張卓然,廖群,馮志遠(yuǎn),劉丹,李明亮,李詒光,任杰, 許錦珍,劉文穎,谷瑞增*,劉文君*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京,100015) 2(江中藥業(yè)股份有限公司, 江西 南昌,330096)

貧血是常見的血液疾病,其特征是當(dāng)血液缺乏足夠健康的紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度降低以及紅細(xì)胞比積低于正常水平,導(dǎo)致攜氧能力降低[1]從而引發(fā)的癥狀。貧血會損害一些身體功能(如精神和身體疲勞等[2])。貧血的3個主要原因來自于紅細(xì)胞損傷增加、紅細(xì)胞生成減少以及失血[3],在實驗?zāi)Ｐ椭薪?jīng)常使用乙酰苯肼(acetylphenylhydrazine,APH)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)聯(lián)合誘導(dǎo)來建立貧血模型[4]。乙酰苯肼是一種強氧化劑,可以針對性地破壞紅細(xì)胞,通過氧化血紅蛋白從而對紅細(xì)胞產(chǎn)生損害[5],使得血液中紅細(xì)胞數(shù)明顯減少,出現(xiàn)溶血性貧血現(xiàn)象。環(huán)磷酰胺作為一種常規(guī)化療藥物經(jīng)常應(yīng)用在腫瘤患者的治療中,具有較強的免疫抑制作用,通過骨髓功能障礙造成造血干細(xì)胞的減少,導(dǎo)致再生性貧血癥狀[6];二者聯(lián)合使用從雙重環(huán)節(jié)上建立小鼠貧血模型。

烏雞是我國的一種特有雞種,主產(chǎn)于江西泰和地區(qū),不僅在外形上十分搶眼,而且具有極高營養(yǎng)價值和藥用價值。烏雞的氨基酸種類齊全,含量遠(yuǎn)高于白雞,具有豐富的必需氨基酸,此外還含有多種微量元素和常量元素,其中鐵元素含量也比普通雞高,是營養(yǎng)價值極高的滋補品[7-8]。烏雞作為傳統(tǒng)中藥,具有補氣血、益脾腎的作用,其治療貧血的功能早已得到證實。為了更好地利用烏雞的補血功能開發(fā)新的補血產(chǎn)品,本試驗利用酶解法制備出烏雞肽,并配以營養(yǎng)素(EDTAFeNa和維生素),探究烏雞肽營養(yǎng)素配方對造血功能的恢復(fù)影響和造血作用機制,為開發(fā)貧血治療產(chǎn)品提供重要的理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

烏雞肽營養(yǎng)素配方樣品(泰和烏雞通過酶解工藝,生產(chǎn)為烏雞肽,并調(diào)配以微量的EDTAFeNa和維生素得到),中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院;CTX,上海華聯(lián)制藥有限公司; APH,北京索萊寶科技有限公司;復(fù)方阿膠漿,山東東阿阿膠股份有限公司;40 g/L多聚甲醛組織固定液,武漢塞維爾生物科技有限公司;小鼠EPO酶聯(lián)免疫試劑盒、小鼠GM-CSF酶聯(lián)免疫試劑盒,美國proteintech公司;小鼠IL-3酶聯(lián)免疫試劑盒,南京森貝伽生物技術(shù)有限公司;ATP酶試劑盒、總膽紅素試劑盒、直接膽紅素試劑盒,南京建成生物工程研究所; STAT3、Bcl-2、Bcl-XL抗體,美國proteintech公司; p-JAK2、p-STAT3抗體,美國Cell signaling公司;JAK2抗體,上海Santa Cruz Biotechnology有限公司;蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),中國碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TJ12-H絞肉機,廣東恒聯(lián)食品機械有限公司;RE5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;YC-L00U噴霧制粒包衣機,上海雅程儀器設(shè)備有限公司;R500小鼠麻醉機,深圳瑞沃德生命科技有限公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀,美國Thermo Scientific公司;恒溫干燥箱,北京陸?？萍加邢薰?3K15離心機,德國sigma公司; BC-2800Vet自動血液分析儀,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司; JXFSTPRP-YLS勻漿機,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 動物實驗

