溶藻物的特性∶易溶于水，不溶于石油醚和乙酸乙酯，具較強(qiáng)極性；耐高溫，不易被活性炭吸附，乙醇處理會(huì)降低溶藻活性。

圖5 Vm 117-T6 胞外物不同處理產(chǎn)物作用24 h對(duì)赤潮異彎藻溶藻率的影響1. Ck，2. 胞外物，3. 乙醇溶解相，4. 乙醇沉淀相，5. 石油醚相，6. 石油醚水相，7. 乙酸乙酯相，8. 乙酸乙酯水相，9. 碳吸附，10.高溫。Fig. 5 Effects of different treatment products of Vm 117-T6 extracellular substance on the algae lysis rate of H. akashiwo in 24 h1. Ck, 2. extracellular substance, 3. ethanol dissolution phase, 4. ethanol precipitation phase, 5. upper layer of petroleum ether, 6. lower layer of petroleum ether, 7. upper layer of ethyl acetate, 8. lower layer of ethyl acetate, 9. carbon adsorption, 10. high temperature.

2.7 Vm 117-T6不同條件下差異蛋白的分析

分析易感條件與常規(guī)條件下Vm117-T6胞內(nèi)物和胞外物的蛋白差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子量為37和40 ku的蛋白質(zhì)條帶變化最顯著(圖6)。這些蛋白條帶均注釋到地中?；【鶲X，而且其中含有較多分泌蛋白結(jié)合蛋白(表1)，如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合蛋白，外膜蛋白TolC、OmpA，Ⅱ型及VI型分泌系統(tǒng)的結(jié)合蛋白。除RTX toxin蛋白外，胞外蛋白中未發(fā)現(xiàn)與已知溶藻物質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)和肽段。

表1 Vm 117-T6溶藻蛋白鑒定結(jié)果分析Tab. 1 Identification and protein annotation of lysing proteins in pathogenic Vm 117-T6

圖6 Vm 117-T6胞內(nèi)物和胞外物蛋白電泳圖譜M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；ES (extracellular substance)為Vm 117-T6胞外物，IS (intracellular substance)為Vm 117-T6胞內(nèi)物；ES-A和ISA的培養(yǎng)條件為30 °C、pH 6.0、鹽度20，ES-B和IS-B的培養(yǎng)條件為26 °C、pH 6.0、鹽度20，ES-C和IS-C的培養(yǎng)條件為30 °C、pH 7.0、鹽度20。Fig. 6 Vm 117-T6 intracellular and extracellular protein electrophoresis patternM. marker 170; ES (extracellular substance), Vm 117-T6 extracellular substance, IS (intracellular substance), Vm 117-T6 intracellular substance; culture conditions of ES-A and IS-A are 30 °C, pH 6.0, salinity 20, culture conditions of ES-B and IS-B are 26 °C, pH 6.0, salinity 20,culture conditions of ES-C and IS-C are 30 °C, pH 7.0, salinity 20.

綜上，我們推測(cè)Vm117-T6的溶藻毒力因子中應(yīng)含有極性內(nèi)毒素類物質(zhì)，此外，與毒性因子轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌以及細(xì)胞黏附相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等蛋白質(zhì)在其毒力作用中也發(fā)揮了重要功能。這說(shuō)明多種溶藻機(jī)制參與了Vm117-T6的溶藻過(guò)程。

3 討論

細(xì)菌可以通過(guò)直接溶藻、間接溶藻、或是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的方式使藻細(xì)胞死亡[16]。直接溶藻，即細(xì)菌直接接觸藻體進(jìn)行攻擊，甚至侵入藻細(xì)胞內(nèi)部，殺死藻細(xì)胞[17]。Li等[18]從福建廈門水域分離得到了一株幾丁質(zhì)單胞菌屬細(xì)菌(Chitinimonas prasineLY03)，其可通過(guò)鞭毛黏附在假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)的藻細(xì)胞上，產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶降解藻細(xì)胞壁，最終導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。果膠、卡拉膠、纖維素和幾丁質(zhì)是藻類細(xì)胞壁的重要成分。部分溶藻細(xì)菌的溶藻活性與果膠酶[19]、β-葡萄糖苷酶、幾丁質(zhì)酶[20]、纖維素酶[21]等有關(guān)。在本研究中，Vm117-T6可降解卡拉膠，但不能降解果膠、纖維素和幾丁質(zhì)等物質(zhì)。由于卡拉膠并非本研究的幾種微藻細(xì)胞壁的主要成分[22]，因此，推測(cè)Vm117-T6對(duì)本研究中幾種微藻的溶解作用并非作用于這些藻類的細(xì)胞壁。

間接溶藻作用是近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道最多的細(xì)菌溶藻方式。細(xì)菌通過(guò)分泌胞外溶藻化合物來(lái)攻擊藻類細(xì)胞[16]。本研究中Vm117-T6的胞外溶藻化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的水溶性、耐高溫、不易被活性炭吸附且被乙醇部分沉淀的特性。這表明Vm117-T6的胞外溶藻物質(zhì)中可能含有極性內(nèi)毒素類物質(zhì)。目前已報(bào)道的溶藻細(xì)菌可能分泌靈菌紅素、鼠李糖脂、生物表面活性物質(zhì)和抗生素等來(lái)抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)或者殺死藻細(xì)胞[9,18,23]。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂可降低藻細(xì)胞活性，改變?cè)弩w形狀，長(zhǎng)時(shí)間處理會(huì)導(dǎo)致藻類產(chǎn)生白色絮狀沉淀[25]。這與本研究中Vm117-T6對(duì)赤潮異彎藻的作用相似。Vm117-T6的胞外溶藻物質(zhì)具體為何，仍需進(jìn)一步查證。

