方鵬，王帥，毛瑜，劉長虹

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由青霉素屬和曲霉素屬的某些真菌在適宜條件下代謝產(chǎn)生的有害真菌毒素，其在赭曲霉毒素中具有最大毒性[1]。OTA對(duì)動(dòng)物具有致癌性、基因毒性和誘變作用[2]，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將其指定為2B 類潛在致癌物[3]。OTA 廣泛存在于各種農(nóng)作物和加工類食品中，對(duì)食品安全產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅[4]?；谏V的OTA 傳統(tǒng)檢測方法雖然具有精確和靈敏的特性，但其設(shè)備昂貴、樣品處理繁瑣和檢測時(shí)間長[5?7]。目前最常用的OTA 快速檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）。該方法具有檢測速度快、可攜性強(qiáng)的特點(diǎn)[8?10]，但其使用的抗體容易受到環(huán)境因素的影響，難以儲(chǔ)存和運(yùn)輸[11]，而且OTA 作為一種小分子毒素，具有較低的免疫原性，難以得到相應(yīng)的優(yōu)異抗體[12]。在此基礎(chǔ)上，需要開發(fā)一種靈敏、實(shí)時(shí)、簡便的OTA 檢測方法。

適配體是一種新的識(shí)別元件，為OTA 的分析檢測提供了新的途徑，其原理是一條寡核苷酸單鏈（ssDNA或RNA）通過折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)并對(duì)靶標(biāo)特異性識(shí)別[13?15]。適配體具有高親和力、高特異性和優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，并且對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別能力與抗體相似。與抗體相比，適配體因具有成本較低、批量差異小、易于合成且穩(wěn)定性高的特性而被廣泛應(yīng)用?；谶m配體的生物傳感器已經(jīng)逐漸應(yīng)用于OTA 檢測，包括熒光、比色和電化學(xué)傳感器等[16?18]。相比其他傳感器，基于熒光的適配體生物傳感器具有操作簡單、成本低、高靈敏性等優(yōu)點(diǎn)[19?20]。但是許多基于熒光檢測的方法需要對(duì)適配體進(jìn)行化學(xué)熒光修飾，這極大地影響了適配體對(duì)靶標(biāo)的特異性識(shí)別，因此迫切需要開發(fā)一種特異性強(qiáng)、靈敏性高、成本低的無標(biāo)記適配體檢測方法。

SYBR Gold 是一種具有良好生物相容性的核酸染料，可與適配體結(jié)合，增強(qiáng)檢測的熒光信號(hào)[21?23]。因此可以結(jié)合SYBR Gold 增強(qiáng)熒光信號(hào)的特點(diǎn)，構(gòu)建一種靈敏性高、特異性強(qiáng)的OTA 適配體生物傳感器。由于在各種擴(kuò)增反應(yīng)策略中，包括雜交鏈反應(yīng)（hybridiza?tion chain reaction，HCR）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）、解旋酶依賴性擴(kuò)增（helicase?de?pendent amplification，HDA）和滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA），RCA 因其恒溫和簡單高效的酶促反應(yīng)而突出[24?25]。故RCA 擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)相當(dāng)長的單鏈序列，可以與SYBR Gold 結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)[26?28]。

為了建立無復(fù)雜化學(xué)標(biāo)記的基于適配體的OTA檢測方法，本研究利用無標(biāo)記DNA 探針建立一種簡化的熒光“開啟”適配體生物傳感器，用于高靈敏性和強(qiáng)特異性的OTA 檢測。該DNA 探針由OTA 適配體與RCA 引物兩部分組成，以O(shè)TA 適配體作為識(shí)別元件，RCA 引物作為RCA 的啟動(dòng)元件，在OTA 存在的特定環(huán)境中，適配體區(qū)域優(yōu)先與OTA 特異性結(jié)合，探針自身結(jié)構(gòu)被打開，RCA 引物區(qū)域與環(huán)狀DNA 模板（circu?lar DNA template，CT）堿基互補(bǔ)從而啟動(dòng)RCA，產(chǎn)生一條長的ssDNA，可以與SYBR Gold 結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)快速、無標(biāo)記、高靈敏性和強(qiáng)特異性的OTA 檢測，在食品安全檢測中具有良好的應(yīng)用前景。該傳感器為無化學(xué)標(biāo)記適配體生物傳感器的進(jìn)一步開發(fā)和探索提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OTA、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）：美國Sigma?Aldrich 公司；黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、MgCl2、1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、吐溫?20：生工生物工程（上海）股份有限公司；嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）、三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽[Tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris?HCl]：山東源野生物科技有限公司；T4 多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）緩沖液、T4 DNA 連接酶、T4 PNK、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine?triphos?phate，ATP）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy?ribonucleo?side triphosphates，dNTPs）、10×RCA 反應(yīng)緩沖液、phi29 DNA 聚合酶（phi29 DNA polymerase，phi29 DP）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）：新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室；SYBR Gold：美國賽默飛世爾科技公司；黑色96 孔板：北京蘭杰柯科技有限公司；可拆卸式96 孔板：美國康寧公司。以上所有試劑均為分析純。稻谷：市售。