選取6周齡SD雌性小鼠60只,體重約30 g,北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010]。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d,飼養(yǎng)條件:動物房溫度(20±2) ℃,濕度(45±5)%,12 h日光燈明暗交替循環(huán),自由進食和飲水。正式實驗開始前將小鼠隨機分配為5組,空白組、模型組、陽性對照組組(FEJ)、烏雞肽配方低劑量組(L-WJ)和烏雞肽配方高劑量組(H-WJ),每組12只。根據(jù)人體動物劑量換算公式換算[9],陽性對照組每天灌喂8 mL/kg的復(fù)方阿膠漿,低劑量實驗組每天灌喂822 mg/kg烏雞肽配方產(chǎn)品,高劑量實驗組每天灌喂1 644 mg/kg烏雞肽配方產(chǎn)品,空白組和模型組每天灌喂等量去離子水,持續(xù)灌喂21 d。實驗分為干預(yù)期、造模期和恢復(fù)期,共計21 d?？瞻捉M小鼠腹腔注射0.1 mL的生理鹽水,其余組小鼠于第8天、第11天腹腔注射20、40 mg/kg APH(配制于0.1 mL生理鹽水中);從第11天到第14天,每日腹腔注射CTX 40 mg/kg(配制于0.1 mL生理鹽水中),連續(xù)4 d。共造模7 d來制備小鼠貧血模型。實驗第21天灌喂結(jié)束后將小鼠禁食過夜,在第22天稱重,使用麻醉劑麻醉小鼠,眼球采血收集全血后處死,解剖收集脾臟置于液氮速凍,收集股骨置于40 g/L多聚甲醛組織固定液中。所有動物實驗嚴(yán)格遵守實驗倫理原則和要求。

1.2.1 體重及臟器指數(shù)測定

對小鼠體重進行記錄,實驗共稱取4次體重,分別在第1天開始實驗時,第7天干預(yù)試驗結(jié)束后、第14天造模結(jié)束后和第21天實驗結(jié)束后,記錄體重的變化情況。

各組小鼠解剖后,立即取出脾臟和腎臟組織,用生理鹽水沖去臟器表面殘留的血液并修剪多余脂肪,濾紙吸干,稱重并按公式(1)計算各臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)

(1)

1.2.2 外周血象檢測

小鼠取全血后放入肝素抗凝管中,立刻通過全自動血細(xì)胞分析儀對血液進行外周血分析,測定紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、紅細(xì)胞比容(hematocrit value,HCT)、白細(xì)胞(white blood cell,WBC)和血小板(platelet,PLT)的含量。

1.2.3 骨髓病理學(xué)觀察

用40 g/L多聚甲醛溶液將小鼠股骨固定,之后用甲酸-檸檬酸鈉對股骨進行脫鈣處理,脫鈣完成后,包埋在石蠟中,切成切片,根據(jù)蘇木精染色試劑盒說明染色,并使用倒置熒光顯微鏡進行顯微鏡檢查。

1.2.4 ATP酶活力測定

各組小鼠取肝素抗凝全血,加4倍生理鹽水,使用冷凍離心機1 500 r/min、4 ℃離心10 min,棄去上清液,在沉淀的紅細(xì)胞中加入1.5 mL雙蒸水,渦旋30 s,放置15 min,再渦旋30 s,再放置15 min,使其充分溶血直至溶質(zhì)透亮。嚴(yán)格按ATP酶試劑盒(定磷法)操作說明測定紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.2.5 間接膽紅素測定

將小鼠血樣以3 000 r/min、4 ℃離心10 min獲得血清。通過試劑盒測定血清中總膽紅素和直接膽紅素含量,根據(jù)公式(2)計算間接膽紅素。

間接膽紅素含量=總膽紅素含量-直接膽紅素含量

(2)

1.2.6 造血調(diào)控因子測定

將小鼠血樣以3 000 r/min、4 ℃離心10 min獲得血清。用酶聯(lián)免疫測定試劑盒測定血清中造血功能因子紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)、重組巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)和白細(xì)胞介素-3(interleukin-3, IL-3)的含量。按照制造商的說明進行操作。