藻體形態(tài)顯示，菌體感染會(huì)比胞外物感染造成藻細(xì)胞更大的損傷，因此，菌株的毒力除了胞外物質(zhì)還應(yīng)該包括其他毒力因子的參與。本研究中，Vm117-T6 在易感條件下差異最大的蛋白質(zhì)主要為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、外膜蛋白以及少量RTX toxin。這些蛋白或多肽是許多致病菌的毒力因子，也是很多細(xì)菌溶藻的重要手段。目前已報(bào)道的溶藻蛋白一般為分子量約為10 ku的小分子分泌蛋白[26-28]。Banin等[28]發(fā)現(xiàn)一種使珊瑚褪色的施羅氏弧菌(V. shilonii)，能分泌多肽降低共生蟲黃藻細(xì)胞內(nèi)的pH，從而阻礙藻細(xì)胞的光合作用。該細(xì)菌后被證實(shí)為地中海弧菌的同物異名[29]。鄭寧寧[26]于叢毛單胞科(Comamondaceae)細(xì)菌WR11溶藻過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其外膜蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Ⅱ型分泌系統(tǒng)蛋白表達(dá)顯著高于突變株M20。海洋殺藻細(xì)菌(Hahellasp. KA22)分泌的靈菌紅素可誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生，通過(guò)特定的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白刺激藻細(xì)胞，使其光合系統(tǒng)紊亂，達(dá)到殺死藻細(xì)胞的目的[30]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和單向轉(zhuǎn)運(yùn)的方式實(shí)現(xiàn)多種分子的跨膜運(yùn)輸[31]。

圖版 Vm 117-T6胞外物和菌體感染對(duì)赤潮異灣藻細(xì)胞形態(tài)的影響1.胞外物感染0 min，2.胞外物感染40 min，3.胞外物感染80 min，4.胞外物感染120 min，5.菌體感染0 min，6.菌體感染40 min，7.菌體感染80 min，8.菌體感染120 min。Plate Vm 117-T6 extracellular and bacterial infection of H. akashiwo1. extracellular substance infection for 0 min, 2. extracellular substance infection for 40 min, 3. extracellular substance infection for 80 min, 4. extracellular substance infection for 120 min, 5. bacterial infection for 0 min, 6. bacterial infection for 40 min, 7. bacterial infection for 80 min, 8. bacterial infection 120 min.

TolC蛋白在很多革蘭氏陰性菌中參與了毒力因子的分泌[32]，通過(guò)調(diào)節(jié)病原菌的環(huán)境刺激耐受能力，增強(qiáng)其定殖活性，從而對(duì)病原菌進(jìn)行致病力調(diào)控[33]。RTX toxin是一種重要的毒力因子，在眾多致病革蘭氏陰性菌的細(xì)胞活性中起重要作用[34]。吳寒華等[35]在新型海桿菌(Marinobacter)菌株YWL01的基因組中不僅檢測(cè)到LuxR同系物、RTX毒素同系物，同時(shí)也檢測(cè)到了編碼外膜蛋白TolC的基因。在Vm117-T6的胞外蛋白中也檢測(cè)到外膜蛋白TolC和RTX toxin等序列。同時(shí)，在Vm117-T6胞外物的蛋白組分中存在革蘭氏陰性菌中介導(dǎo)細(xì)菌殺傷作用的Ⅵ型分泌系統(tǒng)[36]的結(jié)合蛋白以及與參與細(xì)菌定殖宿主的過(guò)程，與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、黏附性、以及毒力相關(guān)的外膜蛋白OmpA[37]和鞭毛蛋白Flagellin OS。

綜上，Vm117-T6是一株廣譜的活性較強(qiáng)的溶藻細(xì)菌，其毒力作用物中含有水溶性強(qiáng)且熱穩(wěn)定的內(nèi)毒素類物質(zhì)，且轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、外膜蛋白以及與細(xì)菌定植相關(guān)的蛋白可能也在其毒力中發(fā)揮重要作用。推測(cè)多種溶藻機(jī)制參與該菌株的溶藻過(guò)程。該菌株的胞外分泌物中含有極性性強(qiáng)且熱穩(wěn)定的溶藻物質(zhì)，可能是其感染性強(qiáng)[12-13]、傳播速度快的重要原因。

自2000年以來(lái)，我國(guó)近海大規(guī)模赤潮不斷出現(xiàn)，并呈現(xiàn)出多樣化、小型化和有害化的演變趨勢(shì)，對(duì)沿海地區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)系統(tǒng)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[38]。有研究發(fā)現(xiàn)，在赤潮生消的過(guò)程中，細(xì)菌、病毒等海洋微生物的豐度會(huì)發(fā)生較大變化，從側(cè)面驗(yàn)證了赤潮的消亡很大程度上與細(xì)菌有著密切的關(guān)系[2,39]。溶藻細(xì)菌作為水生生態(tài)系統(tǒng)中種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組分，對(duì)維持藻的生物量平衡具有非常重要的作用[16,40]。本研究中，Vm117-T6對(duì)赤潮異彎藻、東海原甲藻、叉邊金藻和顆石藻等微藻均具有溶藻活性，也從另一個(gè)方面顯示該菌株生態(tài)功能的多樣性。是否能夠?qū)⒃摼觊_發(fā)成抑制赤潮的安全性功能菌株值得進(jìn)一步探究。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）