不同長度的探針、環(huán)狀模板和連接模板的序列見表1。探針3′端包含不同長度的線性RCA 引物，用于與CT 的堿基互補(bǔ)配對(duì)，5′端具有固定堿基（nucleo?tide，nt），能特異性識(shí)別OTA 的適配體。

表1 不同長度的探針、環(huán)狀模板和連接模板的序列Table 1 Sequences of probes with different lengths，circular tem?plate，and ligation template

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（GENESYS 10S）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Multiskan FC）：美國賽默飛世爾科技公司；凝膠成像儀（Tanon MINI SPACE 2000）：合肥吉象生物技術(shù)有限公司；全波長多功能酶標(biāo)儀（Varioskan Flash）：繼圣（上海）醫(yī)療器械有限公司；手提紫外分析儀（ZF?5）：上海嘉鵬科技有限公司；電泳儀（DYY?6C）：北京六一生物科技有限公司；干式恒溫器（MK2000?2E）：杭州奧盛儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H1?16KR）：湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CT 的制備

將1.5 nmol/L 的ssDNA 與20 U T4 PNK、1 mmol/L ATP 和1×T4 PNK 緩沖液在37 ℃下孵育40 min，然后將孵育后的混合物在95 ℃下加熱5 min 進(jìn)行滅酶。將上述反應(yīng)混合物與2μL 的100μmol/L DNA 模板（DNA template，LT）混合后將混合物在90 ℃下加熱3 min，在室溫下冷卻15 min。加入40 μL 10×T4 DNA 連接酶緩沖液（400 mmol/L Tris?HCl，100 mmol/L MgCl2，100 mmol/L DTT，5 mmol/L ATP，25 ℃，pH7.8）和2 μL T4 DNA 連接酶（5 U/μL），在室溫下孵育反應(yīng)2 h，在90 ℃下加熱5 min 使連接酶失活。用無水乙醇在?40 ℃下沉淀CT 并通過12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，dPAGE）對(duì)CT 進(jìn)行濃縮純化，最后采用紫外分光光度計(jì)測定純化后CT 的吸光度A260并計(jì)算得出其濃度。CT 的計(jì)算公式如下。

式中：C為CT 的純化濃度，mmol/L；A260為CT 在吸收波長260 nm 處的吸光度；MW為CT 的分子量，μg/μmol；c為在1 mL、1 cm 光程標(biāo)準(zhǔn)比色皿中，260 nm 波長下吸光度為1 的寡核苷酸單鏈溶液的核酸濃度，33μg/mL。

1.3.2 OTA 的檢測方法

將3μL 400 nmol/L 探針和2μL 400 nmol/L CT 與2.5 μL 不同濃度的OTA 在7.5 μL 1×結(jié)合緩沖液[1×PBS（pH7.2）、1 mmol/L MgCl2和0.05%吐溫?20]中室溫孵育30 min。加入2 μL dNTPs、2 μL 10×RCA 反應(yīng)緩沖液和0.2μL phi29 DP 啟動(dòng)RCA 反應(yīng)。RCA 擴(kuò)增反應(yīng)在30 ℃下進(jìn)行30 min，在95 ℃下加熱15 min 進(jìn)行滅酶。將所得產(chǎn)物加入70μL 1×結(jié)合緩沖液和10μL 10×SYBR Gold 混合液中，測量熒光強(qiáng)度（λex/λem=498/540 nm）。對(duì)照組除未添加靶標(biāo)外，其余反應(yīng)步驟相同。OTA 的熒光信號(hào)強(qiáng)度百分比計(jì)算公式如下。