1.2.7 蛋白免疫印跡檢測

通過蛋白免疫印跡方法測定脾臟中p-JAK、JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白含量。首先提取脾臟細(xì)胞蛋白質(zhì),通過BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度,然后蛋白質(zhì)上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢加入50 g/L脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗,4 ℃搖床孵育過夜,用TBST溶液在室溫下?lián)u床洗膜3次,加入二抗,室溫孵育2 h,TBST溶液清洗3次,避光加入ECL顯影、定影試劑進行顯影和定影。磷酸化蛋白與其非磷酸化通過灰度比值表示蛋白的相對表達量;其他目的蛋白與β-actin灰度比值表示蛋白的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析。*表示模型組與空白組相比存在差異(P<0.05);#表示治療組與模型組相比存在差異(P<0.05)。Origin Lab Pro軟件作圖,Image J軟件對蛋白條帶定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重變化及臟器指數(shù)

根據(jù)圖1結(jié)果顯示,模型組與治療組體重在造模后的7～21 d體重急劇下降,由體重始末差值(表1)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組體重減少的最多,H-WJ組體重減少最少。

圖1 小鼠體重變化Fig.1 Body weight changes in mice

臟器指數(shù)結(jié)果見表1,與空白組相比,模型組的腎臟指數(shù)有顯著性差異地增大(P<0.05),治療組與模型組相比無顯著性差異(P>0.05);模型組與治療組脾臟指數(shù)差異顯著(P<0.05),表明脾臟異常腫大,這是因為CTX和APH聯(lián)合使用導(dǎo)致貧血而產(chǎn)生的原因。脾臟是貧血中最常見和最早期受影響的器官之一[10],造血功能缺乏和溶血破壞紅細(xì)胞會導(dǎo)致紅細(xì)胞在脾臟中的積聚[11-12],因此,紅細(xì)胞的減少和貧血都可能與脾臟腫大相關(guān)。FEJ組和H-WJ組的脾臟指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05),說明烏雞營養(yǎng)素配方通過劑量依賴的方式保護脾臟,減輕貧血損傷的副作用。

表1 臟器指數(shù)及體重始末差值Table 1 Visceral index and weight start-end difference

2.2 外周血象

測定小鼠外周血中RBC、HGB、HCT、PLT、WBC的量(表2)。與空白組相比,模型組RBC、HGB、HCT、PLT、WBC水平顯著降低(P<0.05),說明貧血模型建立成功。與模型組比較顯示,FEJ組和H-WJ配方組治療小鼠的HGB、HCT、PLT和WBC水平顯著升高(P<0.05)。同時,H-WJ和L-WJ均顯著提高了RBC和WBC水平(P<0.05),但用L-WJ治療小鼠的HGB和HCT水平?jīng)]有顯著增加。

表2 小鼠外周血象比較Table 2 Comparison of peripheral blood picture in mice

2.3 骨髓病理學(xué)觀察

骨髓是最重要的造血器官,由不同時期的造血細(xì)胞組成,包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。骨髓造血組織在細(xì)胞分裂中非常活躍,它對化學(xué)藥劑非常敏感[13],很容易造成損傷,CTX就會引起骨髓抑制作用。由圖2可知,空白組小鼠骨髓組織顏色均勻,骨髓細(xì)胞含量豐富,結(jié)構(gòu)清晰;而與正常組相比,模型組骨髓出現(xiàn)退化,含有大量空泡,造血細(xì)胞數(shù)量減少。在FEJ組和WJ治療組中發(fā)現(xiàn),骨髓中的細(xì)胞密度增加,造血細(xì)胞豐富,而空泡明顯減少。同時,在不同劑量的WJ治療組中觀察到,隨著劑量的增加對骨髓恢復(fù)效果就越好。圖中的結(jié)果顯示烏雞肽營養(yǎng)素配方對骨髓抑制有改善作用。

a-空白組;b-模型組;c-FEJ組;d-H-WJ組;e-L-WJ組圖2 骨髓病理學(xué)觀察Fig.2 Histopathology of the bone marrow