式中：W為相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比，%；F1為有靶標(biāo)樣品的熒光強(qiáng)度；F2為無靶標(biāo)樣品的熒光強(qiáng)度。

1.3.3 探針長度優(yōu)化

探針由36 nt 的適配體區(qū)域與不同長度的RCA 引物區(qū)域共同組成，其長度會(huì)影響適配體區(qū)域?qū)Π袠?biāo)的特異性識(shí)別。分別將3 μL 400 nmol/L 不同長度的探針（探針1、探針2、探針3、探針4 和探針5）與2.5μL 50 nmol/L OTA 和2 μL 400 nmol/L CT 混合，在7.5 μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2相同，選擇相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比最大的探針作為檢測方法的探針。

1.3.4 探針濃度優(yōu)化

探針濃度的高低會(huì)影響檢測方法的靈敏性，合適的探針濃度有利于OTA 適配體對(duì)靶標(biāo)的特異性識(shí)別，產(chǎn)生更強(qiáng)熒光信號(hào)。稀釋探針1（36+8 nt）濃度為0、400、600、800、1 000 nmol/L，分別將3 μL 不同濃度的探針1 與2.5μL 50 nmol/L OTA 和2μL 400 nmol/L CT混合，在7.5μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2 相同，選擇相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比最大的探針濃度作為檢測方法的探針濃度。

1.3.5 孵育時(shí)間優(yōu)化

將3μL 400 nmol/L 探針1 和2μL 400 nmol/L CT與2.5μL 50 nmol/L OTA 在7.5μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育不同時(shí)間（0、15、30、45、60 min）。余下步驟與1.3.2 相同，選擇相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比最大的孵育時(shí)間作為檢測方法的孵育時(shí)間。

1.3.6 RCA 時(shí)間優(yōu)化

RCA 時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)值不明顯，時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物鏈過多，容易增加空間位阻不利于產(chǎn)物鏈與核酸染料的結(jié)合。將RCA 時(shí)間分別設(shè)定為15、30、45、60、120 min，將3μL 400 nmol/L 探針1 和2μL 400 nmol/L CT 與2.5μL 50 nmol/L OTA 在7.5μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2 相同，RCA 反應(yīng)不同時(shí)間，測定熒光值，選擇相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比最大的RCA 時(shí)間作為檢測方法的RCA 反應(yīng)時(shí)間。

1.3.7 靈敏性驗(yàn)證

將2.5μL 不同濃度的OTA（6.6×10-4～660 nmol/L）與3 μL 400 nmol/L 探針和2 μL 400 nmol/L CT 混合，在7.5 μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2 相同。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，確定線性方程、檢測限度和線性范圍。

1.3.8 特異性驗(yàn)證

在上述參數(shù)優(yōu)化條件下，對(duì)常見真菌毒素DON、AFB1和ZEN 進(jìn)行檢測，驗(yàn)證OTA 適配體的特異性。將3μL 400 nmol/L 探針1 和2μL 400 nmol/L CT 與2.5μL 100 nmol/L 不同真菌毒素（OTA、ZEM、DON、AFB1）在7.5μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2 相同，比較檢測不同真菌毒素的相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比，確定該無標(biāo)記適配體生物傳感器的特異性。

1.3.9 實(shí)際樣品檢測

在檢驗(yàn)熒光無標(biāo)記適配體生物傳感器的準(zhǔn)確性之前，對(duì)市售稻谷樣品進(jìn)行預(yù)處理。稱取2 g 稻谷樣品并使用粉碎機(jī)粉碎至粉末狀即可，加入5 mL 的80%甲醇，在1 500 r/min 下振蕩1 h，之后在5 000 r/min 下離心8 min。移取450μL 上清液于1.5 mL 離心管中，將OTA 加入到用1×結(jié)合緩沖液稀釋20 倍的樣品溶液中使其濃度為0.5、50 nmol/L，振蕩2 h 完全混勻。通過1.3.2 無標(biāo)記適配體檢測方法和1.3.7 確定的線性方程對(duì)OTA 進(jìn)行定量檢測分析，驗(yàn)證無標(biāo)記適配體傳感器的實(shí)用性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）；采用Excel、IBM SPSS Statistics 20 和Origin 2021 等軟件處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

OTA 檢測的適配體傳感原理如圖1所示。

圖1 熒光適配體生物傳感器原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the working principle of the fluorescent aptamer biosensor

由圖1 可知，基于由OTA 適配體與RCA 引物兩部分組成的雙功能探針、RCA 擴(kuò)增和SYBR Gold 核酸染料，設(shè)計(jì)一種熒光無標(biāo)記適配體生物傳感器。探針5’端適配體區(qū)域與靶標(biāo)特異性結(jié)合，3’端引物區(qū)域可與CT 堿基互補(bǔ)。在OTA 存在的結(jié)合緩沖液環(huán)境中，適配體區(qū)域優(yōu)先與靶標(biāo)結(jié)合，探針自身結(jié)構(gòu)被打開，RCA 引物區(qū)域可以自由地與CT 結(jié)合，由phi29 DP 啟動(dòng)RCA。隨著RCA 的進(jìn)行，產(chǎn)生了一個(gè)長的ssDNA反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以與核酸染料SYBR Gold 結(jié)合，產(chǎn)生高熒光值信號(hào)。在沒有OTA 的情況下，RCA 引物與OTA 適配體雜交從而使RCA 反應(yīng)受到抑制，熒光值信號(hào)降低。因此，通過檢測有無靶標(biāo)的熒光信號(hào)的變化，可以達(dá)到快速檢測OTA 的目的。

2.2 探針長度的優(yōu)化

不同長度引物檢測的相對(duì)熒光強(qiáng)度見圖2。

圖2 不同長度引物檢測的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.2 Effect of primer length on the relative fluorescence intensity

探針由固定堿基的OTA 適配體區(qū)域與不同長度的RCA 引物區(qū)域共同組成，引物區(qū)域作為RCA 反應(yīng)的啟動(dòng)元件，與該熒光適配體生物傳感器的信號(hào)輸出密切相關(guān)。從圖2 可以看出，隨著引物長度的增加，引物與適配體之間的相互作用增加，增加了適配體與靶標(biāo)之間的競爭效應(yīng)。此外，引物長度越長，沒有靶標(biāo)的背景熒光信號(hào)越強(qiáng)，相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比整體隨著引物長度的增加而逐漸降低。因此選擇8 nt 引物的探針1 長度（36+8 nt）作為最佳探針長度。

2.3 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了提升該適配體傳感器檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性，同時(shí)盡可能縮短檢測所需時(shí)間，需要對(duì)1.3.2 步驟中的試驗(yàn)條件（包括探針濃度、孵育時(shí)間和RCA 時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，從而得到較為理想的OTA 適配體檢測傳感器，具體優(yōu)化結(jié)果見圖3～圖5。

圖3 探針濃度Fig.3 Concentration of probe

雙功能探針5′端的OTA 適配體可以與靶標(biāo)特異性結(jié)合，并且3′端的RCA 引物區(qū)域與CT 堿基互補(bǔ)配對(duì)會(huì)直接影響RCA 的反應(yīng)效率，因此需要優(yōu)化探針的濃度。如圖3所示，隨著探針濃度的增加，相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比逐漸增加，在600 nmol/L 時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)探針濃度超過600 nmol/L 時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比緩慢下降。說明較低的探針濃度有利于RCA 產(chǎn)物的形成，過高的探針濃度使RCA 反應(yīng)的產(chǎn)物鏈發(fā)生纏繞，空間位阻增加，RCA 產(chǎn)物與核酸染料的結(jié)合無效，導(dǎo)致靈敏性降低。因此，優(yōu)化后的探針濃度選擇為600 nmol/L。

由于不同孵育時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致靶標(biāo)與探針特異性結(jié)合的量有差距，因此需要優(yōu)化孵育時(shí)間。如圖4所示，隨著孵育時(shí)間的延長，相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比逐漸增加，30 min 后趨于穩(wěn)定。因此，確定30 min 為最佳孵育時(shí)間。

圖4 探針孵育時(shí)間Fig.4 Incubation time of probe

如圖5所示，在15～30 min，相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比明顯增加，在30 min 之后，相對(duì)熒光強(qiáng)度百分比降低。這可能是因?yàn)镽CA 反應(yīng)產(chǎn)物的增加導(dǎo)致在30 min 內(nèi)與核酸染料結(jié)合更多，導(dǎo)致熒光信號(hào)增強(qiáng)，而由于RCA 時(shí)間高于30 min，RCA 產(chǎn)物鏈過長，空間位阻增大，不利于與核酸染料結(jié)合導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱，因此，RCA 最適時(shí)間為30 min。