2.4 ATP酶活力水平

細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP保持膜內(nèi)高鉀和膜外高鈉的平衡,可將ATP分解為ADP并產(chǎn)生能量,對維持紅細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用,在貧血狀態(tài)下其活力明顯降低;Ca2+-Mg2+-ATP維持細(xì)胞外高鈣和細(xì)胞內(nèi)高鎂的水平,亦可分解ADP以獲得能量。ATP酶活力水平是紅細(xì)胞能量代謝及功能有無受損的重要指標(biāo)。

由圖3可知,模型組的ATP酶活力顯著低于空白組(P<0.05),說明能量代謝酶活力可以作為評價的有效指標(biāo)。FEJ組和WJ組與模型組對比發(fā)現(xiàn),貧血小鼠降低的紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活力均有顯著升高作用(P<0.05),說明WJ配方可能通過增加小鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力來發(fā)揮補血作用。其中H-WJ組對ATP的保護作用相比FEJ組和L-WJ組藥效趨勢更強。

a-Na+-K+-ATP酶活力;b-Ca2+-Mg2+ATP酶活力圖3 小鼠紅細(xì)胞ATP酶活力比較Fig.3 ATPase activity in mouse erythrocytes

2.5 間接膽紅素水平

間接膽紅素和直接膽紅素組成總膽紅素。血清中間接膽紅素升高主要與溶血情況有關(guān)。大量的紅細(xì)胞破壞后,大量血紅蛋白被轉(zhuǎn)變成間接膽紅素,超過了肝臟的處理能力,不能將其全部轉(zhuǎn)變成直接膽紅素,使血液中的間接膽紅素升高。其濃度可反映紅細(xì)胞被破壞產(chǎn)生溶血的情況。由圖4可知,模型組的間接膽紅素含量最高,說明模型組溶血效果最嚴(yán)重,與空白組有顯著性差距(P<0.05)。FEJ組和H-WJ組與模型組相比間接膽紅素含量顯著下降(P<0.05),但L-WJ組與模型組相比無顯著差異(P>0.05),這說明WJ配方會以劑量依賴的趨勢保護紅細(xì)胞不被破壞,減少間接膽紅素的含量。

圖4 小鼠血清中間接膽紅素含量比較Fig.4 Indirect bilirubin levels in mouse serum

2.6 造血因子水平

造血是血細(xì)胞形成的過程,造血干細(xì)胞受到造血微環(huán)境中的各種細(xì)胞因子(主要包括 EPO、GM-CSF、IL-6等細(xì)胞因子)的刺激,隨后增殖和分化產(chǎn)生成熟的血細(xì)胞的過程[14]。EPO是一種糖蛋白激素,是產(chǎn)生 WBC 的主要激動劑[15],EPO的生長因子由腎臟釋放并抑制祖細(xì)胞凋亡,還可以促進紅細(xì)胞快速生成。另一個重要的造血因子是GM-CSF,主要作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞,在調(diào)節(jié)造血和白細(xì)胞形成中起重要作用[16]。IL-3作為造血因子,可以在造血干細(xì)胞發(fā)育成血細(xì)胞時,促進造血干細(xì)胞增殖和分化。

由圖5-a結(jié)果表明,模型組小鼠血清中的EPO含量遠(yuǎn)高于空白組(P<0.05),這符合貧血模型現(xiàn)象,環(huán)磷酰胺會抑制脾臟中紅細(xì)胞前體的生成,從而導(dǎo)致EPO含量增加。FEJ組和H、L-WJ實驗組與模型組相比都有顯著性地(P<0.05)促進EPO的產(chǎn)生,從而提高造血能力。由圖5-b和圖5-c可知,FEJ組和H-WJ組與模型組相比會顯著提高了GM-CSF含量;但對于IL-3的含量只有H-WJ配方與模型組相比存在顯著性差異。同時,L-WJ與模型組在這2個造血因子上沒有顯著差異,以上結(jié)果可能說明WJ配方通過劑量依賴的方式增加GM-CSF和IL-3水平。

a-EPO;b-GM-CSF;c-IL-3圖5 小鼠血清中各造血因子水平比較Fig.5 Comparison of serum levels of various haematopoietic factors in mice

2.7 信號通路

JAK2/STAT3信號通路被證明是參與造血、免疫調(diào)節(jié)和炎癥的細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵通路之一,表達并參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡[17],并在其中起重要作用[18-20]。EPO與其受體EPOR的結(jié)合可迅速激活JAK-STAT信號通路,通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子和凋亡蛋白促進造血干細(xì)胞的存活、增殖和分化,在該通路中,JAK2、STAT3是治療貧血癥狀的主要靶點。細(xì)胞凋亡是 JAK2/STAT3 通路的下游生物學(xué)過程。Bcl-2和Bcl-XL為其下游的細(xì)胞因子,Bcl-2和Bcl-XL是一種抗凋亡調(diào)節(jié)蛋白。

如圖6和表3所示,與空白組相比,模型組p-JAK2/JAK2水平有顯著性降低(P<0.05),說明CTX和APH會降低信號通路中JAK2蛋白的磷酸化水平,從而影響JAK2/STAT3信號通路;與模型組相比,H-WJ和L-WJ組顯著性提高了p-JAK2/JAK2 和p-STAT3/STAT3水平(P<0.05),并呈現(xiàn)劑量依賴的效果。

圖6 小鼠脾細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路蛋白表達Fig.6 Expression of JAK2/STAT3 signaling pathway protein in mouse splenocytes

如圖7和表3所示,與空白組相比,模型組 Bcl-2和Bcl-XL的水平顯著降低(P<0.05),表明 CTX和APH 可以致使脾臟中的細(xì)胞凋亡。與模型組相比,FEJ組和H-WJ組Bcl-2水平顯著升高(P<0.05),FEJ組、H-WJ和L-WJ組Bcl-XL水平顯著升高(P<0.05),說明烏雞肽營養(yǎng)素配方可以抑制脾臟細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果表明,烏雞肽營養(yǎng)素配方可以通過激活JAK2/STAT3通路的磷酸化水平及其下游的細(xì)胞凋亡蛋白來保護貧血小鼠的脾臟,促進造血細(xì)胞的增殖分化,從而恢復(fù)造血功能。

圖7 小鼠脾細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達Fig.7 Bcl-2 and Bcl-XL protein expression in mouse splenocytes

表3 通過蛋白質(zhì)印跡預(yù)測的各蛋白灰度值比Table 3 Gray value ratio of predicted target proteins by Western blot

3 結(jié)論與討論

本論文研究了烏雞肽營養(yǎng)素配方在小鼠貧血模型中補血能力的恢復(fù)功效,在外周血象、骨髓病理學(xué)觀察、ATP酶活力、間接膽紅素含量和造血因子方面進行了探究,并深入探究了JAK2/STAT3信號通路在造血方面受到的影響。實驗結(jié)果表明烏雞肽逆轉(zhuǎn)了外周血細(xì)胞的減少,對恢復(fù)造血能力和保護紅細(xì)胞免受損害有顯著功效。APH作為一種強氧化劑會使紅細(xì)胞受到氧化性攻擊而發(fā)生破裂,當(dāng)紅細(xì)胞被破壞過速、過多時會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,間接膽紅素水平會增多,通過間接膽紅素結(jié)果驗證發(fā)現(xiàn)烏雞肽減輕了紅細(xì)胞的氧化損傷情況。貧血癥小鼠的紅細(xì)胞能量水平下降,紅細(xì)胞膜蛋白的磷酸化受阻,細(xì)胞膜網(wǎng)架結(jié)構(gòu)改變,會影響紅細(xì)胞的形態(tài)和變形能力,烏雞肽可以有效地提高紅細(xì)胞膜上ATP酶活性,恢復(fù)紅細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。烏雞肽通過促進造血因子EPO、GM-CSF和IL-3的產(chǎn)生,加快造血干細(xì)胞的分化和成熟,恢復(fù)骨髓中造血細(xì)胞的總量。烏雞肽配方通過增強JAK2/STAT3信號通路中JAK2和STAT3磷酸化水平的表達來激活信號通路,并且提高下游細(xì)胞抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL,從而影響造血細(xì)胞周期,使受損細(xì)胞在貧血環(huán)境中獲得更好的生存條件。本研究的結(jié)果為烏雞肽的開發(fā)和利用提供了指導(dǎo)。