圖5 RCA 時(shí)間Fig.5 Rolling circle amplification（RCA）time

2.4 OTA 檢測的靈敏性分析

在優(yōu)化條件下，通過檢測不同濃度的OTA，驗(yàn)證基于雙功能探針和RCA 擴(kuò)增信號(hào)放大方法的熒光適配體生物傳感器的靈敏性，結(jié)果見圖6。

圖6 加入不同濃度的OTA 后的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.6 Relative fluorescence intensity after addition of different concentrations of ochratoxin A（OTA）

從圖6 可以看出，相對(duì)熒光強(qiáng)度信號(hào)增強(qiáng)與OTA濃度密切相關(guān)，說明其具有較好的信號(hào)傳感機(jī)制，并且當(dāng)OTA 濃度從6.6×10-2nmol/L 變化到660 nmol/L 時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度信號(hào)逐漸增強(qiáng)，與OTA 濃度呈線性相關(guān)。線性方程為y=5.722 58x+28.085 95（R2=0.995），檢測限度為6.6×10-2nmol/L。表2 總結(jié)了其他熒光檢測法的檢測限度和線性范圍。

表2 不同適配體傳感器對(duì)OTA 的檢測分析性能的比較Table 2 Comparison on analytical performance among different aptamer sensors for OTA detection

由表2 可知，本研究的適配體生物傳感器具有更好的靈敏性。

2.5 OTA 檢測的特異性

為研究探針是否能特異性檢測OTA，按照1.3.8 所提出的檢測方法對(duì)其他一些真菌毒素（AFB1、ZEN、DON）進(jìn)行檢測。測試不同真菌毒素在相同濃度（100 nmol/L）下的檢測情況，結(jié)果如圖7所示。

圖7 檢測各種真菌毒素的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.7 Relative fluorescence intensity of mycotoxins

由圖7 可知，OTA 適配體很難識(shí)別非特異性靶標(biāo)，因此探針處于雜交狀態(tài)，RCA 引物區(qū)域不能自由地與CT 結(jié)合并啟動(dòng)RCA 反應(yīng)。以上結(jié)果表明，用于OTA 檢測的熒光無標(biāo)記適配體生物傳感器具有合理的特異性，足以供實(shí)際應(yīng)用。

2.6 在稻谷樣品中的檢測應(yīng)用

為了研究所開發(fā)的OTA 適配體生物傳感器在實(shí)際樣品中的檢測性能，按照1.3.9 步驟對(duì)市售的稻谷樣品處理后進(jìn)行OTA 檢測，結(jié)果見表3。

表3 稻谷樣品中OTA 的檢測Table 3 Detection of OTA in paddy samples

如表3所示，在實(shí)際稻谷樣品溶液中，0.5 nmol/L OTA 的回收率約為84%，50 nmol/L OTA 的回收率約為84%（回收率用OTA 檢測值/OTA 添加值表示）。上述結(jié)果表明，該檢測方法準(zhǔn)確，適用于實(shí)際的稻谷樣品檢測分析。

3 結(jié)論

本研究中雙功能探針由RCA 引物與OTA 適配體兩部分組成，在OTA 存在的環(huán)境中，雙功能探針中適配體區(qū)域優(yōu)先與靶標(biāo)特異性結(jié)合，探針自身結(jié)構(gòu)被打開，引物區(qū)域可以自由地與CT 堿基互補(bǔ)啟動(dòng)RCA，產(chǎn)物鏈可以與核酸染料SYBR Gold 結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，建立基于靶標(biāo)誘導(dǎo)RCA 放大熒光信號(hào)的一種無標(biāo)記適配體快速檢測OTA 的生物傳感器。結(jié)果顯示，該生物傳感器具有較高的特異性，檢測限低至6.6×10-2nmol/L，線性動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍寬至4 個(gè)數(shù)量級(jí)，且成功應(yīng)用于稻谷樣品的分析檢測。該生物傳感器無需復(fù)雜化學(xué)標(biāo)記、操作簡單、成本低，為食品安全現(xiàn)場快速檢測提供參考。